重组人铜锌超氧化物歧化酶在大肠杆菌中的表达研究

目的:构建人铜锌超氧化物歧化酶(h Cu,Zn-SOD)原核表达载体并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白,为其临床应用奠定基础。方法:根据已报道的h Cu,Zn-SOD基因序列,采用RT-PCR技术从外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中获得SOD c DNA序列。将所得的PCR产物插入原核表达载体p ET22b(+)中,重组质粒经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将其转化至大肠杆菌Rosseta(DE3),通过异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside,IPTG)诱导表达出目的蛋白,经镍固定金属亲和层析纯化。采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD生物学活性。结果:序列分析表明SOD基因成熟肽编码区含有465 bp与Gen Bank(X02317)中已报道序列一致的SOD核苷酸。经IPTG诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析显示表达的目的蛋白分子量约为19 k D,免疫印迹分析显示其与商品化的His-tag抗体呈特异性反应,但主要以包涵体形式表达,可溶性蛋白表达量很少。经Ni2+-NTA琼脂糖纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带。可溶蛋白酶活力为460 U/ml(SOD的酶比活力为630 U/mg)。结论:在大肠杆菌中获得了人源SOD的高效表达,为研究其生物学功能及广泛应用奠定了基础。     

人肌红蛋白原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的：构建人肌红蛋白（Mb）原核表达载体并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白pQE。方法：根据已报道的人Mb基因序列,采用RT-PCR技术从人骨骼肌组织中获得肌红蛋白cDNA序列。将所得的PCR产物插入克隆载体pGEM-Teasy中,得重组质粒,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将酶切目的片段插入原核表达载体pQpQEE30中并转化大肠杆菌(E.coli)M15,通过IPTG诱 导表达出带有6个组氨酸的融合蛋白。经镍固定金属亲和层析纯化。结果：序列分析表明,人Mb基因成熟肽编码区含有465 bp,编码153个氨基酸;与GenBank(NM203378) 中已报道的Mb核苷酸序列有98.50 %同源性。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE 电泳和免疫印迹分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的31%,相对分子质量约为16 700,并与商品化的人Mb单抗呈特异性反应。经Ni²⁺-NTA agarose 纯化获得SDS-PAGE 电泳下单一条带。结论：在大肠杆菌中获得了人Mb的高效表达。     

携带跨膜信号的凋亡蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的构建携带跨膜信号序列的凋亡蛋白（apoptin）的原核表达载体PET-28a（＋）-apoptin,诱导表达并纯化重组apoptin蛋白,制备多克隆抗体。方法用多重PCR的方法扩增跨膜信号序列（PTD）及apoptin的编码序列,构建原核表达载体PET-28a（＋）-PTD-apoptin,转化大肠杆菌BL21（DE3）,低温条件下IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法鉴定蛋白表达,经镍亲和层析方法纯化目的蛋白后,免疫BALB／c小鼠,制备多克隆抗体。结果DNA测序鉴定表明成功构建了原核表达载体PET-28a（＋）-PTD-apoptin,该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经低温和IPTG诱导后,获得重组apoptin蛋白,制备的多克隆抗体经ELISA方法和免疫印迹法证实能特异性地识别apoptin。结论成功获得了携带跨膜信号序列的重组蛋白apoptin及其多克隆抗体,为进一步研究其特异性诱导肿瘤细胞凋亡功能及相关机制奠定了基础。     

hCu,Zn-SOD-TAT PTD融合基因的构建和表达

目的构建人hCu,Zn-SOD-TAT PTD表达载体及其原核表达与表达产物的纯化.方法从人肺cDNA文库中PCR扩增hCu,Zn-SOD基因,插入pUC19测序;以测序质粒为模板,再用含TAT PTD编码序列的3′引物PCR扩增得hCu,Zn-SOD-TAT PTD融合基因,并插入pUC19.将SOD-TAT PTD融合基因克隆至温控表达载体pJW 2,转化大肠杆菌DH 5α.温度诱导表达,表达产物用离子交换层析法初步纯化. 结果经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定表明所构建质粒与设计相同,hCu,Zn-SOD-TAT PTD融合蛋白在转化大肠杆菌获得了高效表达并纯化.结论成功地获得了hCu,Zn-SOD-TAT PTD融合基因的表达产物,为进一步研究及临床应用奠定了基础.     

胱抑素C原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的：构建胱抑素C（cystatin C,Cys-C）原核表达载体并表达、纯化、鉴定目的蛋白。方法根据GeneBank报道的Cys-C基因序列,采用RT-PCR技术从人胚肾细胞系HEK293中获得Cys-C的cDNA序列,经PCR、酶切及测序确认最终获得重组载体pET-30a（＋）-CysC,转化大肠埃希菌Rosetta,通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalac-topyranoside,IPTG）诱导表达、经镍柱亲和层析法纯化获得Cys-C融合蛋白。结果序列分析表明,人Cys-C基因成熟肽编码区编码122个氨基酸;与GeneBank（NM-000099.2）中已报道的序列有100%的同源性。经IPTG诱导表达, SDS-PAGE电泳和ELISA分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20%,重组蛋白相对分子质量约为20000,经Ni2＋-NTA agarose纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带并与商品化的人Cys-C单抗呈特异性反应。结论在大肠埃希菌中获得了Cys-C的表达,并经镍柱亲和层析得到较纯的胱抑素。     

人肿瘤抗原基因Delta-like4(DLL4)可溶性表达、纯化及鉴定

目的研究克隆肿瘤抗原人DLL4基因,与原核表达载体可溶性融合表达、分离纯化及其鉴定,并计划将其应用于DLL4特异性肺癌肿瘤疫苗研究过程中的抗血清滴度检测.方法采用PCR方法扩增DLL4多核苷酸序列,克隆入pMD-18T载体.测序正确后,将其亚克隆入pGEX-KG原核表达载体,获得pGEX-KG-hDLL4载体.以该载体转化E.coli菌株BL21(DE3),IPTG诱导其表达,裂解大肠杆菌,以GSTrap亲和层析柱纯化目的蛋白,采用SDS-PAGE电泳,Western Blot方法鉴定目的蛋白的表达.结果 PCR扩增获得了hDLL4基因片段,经测序证实与GenBank公布的序列一致,重组的质粒经过PCR、酶切鉴定,证明重组质粒中已成功的插入了目的基因hDLL4.成功构建了该蛋白的原核表达载体pGEX-KG-hDLL4.结论融合蛋白GST-hDLL4在25℃,IPTG终浓度0.5 mmol/L条件下诱导表达,以GSTrap亲和层析柱纯化,获得纯化融合蛋白.采用SDS-PAGE,Western Blot的方法可检测到目的可溶性融合蛋白GST-hDLL4的表达.     

白细胞介素31在E.coli中的表达及活性鉴定

目的构建人IL-31原核表达载体，在大肠杆菌中表达，研究人IL-31对人表皮角化细胞分泌趋化因子MIP-3β的活性影响。方法大量培养pET28a（＋）-hIL-31工程菌株，提取质粒，BamHI、HindⅢ双酶切，并将其连接到原核表达载体pET32a（＋），通过IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中表达。用RT-PCR检测该目的蛋白对人表皮角化细胞HaCaT表达趋化因子MIP-3β的影响。结果原核表达质粒pET32a（＋）-hIL-31构建正确，经双酶切、PCR和序列测定鉴定，序列正确，IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中大量表达，纯化后的目的蛋白可刺激人表皮角化细胞表达MIP-3β。结论原核表达质粒pET32a（＋）-hIL-31构建正确，纯化后的蛋白具有生物学活性，可刺激人表皮角化细胞表达趋化因子MIP-3β，为研究人IL-31的作用及其作用机制和制备单克隆抗体奠定了基础。     

ING4的原核表达及多克隆抗体的制备

目的在原核系统中表达并纯化ING4蛋白，制备多克隆抗体。方法构建表达载体pET-21a（＋）-ING4，转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳检测。结果构建的表达载体pET-21a（＋）-hGDNF经酶切、PCR鉴定均出现750bp左右的条带，测序结果正确，用IPTG诱导转化菌有30KD大小的目的条带，表达的目的蛋白占菌体总蛋白10％以上，以包涵体形式存在，纯化后其纯度可达70％以上。用纯化的ING4蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结论制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。     

嗜肺军团菌momp原核重组质粒的构建和表达

目的构建嗜肺军团菌momp原核重组质粒,并纯化重组蛋白。方法以嗜肺军团菌LP1型DNA为模板,PCR扩增得到momp基因,定向克隆至原核载体PET32a（＋）中,经酶切及测序鉴定正确后,转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导并用SDS-PAGE电泳进行分析,其产物用亲和层析法进行纯化。结果扩增出831bp的momp基因,构建重组质粒pET-momp,诱导表达及纯化出50KD的蛋白。结论成功构建momp基因的原核表达载体并得到高效表达。     

人血管内皮生长因子A(VEGFA)的原核载体构建、蛋白表达及鉴定

目的 克隆人VEGFA基因,与原核载体融合表达、纯化及其鉴定,并将其应用于肿瘤血管生长研究过程中.方法 采用PCR方法扩增人VEGFA序列,将其克隆入pGEX-KG原核载体,获得pGEX-KG-hVEGFA重组质粒.将该质粒转化入E.coli菌株BL21 (DE3),经IPTG诱导其表达,以GSTrap亲和层析柱纯化融合蛋白,采用SDS-PAGE电泳,Western Blot方法鉴定融合蛋白的表达.结果 PCR扩增获得了hVEGFA基因片段,经测序证实与GenBank公布的序列一致,重组的质粒载体经过PCR、酶切鉴定,证明重组质粒中已成功的插入了hVEGFA基因片段.成功构建了该蛋白的原核表达载体pGEX-KG-hVEGFA.结论 融合蛋白在IPTG终浓度为0.5 mmol/L、25℃条件下诱导表达,并获得纯化融合蛋白.采用Western Blot的方法可检测到目的融合蛋白GST-hVEGFA的表达.     

NP9蛋白的原核表达及纯化

目的构建表达人NP9融合蛋白的重组体并进行融合蛋白的原核表达及NP9蛋白的分离和纯化。方法通过聚合酶链反应（PCR）得到NP9基因的编码区序列，克隆到原核表达载体pGEX-6P-3上构建重组NP9原核表达质粒。转化大肠杆菌后通过SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定融合蛋白表达。使用GSTFF层析柱分离纯化NP9蛋白。结果得到序列正确的NP9基因及重组原核表达质粒pGEX-6P-3-Np9，SDS-PAGE电泳和Western blotting证实重组质粒能够在大肠杆菌内受IPTG诱导表达，层析分离得到分子量为大约14kDa单一的NP9蛋白。结论成功构建了表达NP9融合蛋白的原核表达载体，该栽体能在细菌内表达出GST—NP9融合蛋白．有效分离得到NP9蛋白．     

人抗黏病毒蛋白-MxA基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的克隆人抗黏病毒蛋白-MxA基因,构建其原核表达载体并进行表达、纯化、活性鉴定,为深入开展该蛋白功能的研究奠定基础。方法从IFN-β诱导的A549细胞系中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增出MxA全长cDNA,克隆于pUC119载体,酶切鉴定后并经测序证实序列正确,再克隆于pET-32a（＋）载体上构建表达载体pET-32a（＋）-MxA,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达并优化诱导条件,通过NTA-Agarose亲和层析和割胶电洗脱法获取纯化MxA蛋白,用SDS-PAGE电泳分析表达产物,并通过对病毒VSV的抑制作用鉴定其活性。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示RT-PCR扩增出两条片段,大小同预计片段相符,并经测序证实与公布的MxA基因序列一致;重组载体转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳初步鉴定,目的蛋白约占总菌体蛋白的25%,与预计的分子量91kd相一致。用NTA-Agarose亲和层析法可获得纯度〉95%的目的蛋白,割胶电洗脱回收法可获得纯度〉90%的目的蛋白。结论克隆了人抗黏病毒蛋白-MxA基因,克隆基因在大肠杆菌中获得了较高水平的表达,并通过两种方法获得了该蛋白的纯化物。     

人IκBα基因的克隆和原核表达

目的:构建人类IκBα基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,为研究IκBα基因的功能奠定基础。方法:从cDNA文库获取目的基因,经PCR扩增目的片段IκBα;利用分子克隆技术构建原核表达质粒;转化入大肠杆菌BL21(DE3),优化诱导表达条件,进行纯化,获得目的蛋白。结果:成功构建pET-28a-IκBα重组表达质粒;经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳显示:IκBα在pET-28a-IκBα表达载体中获得表达量较高的融合蛋白,主要以上清形式存在。结论:成功表达并纯化获得了高纯度的IκBα蛋白。     

小鼠周脂素基因的原核表达及纯化

目的构建小鼠周脂素（prilipin,Plin）原核表达载体,表达周脂素蛋白并进行初步纯化,为研究周脂素的功能奠定基础。方法通过酶切从pMD18-Plin重组载体上酶切下周脂素目的基因,定向插入原核表达载体pET-32a（＋）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果构建的pET-32a-Plin载体能够表达周脂素重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白的50%,经初步纯化后,纯度达95%以上。结论成功构建了周脂素原核表达载体,并在原核系统中表达了重组蛋白,纯化的蛋白纯度较高,可用于后续试验。     

小鼠β防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌作用的初步研究

目的构建小鼠β防御素3（mouse βdefensin3,mBD3）基因的原核表达载体pET-32a（＋）／mBD3,诱导mBD3融合蛋白在大肠杆菌中的表达,并融合蛋白的抗菌活性。方法运用PCR技术从质粒pcDNA3．1（＋）／mBD3中扩增mBD3基因片段,将该片段插入pET-32a（＋）原核表达载体,并对构建的重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定。将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami（2）,用畀丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE和WesternBlot鉴定融合蛋白。通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白,用微量液体稀释法测定融合蛋白鼠B防御素3（fmBD3）的抗菌活性。结果mBD3的原核表达载体PET-32a（＋）／mBD3构建成功,在大肠杆菌中表达出fmBD3并提取获得纯化的融合蛋白。fmBD3对单细胞真菌具有较好的抑制和杀灭作用,可抑制革兰阳性菌的生长,而对革兰阴性菌元作用。结论构建的原核表达载体在大肠杆菌中成功表达fmBD3,该融合蛋白显示出较强的杀真菌作用和一定的抗细菌作用,为进一步研究鼠防御素的抗微生物活性奠定了实验基础。     

TAT-SOD融合蛋白表达载体的构建

目的:构建pET28a-TAT-SOD原核表达载体,纯化并测定其活性。方法:PCR法扩增TAT-SOD片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT-SOD重组表达子,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导TAT-SOD融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE电泳鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白,利用SOD活性测定试剂盒测定其活性。结果:构建了高表达重组子pET28a-TAT-SOD,获得了相对分子质量约为25000的具有活性的融合蛋白TAT-SOD,纯度达90%。纯化的蛋白浓度为700mg/L,活性为197.54U/L。结论:成功构建了具有活性TAT-SOD融合蛋白的表达载体。     

融合蛋白ScFv（3G11）-mms13在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的：构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a（＋）-ScFv-mms13,在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载pET30a（＋）质粒,构建重组表达质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5ɑ中,利用PCR、酶切筛选鉴定重组菌株。用异丙基疏代半乳糖苷（ IPTG）诱导表达融合蛋白,通过改变IPTG浓度、诱导时间优化表达条件。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。结果重组质粒经PCR、酶切、测序证实重组质粒pET30a（＋）-ScFv-mms13构建成功。 SDS-PAGE电泳结果分析表明诱导菌株在43kDa左右处有明显异源蛋白表达,且确定了在IPTG终浓度为0．2mmol/L、诱导时间为6h时为表达稳定。对表达蛋白进行定位分析确定表达蛋白主要以包涵体形式存在,部分存在于可溶细胞质中。 Western blot结果实证该表达产物可与His-tag抗体发生特异性结合,提示为目的融合蛋白。结论成功构建pET30a（＋）-ScFv-mms13表达载体并表达获得目的融合蛋白。     

重组原核表达载体pGEX6P1-Osx的构建与表达

目的构建原核表达载体pGEX6P1-Osx,并在大肠杆菌中诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白。方法提取新生小鼠牙髓总RNA,RT-PCR扩增Osx目的基因片段,并将该片段克隆至PCR-TopoII载体中;经鉴定正确后目的基因定向连接至表达载体pGEX6P1;将重组质粒pGEX6P1-Osx转化至大肠杆菌BL21,以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE电泳鉴定;免疫印迹法检测纯化的GST融合蛋白。结果IPTG诱导宿主菌BL21有效表达融合蛋白;免疫印迹法鉴定该融合蛋白为GST-Osx。结论成功构建原核表达载体pGEX6P1-Osx,且GST-Osx融合蛋白可在大肠杆菌中诱导表达。     

鼻咽癌人源抗独特型基因工程抗体的原核表达及鉴定

目的构建鼻咽癌人源抗独特型单链抗体原核表达载体，对其产物做初步鉴定，为鼻咽癌疫苗制备奠定基础。方法采用分子克隆技术，PCR扩增G22ScFv基因，并将其克隆到原核表达载体pET25b（＋）上，将重组子转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达后，表达的蛋白经His—tag纯化试剂盒纯化后复性。SDS—PAGE及Western blot分析融合蛋白。结果构建的原核表达载体pET25b（＋）－G22经测序检测，序列正确。在大肠杆菌中G22ScFv以包涵体形式获高效表达，SDS－PAGE及Western blot鉴定表达的目的蛋白Mr为25kD，同时证实载体构建及表达均正确。目的蛋白经试剂盒纯化后电泳分析纯度达95％以上。结论利用基因重组技术，在原核细胞中表达出重组G22ScFv并得到纯化，为研究鼻咽癌疫苗打下了基础。     

乙型肝炎病毒X基因克隆及其表达

目的：构建乙型肝炎病毒X基因原核表达载体,并诱导其表达。方法：从乙肝病人血清中提取HBV DNA;以带有EcoRI和Hind〖KG-*3〗Ⅲ酶切位点的引物,用PCR方法扩增X基因;而后定向克隆到原核表达载体pMAL-C2X上,经酶切鉴定和序列分析;以IPTG诱导X融合蛋白的表达。结果：PCR扩增显示有类似HBV X基因片断大小的条带;构建的原核表达重组体PMAL-C2X-HBV-X经酶切有相应大小的的基因插入片断,序列分析证实为正确的有完整读码框的X基因;这一重组体在IPTG诱导下有相应大小的X融合蛋白表达。结论：成功构建了HBV X基因原核表达重组体pMAL-C2X-HBV X;在IPTG的诱导下,该重组体在大肠杆菌中可表达X融合蛋白,为进一步纯化HBV X蛋白和研究其生物学作用奠定了基础。