人铜锌超氧化物歧化酶真核表达载体的构建及在酿酒酵母中的分泌表达

目的:探讨酿酒酵母中人铜锌超氧化物歧化酶(hCu/Zn-SOD)的分泌表达.方法:采用RT-PCR技术从人胃总RNA中分离扩增hCu/Zn-SOD的cDNA,与酿酒酵母交配因子(MF)α信号肽编码序列融合,将融合基因插人大肠杆菌-酵母细胞穿梭型质粒pYES2.0,构建真核分泌表达质粒pYES-MS,将其转化入酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl中,用半乳糖进行诱导表达,采用SDS-PAGE、蛋白质免疫印迹分析及电泳谱活性染色测定表达产物分泌情况及其活性.结果:该工程菌可高效表达一相对分子质量约为21 000的蛋白并与兔抗人Cu/Zn-SOD多抗有特异的免疫反应,同时在培养基上清中检测到此表达蛋白的分泌,具有特异性SOD酶活性.结论:作者成功构建了pYES-MS/INV菌株,该菌株大量表达有天然酶活性的hCu/Zn-SOD,并有部分hCu/Zn-SOD分泌到酵母细胞外,为开发hCu/Zn-SOD的基因工程产品奠定了良好的基础.     

重组人铜锌超氧化物歧化酶在大肠杆菌中的表达研究

目的:构建人铜锌超氧化物歧化酶(h Cu,Zn-SOD)原核表达载体并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白,为其临床应用奠定基础。方法:根据已报道的h Cu,Zn-SOD基因序列,采用RT-PCR技术从外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中获得SOD c DNA序列。将所得的PCR产物插入原核表达载体p ET22b(+)中,重组质粒经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将其转化至大肠杆菌Rosseta(DE3),通过异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside,IPTG)诱导表达出目的蛋白,经镍固定金属亲和层析纯化。采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD生物学活性。结果:序列分析表明SOD基因成熟肽编码区含有465 bp与Gen Bank(X02317)中已报道序列一致的SOD核苷酸。经IPTG诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析显示表达的目的蛋白分子量约为19 k D,免疫印迹分析显示其与商品化的His-tag抗体呈特异性反应,但主要以包涵体形式表达,可溶性蛋白表达量很少。经Ni2+-NTA琼脂糖纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带。可溶蛋白酶活力为460 U/ml(SOD的酶比活力为630 U/mg)。结论:在大肠杆菌中获得了人源SOD的高效表达,为研究其生物学功能及广泛应用奠定了基础。     

人肌红蛋白原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的：构建人肌红蛋白（Mb）原核表达载体并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白pQE。方法：根据已报道的人Mb基因序列,采用RT-PCR技术从人骨骼肌组织中获得肌红蛋白cDNA序列。将所得的PCR产物插入克隆载体pGEM-Teasy中,得重组质粒,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将酶切目的片段插入原核表达载体pQpQEE30中并转化大肠杆菌(E.coli)M15,通过IPTG诱 导表达出带有6个组氨酸的融合蛋白。经镍固定金属亲和层析纯化。结果：序列分析表明,人Mb基因成熟肽编码区含有465 bp,编码153个氨基酸;与GenBank(NM203378) 中已报道的Mb核苷酸序列有98.50 %同源性。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE 电泳和免疫印迹分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的31%,相对分子质量约为16 700,并与商品化的人Mb单抗呈特异性反应。经Ni²⁺-NTA agarose 纯化获得SDS-PAGE 电泳下单一条带。结论：在大肠杆菌中获得了人Mb的高效表达。     

带有蛋白标签的原核表达载体构建

目的：构建带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标签的ｐＴＣ０１Ｅ载体。方法：从噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中ＰＣＲ扩增出于Ｅ－ｔａｇ基因片段，经Ｋｌｅｎｏｗ片段补平和ＳａｃＩ消化后，将含有Ｅ－ｔａｇ序列的３８１ｂｐ片段克隆至分泌型原核表达载体ｐＴＣ０１的ＳａｃＩ－ＳａｍＩ位点中。结果：构建成带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标准签的ｐＴＣ０１Ｅ载体，限制性内切酶图谱和ＤＮＡ序列分析表明构建过程正确，结论：用ＰＣＲ－克隆策略获得了Ｄ     

重组IL-33融合表达载体的构建、蛋白表达及纯化

目的：构建人白介素-33（IL-33）硫氧还蛋白融合表达载体,高效表达IL-33蛋白。方法：采用RT-PCR从健康志愿者外周血单核细胞（PBMC）mRNA中扩增IL-33 cDNA;将扩增的IL-33目的基因与融合表达质粒pET102/D-TOPO连接,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化鉴定。结果：扩增的IL-33 cDNA大小为800bp左右。表达的IL-33融合蛋白大小为45kDa左右,Western blotting鉴定显示表达的蛋白正确,为IL-33目的蛋白。但表达的大部分蛋白为无生物学活性的包涵体,在后续对表达蛋白进行纯化的同时对蛋白进行了复性,得到了复性后具有生物学活性的IL-33蛋白。结论：成功制备了具有生物学活性的IL-33蛋白。     

重组人白细胞介素—3在大肠杆菌中表达及纯化研究

将化学合成的人白细胞介素－３（ｈＩＬ－３）基因与表达质粒ＰＫＫ２２３－３重组并转化大肠杆菌ＪＭ１０５，重组菌在摇瓶中发酵并诱导表达，表达产量达菌体蛋白质总量的５３％么上。发酵菌经超声破碎后得到包本，经洗涤处理使包含体纯度达９０％以上。     

人热休克蛋白72基因的克隆、原核表达与纯化

目的：克隆人热休克蛋白72（HSP72）基因，原核表达并纯化蛋白产物，以探讨其生物学功能。方法：从热休克的人肝癌细胞株SMMC－7721中，用RT－PCR方法扩增得到HSP72基因并克隆到原核表达载体pQE-30中，在大肠杆菌JM109中用IPTG诱导下表达的蛋白经FPLC梯度洗脱和SephacrylS200凝胶过滤纯化，经SDS－PAGE电泳后转印到NC膜上，用anti-HSP72单抗作探针，进行Western blot鉴定。结果：克隆的基因序列分析结果与有关报道一致，所构建的pQTE-30HSP72载体 大肠杆菌中表达出与预大小相符的Mr为72000的蛋白，经鉴定确系HSP72蛋白。结论：克隆了人HSP72基因，并对该基因进行了原核表达与纯化，为进一步研究其生物学功能奠定了良好基础。     

人DC-SIGN的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化和鉴定

目的:获得纯化的DC-SIGN蛋白,为揭示DC-SIGN参与抗原提呈的机制,探讨宿主细胞DC-SIGN蛋白和HIV、HCV、结核杆菌等病原体的相互作用机制奠定基础。方法:人DC-SIGN的cDNA克隆到pGEX-KG表达载体上,转化入E.coli中,通过IPTG诱导,过度表达GST-DC-SIGN融合蛋白,并使用Glutathione-Sepharose 4B亲和层析柱提取得到纯化的DC-SIGN蛋白,最后通过SDS-PAGE和Western Blot方法进行检测和鉴定。结果:酶切鉴定证实DC-SIGN基因已插入原核表达载体pGEX-KG。重组表达质粒pGEX-KG-DC-SIGN在大肠杆菌BL21中成功表达了DC-SIGN融合蛋白,其分子质量约为44 kU。结论:成功构建DC-SIGN原核表达重组质粒,并提取纯化出DC-SIGN原核蛋白,为下一步研究DC-SIGN的功能奠定了基础。     

液相色谱法纯化牛血铜-锌超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)广泛存在于生物体内,是一种新型的酶制剂,在抗衰老、抗肿瘤、防辐射以及自身免疫性疾病的治疗等方面具有广阔的应用前景,已受到生化界和医药界的极大关注。目前国内有不少单位开发该产品,但酶的比活一般在 3 000～12 000 U/mg蛋白。我们从牛血红细胞中提取SOD粗品,分别用常压和高效液相色谱(HPLC)纯化,得到了较高纯度的CU-Zn SOD,为SOD的基础研究及临床应用提供物质基础和纯化方法。     

人HCCR蛋白表达载体的构建、表达及其蛋白纯化

目的:构建人HCCR蛋白表达载体,并探讨其体外表达及表达产物的纯化。方法:培养人肝癌细胞,提取总RNA,反转录合成cDNA第一链,以此cDNA为模板经PCR合成插入片段,连接至载体pMBP-C,转化到大肠杆菌Top10F′中,进行诱导表达。表达产物通过Ni-NTA螯合层析进行纯化。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,Westernblot和电喷雾电离串联飞行时间质谱(ESI-TOFMS)鉴定表达产物。结果:构建的表达载体经限制性内切酶酶切分析和DNA测序,证明所构建的质粒含有HCCR基因。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳发现该重组质粒经IPTG诱导后表达一种新的蛋白,这种蛋白不存在于诱导后的空载体表达产物中,表达产物经Westernblot和蛋白质谱鉴定含有HCCR蛋白的部分肽段。结论:成功构建了HCCR蛋白表达载体并进行体外表达及纯化。     

NP9蛋白的原核表达及纯化

目的构建表达人NP9融合蛋白的重组体并进行融合蛋白的原核表达及NP9蛋白的分离和纯化。方法通过聚合酶链反应（PCR）得到NP9基因的编码区序列，克隆到原核表达载体pGEX-6P-3上构建重组NP9原核表达质粒。转化大肠杆菌后通过SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定融合蛋白表达。使用GSTFF层析柱分离纯化NP9蛋白。结果得到序列正确的NP9基因及重组原核表达质粒pGEX-6P-3-Np9，SDS-PAGE电泳和Western blotting证实重组质粒能够在大肠杆菌内受IPTG诱导表达，层析分离得到分子量为大约14kDa单一的NP9蛋白。结论成功构建了表达NP9融合蛋白的原核表达载体，该栽体能在细菌内表达出GST—NP9融合蛋白．有效分离得到NP9蛋白．     

pPRMETb-TRAIL原核表达载体的构建和表达及纯化

目的：为获取较高纯度的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF－related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）工程蛋白。方法：将TRAIL基因构建于原核表达载体pPRMETb中，在大肠杆菌中由异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，对包涵体进行洗涤、尿素裂解、复性后过镍柱层析纯化。结果：经酶切、测序鉴定证实pPRMETb-TRAIL构建安全正确，在大肠杆菌xl1-blue中经IPTG诱导表达量较高，包涵体经尿素裂解后行镍柱纯化得到了较高纯度的TRAIL蛋白。结论：成功地建立了获取高纯度TRAIL工程蛋白的技术路线。     

ABH1融合蛋白表达载体的构建及表达纯化

目的：构建ABH1重组蛋白原核表达载体及建立ABH1蛋白纯化技术。方法：应用PCR技术从人的cDNA文库扩增出ABH1基因片段,并加入限制性内切酶位点和终止子,进而将其插入到原核表达质粒pET-15b中,构建ABH1/15b原核表达克隆,最后用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,用镍柱亲和纯化,离子交换层...     

人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定。选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm。经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm。结果重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别。结论成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm。大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础。     

人β-微管蛋白2C蛋白的原核表达与纯化

目的构建体外原核表达和纯化人β-微管蛋白2C(TubB2C)蛋白。方法通过聚合酶链反应(PCR)扩增出人TubB2C基因完整开放读码框架(ORF),并插入pGEX-6P-1载体中构建pGEX-TubB2C重组质粒。经大肠杆菌BL21转化后,用异丙醇-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导谷胱甘肽S转移酶(GST)-TubB2C融合蛋白表达,用免疫印迹(W estern b lot)分析鉴定表达的GST-TubB2C蛋白,并在非变性条件下利用G lutath ione Sepharose 4B纯化GST-TubB2C蛋白。结果酶切分析和DNA测序表明TubB2C cDNA完整ORF以正确的阅读框架插入pGEX-6P-1载体;聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示表达的GST-TubB2C蛋白相对分子量约为78 000,W estern b lot结果显示该融合蛋白可被抗GST抗体特异性识别。纯化后的GST-TubB2C蛋白纯度约90%。结论TubB2C蛋白可在体外大量表达和纯化。     

人乳腺珠蛋白基因亚型的原核表达及纯化

目的：克隆人乳珠蛋白（hMAM）编码全长cDNA，原核表达并纯化蛋白产物，为后期研制乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础。方法：自乳腺癌组织及乳腺癌细胞株MD-MB453提取总RNA，通过RT-PCR克隆hMAMcD-NA，构建pQF40-hMAM表达质粒，在大肠杆菌M15中表达，利用镍．亚硝胺乙酸组氨酸（Ni-NTA-His）亲和层析法对重组蛋白进行纯化。结果：乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中发现两种hMAM cDNA亚型，即hMAM和hMAM（Isoform），长度分别为279和270bp，两者相差9个连续碱基，其翻译产物相差3个连续氨基酸残基；表达的融合蛋白以不溶性包涵体形式存在，纯化后得到纯度为97％的目的蛋白。结论：获得hMAM cDNA并发现一个新的hMAM突变体；融合蛋白的表达及纯化成功。     

人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的 构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白.方法 利用限制性内切酶EcoR I和Sal I将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定.选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm.经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误.在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别.结论 成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm.大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础.     

rhTL1A基因原核表达载体的构建、表达与纯化

目的：构建人肿瘤坏死因子样分子1A（TL1A）原核表达质粒并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白。方法：人HUVECs总RNA经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增TL1A基因,克隆到pTA2载体,酶切和测序鉴定正确后构建重组原核表达质粒pQE-TL1A,并转化大肠杆菌M15［pREP4］。IPTG诱导目的蛋白表达并进行Western blotting鉴定;镍离子亲和层析柱(Ni²⁺-NTA)纯化靶蛋白。结果：目的基因经酶切其结果与预期相符,测序结果显示目的基因与GenBank登录的序列(登录号AF520785)完全一致;工程化大肠杆菌M15［pREP4］经IPTG诱导表达相对分子质量约22 000的目的蛋白;Western blotting鉴定结果显示,重组蛋白能够与抗His单克隆抗体特异性结合。结论：成功地构建了重组原核表达质粒pQE-Tl1A,并纯化获得高纯度重组TL1A蛋白。     

PTI-1表达载体构建及在大肠杆菌中的高效表达和纯化

目的：构建表达人前列腺癌诱导基因1（PTI－1）蛋白的重组质粒，在大肠杆菌中诱导高效表达并纯化。方法：应用亚克隆PTI－1基因的pUC19/PTI-1质粒，重新构建表达载体PTI－1／pGEX4T-1，酶谱分析鉴定出正确的重组质粒，诱导表达，进行SDS－PAGE分析，应用GSH树脂纯化表达产物。结果：筛选出5个与pGEX4T-1正向重组质粒，其中一株表达一个Mr为69000的新蛋白，并以包涵体的形式存在，蛋白在宿主菌中高效表达，表达量为43．2％，纯化蛋白得到纯度为79．72％的GST／PTI－1融合表达高效表达及纯化的成功使简便获得前列腺癌诱导蛋白成为可能。     

人可溶性TRAIL原核表达载体的构建和蛋白表达、纯化及活性鉴定

目的建立高效表达可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）蛋白的原核表达载体,获得高生物学活性的TRAIL蛋白。方法取健康人外周血提取总RNA,RT-PCR扩增TRAIL基因的胞外区片段,克隆入原核表达载体pET30a中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆。重组载体转化感受态细胞BL21,优化蛋白表达条件;亲和层析法纯化重组蛋白;SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot鉴定。重组蛋白与TRAIL蛋白标准品分别作用Huh-7细胞,CCK8、流式细胞术检测蛋白生物学作用。结果 DNA测序结果证实成功构建重组质粒pET30a/TRAIL,SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot显示pET30a/TRAIL诱导的为可溶性的His-rTRAIL。CCK8、流式细胞术检测结果显示,与TRAIL蛋白标准品相比,His-rTRAIL对Huh-7细胞具有良好的促凋亡作用。结论成功构建高效表达可溶性TRAIL蛋白的原核表达载体pET30a/TRAIL,表达的可溶性蛋白His-rTRAIL具有高度的生物学作用,为肿瘤的生物学治疗提供新的实验依据。