荧光共振能量转移技术及其在医药学中的应用

综述了荧光共振能量转移的原理、测量仪器、及其应用。     

荧光共振能量转移技术及其在药物定量分析中的应用

荧光共振能量转移技术作为一种高效的光学“分子尺”,在生物医学、免疫分析以及核酸检测等方面已有广泛的应用,近年来又被用于药物的定量分析。综述荧光共振能量转移技术的原理和特点以及在药物定量分析中的应用。     

奥曲肽修饰的壳聚糖纳米递送分子信标成像肺癌研究

目的 探究通过奥曲肽(OCT)修饰的壳聚糖(CS)miR-155分子信标(miR-155-MB)纳米(CS-miR-155-MB-OCT)识别miR-155并成像肺癌细胞用于肺癌早期诊断。方法 通过尾静脉注射A549肺癌细胞建立肺移植瘤裸鼠模型;通过鼻腔滴入Cre腺病毒,分别在滴入腺病毒后的4、6、8、12周处死小鼠建立LSL K-ras G12D转基因小鼠肺部的非典型增生、腺瘤、原位癌、肺腺癌的不同病变时期肺腺癌模型;取肺组织行HE染色观察。免疫组化染色检测肺移植瘤组织及不同病变时期转基因小鼠肺组织生长抑素受体2(SSTR2)的表达;实时荧光定量PCR检测不同病变时期转基因小鼠肺组织miR-155的表达。在肺移植瘤裸鼠模型中,尾静脉注射CS-miR-155-MB或CS-miR-155-MB-OCT;转基因小鼠模型中,尾静脉注射CS-miR-155-MB-OCT;活体成像仪检测肺移植瘤裸鼠及转基因小鼠不同病变时期肺部荧光信号;制作肺组织冰冻切片,激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)检测荧光信号来源。结果 HE染色显示成功构建了肺移植瘤裸鼠模型及转基因小鼠肺部的非典型增生、腺瘤、原位癌、肺腺...     

一种基于流式细胞仪平台荧光共振能量转移技术的Caspase-8活性检测荧光探针

荧光共振能量转移技术(fluorescence resonance energy transfer,FRET)作为一种经典的荧光检测技术,已经广泛运用于生物科学研究中,开发了一系列基于FRET技术的荧光检测探针。半胱氨酸蛋白酶家族(cysteine aspartic acid specific protease,Caspase)在细胞凋亡通路中发挥着十分重要的作用,尤其是位于死亡受体介导的凋亡通路起始位置的Caspase-8,它的激活能引发后续的一系列Caspase酶原的激活并引起细胞的凋亡。因此,Caspase-8活性的检测在细胞凋亡检测中具有非常重要的意义。本文基于蛋白酶类FRET荧光探针原理设计了一个能检测活细胞内Caspase-8活性变化的荧光探针,并且在流式细胞仪上利用FRET技术检测了细胞凋亡诱导剂特异性激活的Caspase-8活性,从而证明了所构建的探针检测Caspase-8活性的有效性和特异性。结果表明,所设计的探针能够特异性地响应细胞凋亡诱导中引起细胞内Caspase-8酶活性的变化,并且能够利用流式细胞技术得以快速定量检测。本研究为在活细胞中检测Caspase-8活性提供了一种更加方便快捷的检测方法。     

荧光共振能量转移电压敏感探针在钾通道抑制剂高通量筛选中的应用

目的：建立以荧光共振能量转移（FRET）电压敏感探针为染料的钾通道抑制剂高通量筛选模型。方法：分别用电压敏感探针的能量供体CC2-DMPE与能量受体DiSBAC2（3）先后负载RBL-2H3细胞，测量细胞去极化前后460nm和570nm的荧光变化。根据荧光的变化反映细胞膜电压的变化。结果：本筛选方法稳定可靠，系统Z’因子达到0．60以上。日筛选通量能够达到10000药次。对102个定向合成的化合物进行筛选，有11个化合物的荧光信号变化率有较好的剂量效应关系。结论：此模型具有良好的稳定性和特异性，FRET电压敏感探针是钾通道抑制剂高通量筛选的理想染料。     

非小细胞肺癌分子靶向治疗新进展

肺癌已成为世界因癌症死亡的首要原因,而且其发病率在多数国家还在不断增长.目前,中国的肺癌发病率已占到我国主要城市中各种恶性肿瘤的首位,并已成为因癌症死亡的主要原因,其病死率已超过世界平均水平,故而其治疗也成为人们关注的焦点.传统的治疗,如放疗和化疗由于缺乏特异性,获得疗效的同时也往往带来较大的毒副作用.     

细胞间黏附分子1在溃疡性结肠炎诊治中的临床意义

目的 探讨血清细胞问黏附分子1(ICAM-1)水平在溃疡性结肠炎(UC)中的临床意义.方法 收集30例UC患者(UC组)及30例正常者(C组)的血清,分别以ELISA法及免疫速率比浊法检测血清ICAM-1及C反应蛋白(CRP)水平.结果 UC组ICAM-1的水平明显高于C组(P<0.05);同一患者UC活动期ICAM-1高于缓解期(P<0.05);ICAM-1水平升高与UC疾病活动度的严重程度呈正相关(P<0.05),而与UC发生部位无关(P>0.05);ICAM-1与CRP有良好一致性(r=0.8).结论 UC患者血清ICAM-1水平升高与疾病活动度呈正相关,可作为UC疾病活动度和判断治疗效果的一个客观指标.     

细胞黏附分子与子痫前期发病关系的研究

目的 检测子痫前期患者和正常孕妇胎盘组织中血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)及血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM-1)的表达水平,以探讨细胞黏附分子(CAM)在子痫前期发病机制中的作用.方法 选取2005年5月-2006年5月在郑州大学第三附属医院住院分娩病例80例,分为3组:①轻度子痫前期组20例;②重度子痫前期组30例;③正常晚孕组(NT组)30例;胎盘组织中MCAM-1、ICAM-1及PECAM-1的表达水平采用免疫组化PV-9000法测定.结果 ①重度子痫前期组胎盘组织中VCAM-1和PECAM-1的表达下降(P＜0.05),ICAM-1的表达增强(P＜0.05).②轻度子痫前期组胎盘组织中VCAM-1的表达下降(P＜0.05).ICAM-1和PECAM-1的表达无明显差异(P＜0.05).结论 CAM与子痫前期发病有密切联系,VCAM-1、ICAM-1和PECAM-1参入了子痫前期病理生理过程且与子痫前期的病情程度密切相关.     

分子印迹技术原理及其在药物分析检测中的应用

分子印迹技束是20世纪90年代快速发展起来的。制备空间结构和结合位点与模板分子完全匹配的聚合物的技术,它具有构效预定性、特异识别性和广泛实用性的特点。本文主要介绍分子印迹技术的产生、原理及其在药物分析检测中的应用．并对此项新技术的未来作了展望。     

新型冠状病毒木瓜样蛋白酶在大肠杆菌中的可溶表达与酶活性测定

目的 制备高活性的新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(papain-like protease,PLpro),为PLpro小分子抑制剂高通量筛选模型的建立奠定基础。方法 将密码子优化的新型冠状病毒PLpro基因连接到pET-28a载体中,构建重组质粒pET-28a-PLpro。将重组质粒转化到Escherichia coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)鉴定PLpro的原核表达。采用低温诱导策略进行PLpro的可溶表达后,以HisTrap^TM亲和层析柱分离纯化PLpro,再以荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)法测定PLpro的米氏常数(Michaelis constant,K_m)值及其水解活性。结果 基因测序与双酶切试验结果表明,成功构建了重组质粒pET-28a-PLpro。SDS-PAGE结果表明,PLpro在大肠杆菌中呈可溶表达,且纯化的PLpro纯度 > 90%。FRET结果表明,纯化的PLpro具有良好的水解活性,其K_m值为25.38 μmol·L^-1。结论 新型冠状病毒PLpro在大肠杆菌中成功地进行了可溶表达,且具有良好的酶活性。     

肝纤维化发生分子机制研究新进展

在世界范围内．有数千万肝纤维化患者，这些患者可能最终发展为肝硬化、肝衰竭而死亡。虽然目前在此领域的研究已经取得了长足的进展．但是由于肝纤维化发生机制的复杂性，仍然没有十分有效的治疗方法。近年来，随着细胞与分子生物学的快速发展．国内外的学者们对新近发现的几种因子例如胰岛素样生长因子连接蛋白和结缔组织生长因子在肝纤维化中的作用机制做了大量研究发现，胰岛素样生长因子连接蛋白主要来源于肝脏的非实质细胞．调节胰岛素样生长因子对肝脏细胞的促有丝分裂作用：结缔组织生长因子能够刺激成纤维细胞的增殖．     

老年非小细胞肺癌患者外周血树突状细胞表面分子研究

目的研究老年非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血树突状细胞(DC)表面特异性分子与NSCLC进展和生存的关系。方法选取上海市第七人民医院住院30例NSCLC患者作为研究组,30例同年龄段健康人群为对照组,采用流式细胞术(FCM)检测两组人群外周血DC表面分子CD80、CD83、CD86、CD1a,并进行统计学处理。结果研究组患者外周血DC表面分子CD80、CD83、CD86、CD1a的表达较对照组显著降低(P<0.05或P<0.01),对研究组进行亚组分析,结果表明,肺癌存活组与死亡组间CD80、CD86无显著差异(P>0.05),CD83、CD1a有显著差异(P<0.05和P<0.01)。结论老年NSCLC患者DC功能抑制,CD83、CD1a低表达,可能与NSCLC患者疾病进展和生存相关。     

三维定量构效关系和同源分子模拟在细胞色素P450研究中的应用

细胞色素P450(CYP450)是参与各种外源物和内源物代谢的重要酶系，研究该酶与底物或抑制剂的相互作用对于阐明药物作用机制及疾病预防、治疗具有重要意义。CYP450对药物代谢的选择性不仅与底物本身密切相关，还与酶活性位点血红蛋白中的特殊氨基酸残基排列分布对底物的特异性识别有关。在人CYP450的晶体结构未知的情况下，三维定量构效关系、药效团及同源分子模拟被认为是目前深入研究酶活性位点的有效工具。     

阿片成瘾的细胞分子机制

成瘾正由于逐渐成为导致死亡、病态、生育率降低的主要原因而受到重视。临床和社会对解决成瘾性问题的迫切需求,促进了成瘾研究的发展。阿片是引起成瘾的主要滥用药物,本文回顾了近30年来阿片成瘾研究领域的主要进展,从细胞分子水平,明确了各种主要成瘾药物作用的最初靶点,阐述了cAMP通路在阿片耐受依赖中的作用及VTANAc这一主要的奖赏环路在成瘾过程中发生的分子细胞变化。     

分子烙印技术及其在药物研究中的应用

早在20世纪40年代，著名的诺贝尔奖获得者Pauling就提出了分子烙印的概念，虽然该学说已经被克隆选择理论所否定，但化学家们却由此受到启示而发明了分子印迹技术。1949年Dickey首次实验了染料在硅胶上的印迹；1972年Wulff等在高分子聚合物上成功地实现了印迹。     

分子烙印技术及其在药物研究中的应用

早在20世纪40年代,著名的诺贝尔奖获得者Pauling[1]就提出了分子烙印的概念,虽然该学说已经被克隆选择理论所否定,但化学家们却由此受到启示而发明了分子印迹技术。1949年Dickey[2]首次实验了染料在硅胶上的印迹;1972年Wulff[3]等在高分子聚合物上成功地实现了印迹。随着Wulff[     

可溶性细胞间黏附分子-1在白癜风中的临床意义

目的 探讨可溶性细胞间黏附分子-1(sICAM-1)水平与白癜风活动程度的关系和意义.方法 sICAM-1检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法.结果 (1)白癜风患者血清sICAM-1平均水平为769.80 ng/ml,显著高于正常对照组642.40 ng/ml(P＜0.001).(2)进展期白癜风患者血清sICAM-1平均水平为802.32 ng/ml,显著高于稳定期654.15 ng/ml(P＜0.001).(3)泛发型白癜风患者血清SICM-1平均水平为801.40 ng/ml,显著高于局限型675.45 ng/ml(P＜0.001).(4)稳定期和局限型白癜风患者血清sICAM-1水平与正常对照组差异无显著性(P均＞0.05).结论 sICAM-1可能参与白癜风的发病,与白癜风活动性和严重程度相关.     

慢性髓细胞白血病的分子靶向治疗临床研究新进展

近年来,慢性髓细胞白血病(CML)治疗的最大进展在于靶向药物治疗的空前效果,为Allo-HSCT之外的最好治疗方法。靶向治疗是指针对CML发病机制中某一重要环节被阻断而产生的治疗效应的过程。目前研究发现,这一过程的阻断性药物依据CML发生发展的分子病理机制分为2类:①酪氨酸激酶抑制剂。主要有格列卫(伊马替尼)、dasatinib、AMN107、ONO12380、Abl蛋白抑制剂和Src酪氨酸激酶抑制剂,其中格列卫已较多用于临床治疗并趋于成熟,dasatinib于2006年6月28日获FDA批准上市,AMN107已完成Ⅰ、Ⅱ期临床试验,即将获FDA批准上市,其余尚未进入临…     

脑梗死患者血清细胞间黏附分子1水平变化的研究

目的 探讨脑梗死患者血清细胞间黏附分子1 (ICAM-1)的含量变化及意义.方法 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定45例脑梗死患者急性期、恢复期血清ICAM-1含量,并与45例健康对照组比较.结果 脑梗死患者血清ICAM-1水平急性期组升高,与恢复期组、对照组差异均有统计学意义(t=32.18、24.67,均P＜0.01);恢复期组患者下降,但较对照组增高(t=13.72,P＜0.05).大、中、小梗死体积三组间两两比较:大梗死灶组血清ICAM-1水平明显高于中梗死组(t=28.52,P＜0.01),亦明显高于小梗死(t=34.28,P ＜0.01);中梗死灶组血清ICAM-1水平明显高于小梗死灶组(t=42.51,P＜0.01).伴有糖尿病的脑梗死患者血清ICAM-1水平明显高于正常血糖患者的脑梗死患者(t=18.54,P＜0.01),且脑梗死组血糖水平与血清ICAM-1水平呈正相关(r=0.315,P＜0.05).结论 脑梗死体积越大,血糖水平越高,其血清ICAM-1增高亦明显.血清ICAM-1可作为脑梗死损害程度的一个评估指标.     

分子伴侣Tapasin在介导特异性细胞毒性T淋巴细胞反应中的作用

病毒及肿瘤细胞的清除很大程度上依赖于特异性CD8＋细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,CTL通过T细胞受体（TCR）特异性识别病毒肽段并通过MHC-I类分子提呈引起感染细胞融解,经典MHC-I类分子在内质网内的装配要求有抗原肽配体和β2微球蛋白（β2m）的存在,而这一过程需要伴侣分子（chaperones）如Tapasin的参与。Tapasin是抗原递呈相关转运体（TAP）相关蛋白的基因产物,与MHC-I类分子同为免疫球蛋白超家族成员,在介导特异性CTL反应中有着重要作用,本文简述了Tapasin分子结构特征、在介导特异性CTL反应中的作用及与疾病的联系。