含小鼠分泌型内皮抑素基因重组质粒的构建及表达

目的:克隆小鼠分泌型内皮抑素(sEndostatin)cDNA,构建pCMV-分泌型内皮抑素和pEgr-分泌型内皮抑素重组质粒,检测重组质粒在B16细胞中的表达. 方法:用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出内皮抑素cDNA,经测序证实后,连入信号肽,构建pCMV-分泌型内皮抑素和pEgr-分泌型内皮抑素重组质粒,以脂质体转染小鼠B16细胞,用Western blot方法检测B16细胞上清中内皮抑素的表达.结果:测序表明扩增的分泌型内皮抑素序列与报道完全一致, Egr-1启动子和分泌型内皮抑素cDNA正确插入表达载体pcDNA3.1,Western blot证实转染B16细胞上清中有目的蛋白表达.结论:小鼠内皮抑素基因成功地被克隆和表达,为今后检测pEgr-分泌型内皮抑素的辐射诱导表达和恶性肿瘤的基因-放射治疗奠定基础.     

小鼠干扰素γ基因克隆、测序及辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ的构建

目的：克隆小鼠干扰素γ（IFN-γ）编码区cDNA序列并构建含Egr-1启动子的辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ。 方法：利用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法,以小鼠脾细胞mRNA为模板,扩增获得全长IFNγcDNA,与pGEMT载体连接做全自动测序,并利用基因重组技术构建含Egr-1启动子的辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ。 结果：经测序证实获得的小鼠IFNγ cDNA序列与文献报道完全一致,并构建了含Egr-1启动子的辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ。结论：成功克隆了小鼠IFNγ的cDNA序列,构建了辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ。     

多次小剂量pEgr-IFNγ-Endostatin基因-放射治疗对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用

目的：探讨多次小剂量pEgr-IFNγ-Endostatin基因-放射治疗对荷Lewis肺癌小鼠的抑瘤 效应。 方法：将荷瘤小鼠随机分为对照组、10 Gy照射组、4次2.5 Gy照射组、4次质粒组、质粒 + 10 Gy组和4次(质粒+2.5 Gy）组。小鼠肿瘤局部注射脂质体包裹的质粒后36 h,接受X射线照射,观察各组小鼠治疗后不同时间肿瘤生长速率, 18 d后计数各组小鼠肺转移 结节数, 并称量瘤重。 结果：治疗后12~18 d,4次（质粒+2.5 Gy）组肿瘤生长速率明显低于质粒+10 Gy组（P<0.001）。治疗后18 d,4次（质粒+2.5 Gy）组小鼠肺转移结节数和瘤重明显低于质粒+10 Gy组（分别为P<0.001和P<0.01）。 结论：多次小剂量pEgr-IFNγ-Endostatin基因-放射治疗的抑瘤效应优于单次大剂量基因-放射治疗。     

人内皮抑素基因的质粒构建及在大肠杆菌中的表达

目的:将人内皮抑素(endostatin)基因插入表达载体并进行原核表达.方法:将endostatin基因定向插入表达载体pQE-31 BamH I/Kpn I位点,构建重组质粒pQEN,转化E.coli M15,进行原核表达.结果:在IPTG的诱导下,endostatin基因在重组转化株E.coli M15 (pQEN) 中获得高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子量为22×103 u,表达产物主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的34.6%.结论:从组织中克隆endostatin基因并进行原核表达是可行的方法.     

短双歧杆菌携带内皮抑素和干扰素γ的特性及其抗小鼠肺癌的作用

目的：以短双歧杆菌为载体,以内皮抑素（ES）和干扰素γ（IFNγ）为目的基因,探讨携带目的基因的短双歧杆菌在小鼠体内的分布特性及其抗小鼠肺癌的效果。方法：构建原核表达载体pNZ44-IFNγ及pNZ44-ssEndostatin,电穿孔法将质粒转入用3H-TdR标记的短双歧杆菌,筛选鉴定。制备荷瘤小鼠,实验分为对照组(Control)、双歧杆菌无质粒组（B-b）、双歧杆菌空质粒组（B-b-pNZ44）、双歧杆菌内皮抑素组（B-b-pNZ44-ssEndostatin）、双歧杆菌干扰素组（B-b-pNZ44-IFNγ）和双歧杆菌联合组（B-b-pNZ44-ssEndostatin + B-b-pNZ44-IFNγ）,通过尾静脉注射和灌胃给予携带目的基因的短双歧杆菌。观察短双歧杆菌在小鼠体内的分布情况,以及移植瘤体积、小鼠免疫学指标和肿瘤间质微血管密度(IMVD)的变化。结果：成功构建了携带目的基因的短双歧杆菌。经尾静脉注射后,实验动物的心脏、肝脏、肺脏和肾脏中双歧杆菌逐步被清除,从第3天开始,各器官中放射活性较第1天明显降低（P<0.05）;肿瘤组织的放射活性随时间延长逐渐增加,从第3 天开始放射活性与第1天比较差异有统计学意义（P<0.05）。通过灌胃和尾静脉注射携带目的基因的短双歧杆菌,能抑制小鼠肺癌移植瘤的生长,并且增加CTL细胞活性、NK细胞活性和TNFα分泌活性,降低IMVD。结论：携带ES和IFNγ的短双歧杆菌能够靶向性地在肿瘤组织中定植,并通过免疫增强和抑制血管生成等机制起到抗肿瘤作用。     

内皮抑素重组腺病毒载体的构建及制备

目的 构建鼠源性内皮抑素(mEndostatin)重组腺病毒真核表达载体,为下一步研究其在体外表达及动物实验研究提供基础。方法 以mEndostatin质粒为模板通过PCR方法扩增回收mEndostatin,并在其5'端引入M-成瘤蛋白信号肽。将mEndostatin连接到腺病毒载体pCA13中,构建pCA13-mEndo表达质粒。将此表达质粒与腺病毒重组质粒pBGHE3通过Lipofectamine 2000共同转染293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-mEndo。纯化后重组腺病毒Ad-mEndo在293细胞大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化、测定其滴度。结果 扩增得到的mEndostatin经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序证实为鼠源性内皮抑素,重组腺病毒Ad-mEndo的滴度为6.3×1010 pfu／ml。结论 该实验为今后研究重组腺病毒mEndostatin用于恶性肿瘤的基因治疗打下了基础。     

sflk1-IFN-γ双功能蛋白基因重组质粒的构建和表达及生物学活性鉴定

目的:构建表达可溶性血管内皮生长因子受体2(sVEGFR2,在小鼠又称sflk1)与IFN-γ双功能蛋白的重组质粒pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ,对表达的sflk1-IFN-γ重组蛋白的生物学活性进行鉴定.方法:以RT-PCR法分别扩增出sflk1与小鼠IFN-γ基因片段,克隆入pcDNA3.1(+)载体,将该重组质粒表达于真核细胞,以ELISA和Western blotting分别检测胞外及胞内sflk1-IFN-γ双功能重组蛋白的表达,并对该蛋白的生物学活性进行鉴定.结果:构建的pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ重组质粒能够在真核细胞中有效表达,且表达的sflk1-IFN-γ重组蛋白兼有sflk1和IFN-γ两者的生物学活性.结论:成功构建和表达了sflk1-IFN-γ双功能蛋白基因重组质粒,为进一步研究该双功能蛋白的抗肿瘤作用打下了基础.     

携带内皮抑素基因的重组腺病毒的构建

目的 利用AdEasy-1系统,构建并鉴定人内皮抑素重组腺病毒,为后续的实验奠定基础.方法 以PshuttleEndostatin质粒为模版PCR扩增内皮抑素基因片断,克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,在AAV293细胞中包装并扩增.结果 重组腺病毒经测序、酶切鉴定正确,病毒滴度为2.06×1010 pfu/ml.结论 人内皮抑素重组腺病毒pAd-Endo构建成功.     

内皮抑素30肽基因真核表达载体的构建及实验研究

目的构建改构内皮抑素抗肿瘤相关肽(30肽)的真核表达载体pVAX1,检测该重组载体的生物学活性。方法在30肽基因的5′端加入胶原蛋白ⅩⅧ信号肽编码序列,通过PCR扩增获得目的基因30肽,并连接到质粒pVAX1中,构建表达分泌型内皮抑素的重组质粒pVAX1-30E,然后将重组质粒pVAX1-30E直接注入小鼠肿瘤组织。通过ELISA小鼠体内抑瘤实验检测目的基因的表达及其活性。结果ELISA实验表明构建的分泌型内皮抑素重组质粒pVAX1-30E能在肿瘤细胞中表达30肽,免疫组化结果表明瘤组织中表达的30肽能抑制肿瘤微血管的新生,而体内抑瘤实验表明在肿瘤部位直接注射重组质粒能抑制肿瘤生长,抑瘤率为28.19%。结论通过向瘤组织中直接注射分泌型内皮抑素重组质粒pVAX1-30E可以抑制小鼠体内肿瘤微血管新生和肿瘤生长而实现其抗肿瘤活性。     

辐射诱导人TRAIL和内皮抑素双基因共表达载体的构建及鉴定

目的：构建辐射敏感Egr-1启动子诱导分泌型人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）和内皮抑素（endostatin）双基因共表达的载体pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES。方法：利用聚合酶链式反应（PCR）方法从pMD19T-endostatin载体上扩增得到分泌型endostatin基因,并连接到pMD19T载体上进行测序,然后利用基因重组技术构建Egr-1启动子转录调控分泌型TRAIL和endostatin双基因表达的重组质粒pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES。结果：PCR扩增出的650 bp片段经测序证实其序列与预期一致,说明获得的分泌型人endostatin基因正确;对pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES及其构建过程中涉及到的多种中间载体进行PCR和酶切鉴定,结果均与预期完全一致,证实含有辐射敏感Egr-1启动子的分泌型TRAIL和endostatin双基因共表达重组质粒pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES构建正确。结论：成功构建了辐射诱导表达的双基因共表达载体pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES,为探讨TRAIL和endostatin双基因-放射治疗的抗肿瘤作用及其机制奠定了实验基础。     

重组人内皮抑素的125Ⅰ标记及其体内代谢

目的探讨重组人内皮抑素(rhEndo)的125Ⅰ标记及其标记物(125Ⅰ-rhEndo)的生物学活性和体内药代动力学.方法采用小剂量Iodogen多次重复标记法标记rhEndo,细胞增殖抑制试验和亲和力试验检测125Ⅰ-rhEndo活性,并研究其在大鼠体内的药代动力学.结果0.5μg Iodogen 3次重复标记rhEndo的标记率可达84%,放射化学纯度(94.7±2.44)%.125Ⅰ-rhEndo抑制bFGF诱导内皮细胞增殖的作用与未标记rhEndo相当,且能与其竞争结合内皮细胞表面受体.大鼠单次股静脉注射125Ⅰ-rhEndo 2 μg后,血药浓度-时间曲线符合两室模型,T1/2α为(0.45±0.12)h,T1/2β为(19.53±3.41)h,AUC为(484.57±137.99)ng·h·mL-1.结论小剂量Iodogen多次重复125Ⅰ标记不影响rhEndo蛋白的生物学活性.125Ⅰ-rhEndo大鼠体内单次静脉注射的药代动力学符合两室模型,半衰期约19 h.125Ⅰ-rhEndo标记为肿瘤的靶向显像和治疗奠定了基础.     

小鼠内皮抑制素原核表达质粒的构建及表达

内皮抑制素具有强烈的抑制新生血管形成的作用，其主要在肝脏合成。提取小鼠肝细胞总RNA，设计合适的引物，用RT－PCR扩增出小鼠内皮抑制素cDNA片段，插入原核表达载体pRSET-A中，构建出重组质粒pRSET-ES。将其转化入大肠杆菌DH5α中扩增，质粒酶切筛选，DNA测序予以证实。重组质粒转化入大肠杆菌BDPS中，经IPTG诱导，SDS－PAGE检测到约19.8ku大小的融合蛋白。     

小鼠白细胞介素18基因克隆、测序及重组质粒pIRES-IL18-B7.1的构建

目的 :克隆小鼠白细胞介素 1 8( m IL- 1 8)编码区的 c DNA序列并构建其表达载体。方法 :利用逆转录多聚酶链反应 ( RT- PCR)法 ,以小鼠脾细胞 m RNA为模板 ,扩增获得全长 m IL-1 8,与 p MD1 8T连接作全自动测序 ,并利用基因重组技术构建包含 m IL- 1 8和 B7.1的双基因表达质粒 p IRES- IL1 8- B7.1。结果 :经测序证实获得的 m IL- 1 8序列与文献报道完全一致 ,并成功构建了表达质粒。结论 :成功克隆了 m IL- 1 8的 c DNA,并构建了双基因表达载体 p IRES- IL1 8- B7.1     

不相容双质粒共表达人内皮抑素及简化人纤溶酶原饼环区5

目的构建人内皮抑素（human endostatin,hES）原核表达质粒pET28a／hES并与简化人纤溶酶原饼环区5（predigested human plasminogen kringle 5,predhPK-5）在大肠杆菌中实现共表达。方法RT-PCR法从人肝癌组织中扩增人内皮抑素基因,利用基因克隆技术构建原核表达质粒pET28a／hES。在卡那霉素与氨苄青霉素的选择压力下,将其与pGEX-1λT／predhPK-5共同转化E．coEBL21（DE3）,并诱导表达重组蛋白。同时从连续培养时间与传代次数两方面检测了共转化子的稳定性。结果成功构建了重组质粒pET28a／hES,其与pGEX-1λT／predhPK-5的共转化子在双抗生紊压力下可以共存,并在E．coli BL21（DE3）中成功共表达了人内皮抑素及简化的人纤溶酶原饼环区5,其表达量分别占蛋白总量的20％和21％。在双抗性培养基中培养16h及传代120代,共转化子存活率均大于75％,具有较好的稳定性。结论不相容质粒pET28a／hES与pGEX-1λT／predhPK-5在大肠杆菌中的成功共表达,对基因共表达方法作了有益探索,验证了不相容质粒共表达方法的可行性。     

重组内皮抑素腺病毒联合卡铂抗小鼠肺癌的实验研究

目的 将重组内皮抑素腺病毒(Ad-E)和化疗药物卡铂联合治疗小鼠Lewis肺癌,观察其对肿瘤的抑制作用以探索其在肺癌治疗中的可行性.方法 建立小鼠LL/2肺癌模型,将荷瘤小鼠随机分为5组:生理盐水(NS)组,空载腺病毒(Ad-null)组,卡铂组,Ad-E组,Ad-E+卡铂组;观察肿瘤体积、瘤重、小鼠生存期、肿瘤血管生成、肿瘤细胞凋亡及治疗毒副反应.结果 与Ad-E或卡铂单药组相比,联合治疗组的肿瘤生长减慢,瘤重减轻,小鼠生存期延长,肿瘤组织微血管密度减少,肿瘤细胞凋亡增加,差异均有统计学意义(P<0.05).各治疗组小鼠均未出现明显毒副反应.结论 以腺病毒为载体的抗血管基因治疗联合化疗有较好的抑制小鼠Lewis肺癌效应,且无明显毒副作用.     

内皮抑素基因腺病毒载体的构建及表达

目的：构建人内皮抑素（Human Endostatin，hE）基因的腺病毒载体，并研究其对胃癌细胞株SGC-7901、MKN-45及人脐静脉内皮细胞系ECV304生物学特性的影响。方法：采用Lipofectamine2000法将含有人内皮抑素基因的质粒pCA13-hE与pBGHE3共同转染293细胞；免疫荧光法及Western Blot检测hE的表达；用不同感染复数（Muhiplicity of infection，MOI）的重组人内皮抑素基因的腺病毒感染ECV304细胞，观察细胞生长。结果：成功构建了含hE基因的腺病毒载体；经含hE基因腺病毒载体感染的人SGC-7901胃癌细胞株、MKN-45胃癌细胞株均表达hE蛋白；表达的hE蛋白具有一定的生物学活性，可以抑制人静脉内皮细胞系ECV304的生长。结论：获得了有表达功能活性的Endostatin腺病毒载体，表达产物可抑制ECV304细胞的增殖，为肿瘤的抗血管基因治疗提供了必要条件。     

重组分泌型内皮抑素抑制兔角膜新生血管形成的实验研究

目的:研究重组分泌型内皮抑素(endostatin)对兔角膜新生血管的抑制作用。方法:利用角膜缝线法诱导兔角膜新生血管形成。在缝线后第1天,将重组内皮抑素和生理盐水分别注射于兔球结膜下,观察角膜新生血管生长状况及组织病理学改变。结果:重组内皮抑素治疗组新生血管长度及生长面积明显少于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);光镜下,治疗组与对照组比较,基质层新生血管少,管腔小,浆细胞及成纤维细胞少。结论:球结膜下注射重组内皮抑素可有效抑制兔角膜新生血管的形成,为临床上角膜新生血管的防治提供新的方法。     

抗肿瘤的人重组内皮抑素基因的克隆及表达

目的 克隆抗肿瘤因子内皮抑素基因并表达内皮抑素蛋白重组人内皮抑素(human endosbtatin,HES)。方法 从人胎盘组织中分离总RNA,用RT-PCR法扩增出570bp的DNA片段,经序列测定证实为内皮抑素基因,并成功地克隆到pUC18质粒载体中,用Xpress系统体外表达出内皮抑素蛋白并纯化成功。结果 克隆的HEScDNA其序列和国外报道一致;构建了重组HES融合蛋白表达菌株,经SDS-PAGE等分析,表达目的蛋白达细菌总蛋白的40％以上。结论 通过HES基因克隆和表达的研究与探讨,得到了HES的基因克隆和高效表达菌株,为内皮抑素在临床治疗恶性肿瘤奠定了基础。