甲基化特异性PCR检测肺癌p16基因甲基化及其临床意义

目的：探讨甲基化特异性聚合酶链反应(methylation—specific PCR，MSPCR)在肺癌临床诊断中的应用价值。方法：选取56例肺部疾病住院患者手术切除的病变肺组织和相应的支气管肺泡灌洗液(BALF)及痰标本，其中32例为肺癌．24例为良性肺部疾病。标本经一般处理，PCR扩增后，产物经电泳EB染色，紫外灯下观察。结果：32例肺癌组织标本中，14例(43．8％)在p16基因启动子区域呈现异常甲基化，其中9例(643％)在相应的BALF中检测出甲基化存在。5例(35．8％)在相应的痰标本中也检测出甲基化存在。24例良性肺部疾病，其中肺囊肿10例，肺结核14例。手术切除标本和BALF及痰标本中均未检测出p16基因甲基化存在。结论：MSPCR技术对肺癌患者BALF及痰标本中的异常甲基化检测具有高度特异性，是一项有潜力的肺癌早期诊断新技术。     

肺癌血清p16基因启动子畸变甲基化检测

[目的]检测肺癌患者血清DNA中p16基因启动子畸变甲基化,并探讨其在肺癌早期诊断和预后评价中的作用。[方法]收集新鲜的肺癌组织及其对应的血清标本69例,肺良性疾病患者标本25例,健康人血清标本10例。采用PCR技术分别检测肿瘤组织DNA和血清游离DNA中p16基因启动子畸变甲基化的状况。[结果]28.99%(20/69)肺癌组织出现p16高甲基化;出现高甲基化的组织标本相对应的20例血清中有15例(75%)出现p16基因高甲基化。肺良性疾病患者及正常人的血清、DNA中均未见p16基因高甲基化。血清p16基因高甲基化与肺癌TNM分期及分化程度密切相关(P<0.01或P<0.05)。[结论]非小细胞肺癌血清中p16基因甲基化状况的检测,可能有助于非小细胞肺癌的早期诊断或预后评估。     

非小细胞肺癌p16基因甲基化及缺失的研究

目的 研究p16基因在非小细胞肺癌组织中的甲基化和缺失情况，探讨其在肺癌诊断中的价值。方法 应用甲基化相关的PCR及双重PCR，检测50例肺癌组织和54例正常肺组织中p16基因第1外显子5′端启动子区域CpG岛甲基化及第2外显子缺失情况。结果 p16基因在非小细胞肺癌组织中甲基化率为32.0%(16/50)。缺失率为28.0%(14/50);54例正常肺组织甲基化率为3.7%(2/54)，缺失率为0，二组比较，甲基化率（Fisher's exact=0.000)及缺失率（Fisher's exact=0.000)均有显著性差异。结论 甲基化和缺失是非小细胞肺癌p16基因失活的主要形式，检测p16基因甲基化和缺失状态可能有助于肺癌的诊断。     

甲基化特异性PCR检测肺癌p16基因甲基化及其临床意义

目的:探讨甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR,MSPCR)在肺癌临床诊断中的应用价值.方法:选取56例肺部疾病住院患者手术切除的病变肺组织和相应的支气管肺泡灌洗液(BALF)及痰标本,其中32例为肺癌,24例为良性肺部疾病.标本经一般处理,PCR扩增后,产物经电泳EB染色,紫外灯下观察.结果:32例肺癌组织标本中,14例(43.8%)在p16基因启动子区域呈现异常甲基化,其中9例(64.3%)在相应的BALF中检测出甲基化存在,5例(35.8%)在相应的痰标本中也检测出甲基化存在.24例良性肺部疾病,其中肺囊肿10例,肺结核14例,手术切除标本和BALF及痰标本中均未检测出p16基因甲基化存在.结论:MSPCR技术对肺癌患者BALF及痰标本中的异常甲基化检测具有高度特异性,是一项有潜力的肺癌早期诊断新技术.     

肺癌患者外周血血浆中p16基因异常甲基化的检测

目的 分析肺癌患者外周血血浆中p16基因启动子区异常甲基化发生情况,探讨血浆中p16基因异常改变作为肺癌临床辅助诊断分子生物学标志物的可能性。方法 利用半巢式甲基化特异性PCR技术,检测了137例肺癌患者血浆和112例相对应肿瘤组织DNA p16基因的异常甲基化情况。结果 在血浆和肿瘤组织中的p16基因甲基化检出率分别为75．2％和80．4％;其中鳞癌、腺癌、腺鳞癌和小细胞肺癌患者血浆标本的阳性率分别为77．9％,65．1％,75．1％和91．7％。血浆DNAp16基因甲基化仅在肿瘤组织存在同样甲基化的病例中被检出。血浆和肿瘤组织中,p16基因的甲基化异常改变与肿瘤的分期、分型无明显相关性。结论 分析血浆DNA的p16基因异常甲基化有可能成为辅助肺癌诊断的有效方法之一。     

肺癌患者组织样品中p16基因的异常甲基化

目的 分析肺癌患者组织样品中p16基因启动子区域异常甲基化的改变情况,评价该指标作为辅助临床诊断的分子标记物的价值。方法 运用甲基化特异性PCR技术,检测51例原发性肺癌患者的肿瘤组织、外周血血浆和痰标本中p16基因启动子区域的异常甲基化改变。结果 在43例肿瘤组织、36例血浆和39例痰标本中检测到了p16基因异常甲基化。凡在肿瘤组织检出p16基因甲基化阳性的病例,其血浆和(或)痰标本也为阳性;而肿瘤组织p16基因甲基化阴性的病例,其血浆和痰标本也为阴性。将血浆和痰标本的p16甲基化分析与痰细胞学检查相结合,可以发现92．2％的肺癌病例。结论 利用半巢式甲基化特异性PCR进行的血浆和痰标本p16基因甲基化分析,有可能成为辅助肺癌诊断的分子生物学指标。     

中国非小细胞肺癌患者血清DAPK基因、p16基因启动子甲基化的分析

Objective： To evaluate the clinical significance of the aberrant methylation of DAPK gene and p16 gene in sera from 65 NSCLC patients from Nanjing General Hospital of Nanjing Command, China. Methods： A methylation-specific PCR （MSP） was performed for the detection of promoter hypermethylation of DAPK gene and p16 gene in blood DNA from 65 cases of NSCLC, and to analyze the relation of the aberrant methylation of DAPK gene and p16 gene and the clinicopathological data. Results： 30.8% （20/65） of the sera from 65 cases of NSCLC showed hypermethylation for DAPK promoter and 43.1% （28/65） the same for p16 promoter, whereas no methylated DAPK gene promoter and p16 gene promoter were found in sera from the patients with lung benign diseases and normal controls. Methylated DAPK gene promoter and p16 gene promoter in sera were not closely correlated with the pathological classification, stage, metastasis and differentiation in NSCLC. Conclusion： Detection of the aberrant methylation of DAPK gene and p16 gene in blood DNA from NSCLC patients might offer an effective means for the earlier auxiliary diagnosis of the malignancy.     

p16基因甲基化对非小细胞肺癌发病的影响

目的探讨p16基因甲基化对非小细胞肺癌发病的影响。方法原发性肺癌患者47例及同期无呼吸系统疾病又未患任何肿瘤同性别者94例作对照,采用甲基化特异性PCR等技术,检测p16基因甲基化。结果p16基因甲基化在肺癌组织和正常肺组织中检出率分别为44.7%(21/47)和17.0%(8/47),两者有显著差异(P<0.05)。37例非小细胞肺癌吸烟者中有21例肺癌组织发生p16基因甲基化,而10例非小细胞肺癌非吸烟者中无一例肺癌组织发生p16基因甲基化。p16基因甲基化与年龄、饮酒、肺癌病理分型及肺癌临床分期之间均无明显的相关性(P>0.05)。结论p16基因甲基化与非小细胞肺癌发生的关系非常密切,p16基因甲基化与吸烟有关。检测p16基因甲基化与否,可能有助于肺癌的诊断。     

巢式甲基化特异性PCR 检测食管癌病人血清中p16 基因启动子区过甲基化

 目的 检测食管鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）患者外周血血清中p16基因启动子区的甲基化状态，探讨p16基因启动子的过甲基化在食管鳞状细胞癌筛查及早期诊断中的意义。方法 利用巢式甲基化特异性PCR（nMSP）法检测食管鳞状细胞癌患者外周血血清与正常人血清中p16基因启动子的甲基化状态，并与普通甲基化特异性PCR（MSP）法进行了比较。结果 56例SCC血清样品中nMSP法发现34例p16基因启动子的过甲基化，MSP法只检出15例，而22例正常人血清中都未检测到p16基因启动子的过甲基化。测序结果进一步验证了方法的可靠性。结论 利用巢式MSP（nMSP）法检测外周血血清中p16基因启动子的甲基化，可为食管癌的筛查、早期诊断及预后判断提供有价值的信息。     

NSCLC患者血浆p16和MGMT基因甲基化检测及临床意义

目的：检测非小细胞肺癌（non—small cell lung cancer，NSCLC）患者外周血血浆中p16基因、O^6-甲基乌嘌呤-DNA甲基转移酶（O^6-methylguanine—DNA methyhransferase，MGMT）基因启动子的甲基化状态，探讨p16、MGMT基因启动子的异常甲基化在NSCLC筛查及早期诊断中的意义。方法：利用巢式甲基化特异性聚合酶链反应法检测NSCLC患者外周血血浆p16、MGMT基因启动子的甲基化状态。结果：65例NSCLC血浆样品中分别发现19例（29．23％）p16基因启动子异常甲基化和16例（24．62％）MGMT基因启动子异常甲基化，45例正常对照血浆组未检测到p16、MGMT基因启动子的异常甲基化（P〈0．05），血浆中两基因甲基化检出率与NSCLC的分型及临床分期无明显相关性（P〉0．05）。结论：利用巢式甲基化特异性PCR法检测外周血血浆中p16、MGMT基因启动子的甲基化，可为NSCLC的筛查、早期诊断及预后判断提供有价值的信息。     

乳腺癌患者血清中ｐ１６基因甲基化状态的研究

目的　选取ｐ１６基因启动子甲基化这一指标来探讨乳腺癌患者外周血清中游离的肿瘤相关ＤＮＡ与肿瘤组织及临床病理参数的相关性。方法　应用甲基化特异性聚合酶链反应（ＭＳ-ＰＣＲ）检测８２例乳腺癌患者组织及其配对血清中游离ＤＮＡｐ１６基因启动子区域甲基化状况。结果　８２例乳腺癌组织ｐ１６基因启动子甲基化阳性率为３０.５％（２５／８２）,相应外周血清中ｐ１６基因启动子甲基化阳性率为１９.５％（１６／８２）。２５例呈现甲基化阳性的癌组织中有１６例其配对血清中也监测到ＤＮＡ甲基化阳性,而８２例乳腺癌组织中甲基化阴性的５７例患者、３０例乳腺良性病变患者以及２４例健康人,其外周血清均为ｐ１６基因启动子甲基化阴性。外周血清中ｐ１６基因启动子区域甲基化异常与乳腺癌组织中的甲基化状况显著相关（ｒ＝０.７４３５,Ｐ＜０.０５）。乳腺癌组织及外周血清中ｐ１６基因启动子区域甲基化状态与肿瘤分期、肿块的大小、病理类型、月经状况、淋巴结转移、激素受体、家族史无关。结论　乳腺癌患者外周血清中ｐ１６基因启动子甲基化与肿瘤组织中相同基因的变异显著相关,可用血清替代癌组织检测ｐ１６基因启动子区域甲基化状态。     

用三种生物标志物对大肠癌进行的检测

 目的 寻找一种切实可行的检测肿瘤的生物标志物及其方法。方法 对100例结直肠癌患者取血清，另取献血员19例，非肿瘤患者13例为对照；并另取癌组织13份，癌旁组织11份作对比观察，同时用三种方法进行检测。一为对p16基因甲基化分析；二为对其进行缺失分析，三为对其进行点突变的分析。结果 患者血清异常甲基化为58 %；缺失为14 %；点突变为25 %；癌组织之结果与血清相似；而癌旁组织显然较低。SSCP阳性者经序列分析证实有3例为错义突变，1例为移位，1例为同义突变。其中4例造成p16蛋白的缺失。作为肿瘤的生物标志物，三项联合应用其灵敏度为75 %，特异性为96.87 %，准确率为80.30 %。比文献用CEA+CA19-9+CA72-4+CA242 四项指标联合之灵敏度、特异性、准确率皆高，尤其是特异性。如果仅用甲基化加突变亦与之相当。结论 血清DNA含量不高但能反映人体对肿瘤的负荷，实验对DNA的质和量的要求不是太高，能检出10-3的DNA片段，可用于临床诊断及大面积普查，并可用于对出院患者的长期随访。     

Frequent p16INK4a promoter hypermethylation in human papillomavirus-infected female lung cancer in Taiwan

Inactivation of p16INK4a gene through promoter hypermethylation has been frequently observed in non small cell lung cancer; however, various studies have shown a controversial correlation between p16INK4a hypermethylation and cigarette smoking. Our recent report showed that human papillomarvirus (HPV) 16/18 infections were associated with the development of nonsmoking female lung cancer in Taiwan and we further speculated that HPV infection may be linked with p16INK4a hypermethylation. To verify the influence of environmental exposure, including cigarette smoking, environmental carcinogen exposure and HPV infections on p16INK4a hypermethylation, tumors from 162 lung patients, including 67 smoking males, 41 nonsmoking males and 58 nonsmoking females, were subjected to p16INK4a hypermethylation analysis by methylation-specific PCR. As the results showed, p16INK4a hypermethylation was detected in 40 (59.7%) of 67 smoking male, 15 (36.6%) of 41 nonsmoking male and 35 (60.3%) of 58 nonsmoking female lung tumors. This result seemed to reveal that gender and cigarette smoking both possess an equal influence on p16INK4a hypermethylation. This result also led to a speculation that HPV infection may promote p16INK4a hypermethylation in nonsmoking female lung cancer patients. From our data, p16INK4a hypermethylation frequency in nonsmoking female lung tumors with HPV infection was as high as 70% (30 of 43) compared to those without HPV infection (33%; 5 of 15). In fact, the correlation between HPV infection and p16INK4a hypermethylation was only observed in nonsmoking female lung tumors (p = 0.017), but not in smoking male or nonsmoking male lung tumors. Moreover, the reverse correlation between p16INK4a immunostaining and p16INK4a promoter hypermethylation was also only observed in nonsmoking female lung tumors. These results strongly suggested that the involvement of HPV infection in lung tumorigenesis of nonsmoking female cancer patients in Taiwan may be mediated at least in part through the increase of hypermethylation to cause p16INK4a inactivation.     

结直肠癌患者血清中CDKN2／p16基因异常的检测

 目的 寻找一种切实可行的检测肿瘤的生物标志物及其方法。方法 对100例结直肠癌患者取血清，另取献血员19例，非肿瘤患者13例为对照；并另取癌组织26份，癌旁组织22份及非恶性组织29份作对比观察，p16基因甲基化分析；并对其进行缺失分析及点突变的分析。结果 患者血清异常甲基化为69 %；缺失为9 %；点突变为45 %；癌组织之结果与血清相似；而癌旁组织显然较低。SSCP阳性者经序列分析证实有3例为错义突变，1例为移位，1例为同义突变。其中4例造成p16蛋白的缺失。作为肿瘤的生物标志物，3项联合应用其灵敏度为88 %，特异性为96.87 %，准确率为90.15 %。比文献用CEA+CA19-9+CA72-4+CA242 4项指标联合之灵敏度、特异性、准确率皆高。结论 血清DNA含量不高但能反映人体对肿瘤的负荷，本实验对DNA的质和量的要求不是太高，能检出10-3的DNA片段，可用于临床诊断及大面积普查，并可用于对出院患者的长期随访。并提示P16基因异常甲基化在结直肠癌癌变机制中起决定性作用。     

血管生成和p16、p53蛋白表达与非小细胞肺癌淋巴结转移的相关性研究

目的　分析非小细胞肺癌 (NSCLC)淋巴结转移与血管生成及p16、p5 3蛋白表达的关系。方法　采用免疫组织化学方法对 187例NSCLC(74例腺癌、76例鳞癌和 37例腺鳞混合癌 )进行血管染色计数和p16、p5 3蛋白测定 ,并作相关临床因素分析。结果　非小细胞肺癌组织中微血管密度平均为 6 .8± 3.3,p16和p5 3蛋白阳性表达率分别为 4 7.6 %和 34.2 %。各组织类型非小细胞肺癌中淋巴结转移病例 (T2 N1～ 2 M0 )的微血管密度显著高于未转移者 (T2 N0 M0 ) ;在肺鳞癌和腺鳞癌中 ,p16和p5 3蛋白同时表达异常 (p16 -p5 3 )与微血管密度增高有关 ,但与淋巴结转移无关 ;而在肺腺癌中 ,p16和p5 3蛋白同时表达异常与淋巴结转移有关 ,但与微血管密度无关。微血管密度和p16、p5 3蛋白表达异常与年龄、性别、病理类型及分化程度均无明显相关。结论　各组织类型非小细胞肺癌的淋巴结转移均与活跃的血管生成密切相关 ,其中在肺鳞癌和腺鳞癌中 ,血管生成与p16和p5 3基因表达异常有关。而在肺腺癌中 ,血管生成和p16、p5 3蛋白异常表达是影响其淋巴结转移的两项独立的因素。     

Molecular detection of p16 promoter methylation in the serum of recurrent colorectal cancer patients

We previously proved that p16 promoter methylation present in the tumors of colorectal cancer patients can be detected in the serum of those same patients using methylation-specific PCR (MSP). To seek the possibility that this technique could be applied to the monitoring of cancer recurrence, we examined the p16 methylation using MSP. We detected tumor DNA in the serum of 31 of 45 (69%) patients with recurrent colorectal cancer. No methylation was found in serum DNA of 50 patients with colorectal cancers whose corresponding tumor DNA had no methylation in p16 promoter. These results suggested that MSP might be a sensitive and useful method to detect recurrent colorectal cancer in serum.     

痰标本p16和MGMT基因甲基化对肺癌的诊断价值

目的：分析肺癌患者痰标本中p16和MGMT基因启动子区甲基化的改变情况,评价该指标作为肺癌辅助诊断分子标志物的价值。方法：运用甲基化特异性PCR技术,检测77例原发性肺癌患者痰标本和部分对应肿瘤组织(53例),以及30例正常对照者痰标本中p16和MGMT基因启动子区域的甲基化改变。结果：49例(63．6%)肺癌患者痰标本中检测到了pi6基因异常甲基化,34例(44．2%)检测到了MGMT基因异常甲基化,77例患者痰标本中2个基因中至少有1个基因出现甲基化为64例(83．1%),对肿瘤的检出灵敏度较高。长期吸烟史是影响肺鳞状细胞癌痰标本p16(P=0．001)基因启动子区甲基化的因素。随TNM分期增高,肺鳞状细胞癌患者痰标本中p16基因甲基化比例增高(P=0．021)；随TNM分期增高,肺腺癌患者痰标本MGMT基因甲基化比例增高(P=0．023)。对照组正常人痰液标本未发现p16和MGMT基因启动子区甲基化。结论：痰标本中p16和MGMT基因甲基化是临床肺癌辅助诊断的有效生物标志物之一。