内皮型一氧化氮合酶基因在犬内皮细胞的转染和表达

目的探讨转染内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因后内皮细胞(EC)的功能变化。方法采用脂质体法转染eNOS基因于实验犬EC;RT-PCR和免疫组化法检测转染效果;分别采用比色法和酶联免疫法检测细胞培养液一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)和vWF的浓度;并观察转染细胞生长增殖情况。结果RT-PCR产物电泳和测序及免疫组化法检测证实转染效果满意;转染后EC培养液NOS和NO浓度在不同时间明显升高(120h分别为33.53和32.99),与正常组对比差异显著(P<0.05)。转染后细胞生长增殖和vWF含量无显著差异。结论通过脂质体法成功地将eNOS基因转染于实验犬EC;转染后eNOS基因在mRNA和蛋白质水平均高效表达;内皮细胞eNOS活性显著增强;转染后细胞生物学功能稳定。     

一氧化氮合酶基因转染小鼠内皮祖细胞的实验研究

目的 探讨利用脂质体介导内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因体外转染小鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPC)的可行性.方法 密度梯度离心法分离ICR小鼠骨髓来源单个核细胞培养制备小鼠EPC并鉴定;构建、扩增、提取并纯化pcDNA3.0/eNOS基因质粒;用EPC培养基配成2×105·mL-1细胞悬液,按0.6 mL/孔重新铺6孔板,待细胞生长至80％左右融合时,用脂质体LipofectamineTM 2000体外转染eNOS基因至EPC.转染48 h后,采用RT-PCR检测EPC中eNOS的表达,硝酸还原酶法检测EPC中一氧化氮(NO)的含量,荧光探针DCFH-DA活性氧检测氧自由基(ROS)的含量.结果 成功培养EPC,成功构建pcDNA3.0/eNOS基因载体.转染48 h后,EPC中eNOS表达量明增加(P＜0.01),NO含量明显升高(P＜0.01),ROS含量明显降低.结论 脂质体介导eNOS基因能够有效转染小鼠EPC,并能在EPC中有效表达.     

重组肝细胞生长因子质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

目的 构建人肝细胞生长因子(hHGF)真核表达质粒,探讨重组质粒对体外培养胎兔成骨细胞增殖分化的影响,为转基因治疗骨科疾病提供实验基础.方法 RT-PCR扩增人肝脏中hHGF全长cDNA片段,克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中,用脂质体法将pcDNA3.1( )-hHGF质粒转染成骨细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,用免疫荧光染色检测hHGF基因在成骨细胞内的表达;MTT法和FCM检测pcDNA3.1( )-hHGF转染后对细胞增殖和细胞周期的影响;采用RT-PCR和ELISA方法检测hHGF在成骨细胞中的表达.NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.结果 成功构建hHGF真核表达质粒,免疫组化和RT-PCR检测显示转染成骨细胞后细胞内hHGF mRNA呈现高水平表达;MTT法和FCM检测显示重组质粒转染后能促进成骨细胞的增殖,S期细胞比例增多;ELISA法检测到hHGF在细胞中有分泌性表达.转染重组质粒的成骨细胞合成碱性磷酸酶能力显著提高.结论 成骨细胞经基因转染后可以表达hHGF,外源性hHGF基因能够刺激成骨细胞增殖、分化及成骨活性.     

miRNA-24对血管内皮细胞eNOS表达/活性及其代谢产物NO生成的影响

目的 探讨微小RNA(miRNA)-24对血管内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达、活性调节的分子机制及其代谢产物的影响.方法 构建miRNA-24高表达质粒,并转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC).MTT法检测细胞的增殖情况,划痕实验检测细胞的迁移能力,RT-PCR和Western印迹法检测细胞eNOS mRNA和蛋白的表达情况,ELISA法检测eNOS的表达活性,硝酸还原法测定细胞培养上清液中NO的含量.结果 与对照组相比,转染miRNA-24后细胞增殖能力下降54.32%、迁移能力下降48.62%;转染miRNA-24后eNOS mRNA降低43.92%,蛋白表达量减少42.71%;转染miRNA-24后eNOS的酶活性降低73.20%,同时NO的合成与释放减少55.29%.结论 miRNA-24高表达抑制eNOS的表达及酶活性;miRNA-24抑制代谢产物NO的合成与释放,这可能成为心血管疾病防治的分子靶点.     

腺病毒介导的eNOS基因转移对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的 :探讨腺病毒载体介导的内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)基因转染血管平滑肌细胞 (VSMC)的效率及其对冠状动脉旁路移植术后再狭窄基因治疗的可行性。方法 :构建带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒转染体外培养的VSMC ,应用聚合酶链 (PCR)、逆转录PCR(RT PCR)技术和免疫组化法检测外源基因转染及表达效率 ;应用MTT法和流式细胞仪检测eNOS基因对VSMC的抑制作用。结果 :外源性eNOS基因成功导入了VSMC ;VSMC中有eNOS基因mRNA的表达 ;外源性eNOS蛋白呈高效表达。eNOS基因重组腺病毒载体转染细胞后 ,可显著抑制VSMC的生长 ,DNA合成减少。结论 :腺病毒介导的eNOS基因可高效地转染VSMC ,并可有效抑制细胞生长。     

eNOS对大鼠颈动脉球囊损伤后平滑肌细胞增殖的影响

目的 研究内皮型一氧化氮合酶(eNOS)对大鼠球囊损伤后平滑肌细胞增殖的影响.方法 构建腺病毒-eNOS(AdCMV-eNOS)质粒,以脂质体介导转染293细胞,扩增后转染SD大鼠球囊损伤后平滑肌细胞(实验组),以转染Ad-LacZ重组质粒的平滑肌细胞作为对照组.RT-PCR技术观察转染后平滑肌细胞eNOS mRNA的表达;细胞计数法分别检测实验组、对照组、正常组和单纯球囊损伤组平滑肌细胞的增殖能力..结果 RT-PCR检测发现实验组平滑肌细胞表达eNOS mRNA,而对照组无表达.各时间点细胞计数结果显示,正常组均明显少于单纯球囊损伤组(P＜0.05),而实验组均明显少于单纯球囊损伤组和对照组(P＜0.05).结论 重组腺病毒表达载体构建正确;eNOS可以抑制平滑肌细胞增殖.为eNOS预防经皮腔内冠状动脉成形术术后再狭窄基因转染奠定了基础.     

eNOS对大鼠颈动脉球囊损伤后平滑肌细胞增殖的影响

目的研究内皮型一氧化氮合酶(eNOS)对大鼠球囊损伤后平滑肌细胞增殖的影响。方法构建腺病毒-eNOS(AdCMV-eNOS)质粒,以脂质体介导转染293细胞,扩增后转染SD大鼠球囊损伤后平滑肌细胞(实验组),以转染Ad-LacZ重组质粒的平滑肌细胞作为对照组。RT-PCR技术观察转染后平滑肌细胞eNOS mRNA的表达;细胞计数法分别检测实验组、对照组、正常组和单纯球囊损伤组平滑肌细胞的增殖能力。。结果RT-PCR检测发现实验组平滑肌细胞表达eNOS mRNA,而对照组无表达。各时间点细胞计数结果显示,正常组均明显少于单纯球囊损伤组(P<0.05),而实验组均明显少于单纯球囊损伤组和对照组(P<0.05)。结论重组腺病毒表达载体构建正确;eNOS可以抑制平滑肌细胞增殖。为eNOS预防经皮腔内冠状动脉成形术术后再狭窄基因转染奠定了基础。     

小檗碱对Ang Ⅳ诱导血管平滑肌细胞增殖的影响

目的研究小檗碱(BBR)对血管紧张素Ⅳ(AngⅣ)诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的作用及机制。方法体外培养大鼠胸主动脉VSMCs,采用BCA法测细胞总蛋白含量和MTT法观察VSMCs的增殖;Real-time RT-PCR方法检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA的表达;比色法和硝酸还原法分别检测细胞培养液中一氧化氮合酶(NOS)活性和一氧化氮(NO)含量。结果 BBR(10、30、100μmol/L)呈浓度依赖性地抑制AngⅣ(0.1nmol/L)诱导的VSMCs的增殖和蛋白含量的增加(P<0.05);并上调AngⅣ所致eNOS mRNA表达的减少(P<0.05),同时升高AngⅣ降低的NOS活性和NO浓度(P<0.05)。L-精氨酸也有类似作用(P<0.05),而NG-硝基-L-精氨酸甲酯可以抵消BBR和L-精氨酸的上述作用(P<0.05)。结论 BBR可抑制AngⅣ诱导的VSMCs增殖,该作用可能与其激活eNOS mRNA的表达,增加NOS活性,促进NO释放有关。     

诱导型一氧化氮合酶基因在313细胞中的转染和鉴定

目的：观察人诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因转染3T3成纤维细胞的可能性。方法：用阳性脂质体将含人iNOS基因的真核表达载体pcDNA3．0-iNOS转染至3T3成纤维细胞，用G418筛选，通过RT-PCR、免疫组化的方法鉴定。结果：pcDNA3．0-iNOS基因转染的3T3细胞有人iNOS基因mRNA和iNOS蛋白的表达。结论：iNOS基因能在3T3成纤维细胞得到稳定转染和表达，能为模拟体内一氧化氮(N0)作用提供有力的工具。     

miRNA-31在高糖诱导内皮细胞功能障碍中的作用

目的 探讨miRNA-31在高糖诱导的内皮细胞功能障碍中的作用机制.方法 体外培养人冠状动脉内皮细胞系,不同浓度高糖刺激24h后检测细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达及培养上清液NO含量;Real-time PCR检测高糖刺激后miRNA-31表达变化;microRNA在线分析软件预测并应用双荧光素酶报告基因系统和Western blot验证eNOS是否为miRNA-31的直接靶基因;通过转染miRNA-31 antagomir观察miR-NA-31对内皮细胞功能障碍的影响.结果 不同浓度的高糖刺激内皮细胞24h后,eNOS蛋白表达和培养液NO含量呈剂量依赖性下降.高糖刺激内皮细胞miRNA-31表达明显增加.microRNA在线分析软件及双荧光素酶报告基因实验提示eNOS的翻译水平受miRNA-31直接调控.转染miRNA-31 antagomir明显上调高糖刺激后内皮细胞eNOS蛋白和培养液NO含量.结论 miRNA-31上调进而抑制eNOS表达可能是高糖诱导内皮细胞功能障碍的作用机制之一.