内皮型一氧化氮合酶基因在犬内皮细胞的转染和表达

目的探讨转染内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因后内皮细胞(EC)的功能变化。方法采用脂质体法转染eNOS基因于实验犬EC;RT-PCR和免疫组化法检测转染效果;分别采用比色法和酶联免疫法检测细胞培养液一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)和vWF的浓度;并观察转染细胞生长增殖情况。结果RT-PCR产物电泳和测序及免疫组化法检测证实转染效果满意;转染后EC培养液NOS和NO浓度在不同时间明显升高(120h分别为33.53和32.99),与正常组对比差异显著(P<0.05)。转染后细胞生长增殖和vWF含量无显著差异。结论通过脂质体法成功地将eNOS基因转染于实验犬EC;转染后eNOS基因在mRNA和蛋白质水平均高效表达;内皮细胞eNOS活性显著增强;转染后细胞生物学功能稳定。     

内皮型一氧化氮合酶基因转染犬骨髓源内皮祖细胞的实验研究

目的:探讨人内皮型一氧化氮合酶(heNOS)基因转染犬内皮祖细胞(EPCs)的有效方法?方法:分别用5型腺病毒和pEGFP-N1质粒作为载体携带heNOS,对体外定向培养扩增的骨髓来源的犬EPCs进行体外转染,然后对转染heNOS基因后的EPCs进行鉴定及功能检测,观察heNOS基因的功能表达情况?结果:heNOS转染犬EPCs 48 h后,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测到5型腺病毒转染组EPCs的eNOS表达量(2 091.67 ± 172.49 pg/ml)较pEGFP-N1质粒转染组(173.67 ± 36.76 pg/ml)和未转染组(158.00 ± 30.91 pg/ml)均显著增多(P < 0.01);硝酸还原酶法测定5型腺病毒转染组细胞培养上清中的NO含量(49.5 ± 5.2 μmol/L)较质粒转染组(38.5 ± 7.1 μmol/L)和未转染组(39.7 ± 7.2 μmol/L)均显著增多(P < 0.01)?结论:5型腺病毒载体介导的heNOS基因能够成功地转染犬EPCs,并能在EPCs中有效表达?     

内皮型一氧化氮合酶基因转染预防PTCA术后再狭窄

经皮腔内冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)已广泛应用于冠心病的治疗。但是术后25％～50％发生再狭窄制约其发展。近年来随着PTCA术后病理生理机制的逐渐明确，内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因转染已应用于再狭窄预防，本文就eNOS与PTCA术后再狭窄简要综述如下。     

诱导型一氧化氮合酶基因在313细胞中的转染和鉴定

目的：观察人诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因转染3T3成纤维细胞的可能性。方法：用阳性脂质体将含人iNOS基因的真核表达载体pcDNA3．0-iNOS转染至3T3成纤维细胞，用G418筛选，通过RT-PCR、免疫组化的方法鉴定。结果：pcDNA3．0-iNOS基因转染的3T3细胞有人iNOS基因mRNA和iNOS蛋白的表达。结论：iNOS基因能在3T3成纤维细胞得到稳定转染和表达，能为模拟体内一氧化氮(N0)作用提供有力的工具。     

中国汉族人内皮细胞型一氧化氮合酶基因多态性研究

目的:探讨内皮细胞型一氧化氮合酶(eNOS)基因(CA)n二核苷酸重复序列基因多态性在中国汉族人群中的分布.方法:应用聚合酶链反应结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色,对291名中国汉族人的eNOS基因(CA)n多态性进行研究.结果:eNOS基因(CA)n存在23种等位基因和93种基因型,基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05).PCR扩增片段长度范围为144bp～188bp,所含CA重复次数分别为19～41,分布频率介于0.34%～14.1%.该位点杂合度为0.85,多态信息量(PIC)为0.83.中国人群与高加索人群差异显著的11个等位基因分别为(CA)22、(CA)23、(CA)26、(CA)27、(CA)28、(CA)30、(CA)31、(CA)32、(CA)33、(CA)34、(CA)35,x2检验P均＜0.05.结论:该基因位点是1个含有高度遗传信息的DNA标志,其等位基因频率分布存在种族差异.     

人血管内皮细胞生长因子165基因转染大鼠内皮祖细胞的实验研究

目的探讨人血管内皮细胞生长因子165（hVEGF165）基因转染骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对其影响。方法体外分离、培养、鉴定大鼠骨髓EPCs,ELISA检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测对其增殖的影响。结果FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs增殖,注射转基因EPCs的大鼠皮下局部血管增加。结论hVEGF165基因可成功转染EPCs,并且具有血管内皮增殖刺激活性,为进一步研究hVEGF165基因修饰EPCs治疗血管内膜损伤性疾病提供实验依据。     

诱导型一氧化氮合酶基因在3T3细胞中的转染和鉴定

目的 :观察人诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)基因转染 3T3成纤维细胞的可能性。　方法 :用阳性脂质体将含人iNOS基因的真核表达载体pcDNA3.0 iNOS转染至 3T3成纤维细胞 ,用G4 18筛选 ,通过RT PCR、免疫组化的方法鉴定。　结果 :pcDNA3.0 iNOS基因转染的 3T3细胞有人iNOS基因mRNA和iNOS蛋白的表达。　结论 :iNOS基因能在 3T3成纤维细胞得到稳定转染和表达 ,能为模拟体内一氧化氮 (NO)作用提供有力的工具。     

降钙素基因相关肽基因体外转染人脐静脉内皮细胞

目的 观察逆转录病毒载体介导的降钙素基因相关肽（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎｇｅｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅ，ＣＧＲＰ）基因对人脐静脉内皮细胞的作用，探讨其应用于动脉粥样硬化和经皮腔内冠状动脉成形术后再狭窄基因治疗的可行性。方法 构建含有ＣＧＲＰｃＤＮＡ的逆转录病毒载体，体外转染人脐静脉内皮细胞，用ＲＴ－ＰＣＲ及放射免疫法分析检测基因表达水平，应用细胞计数及流式细胞仪观察ＣＧＲＰ基因对内皮细胞生长的     

诱导型一氧化氮合酶基因在3T3成纤维细胞中的转染和意义

目的观察人诱导型一氧化氮合酶基因(iNOS)转染3T3成纤维细胞的可能性.方法用阳性脂质体将含人诱导型一氧化氮的真核表达载体pcDNA3.0-iNOS转染至3T3细胞,用G418筛选,通过RT-PCR、免疫组化的方法鉴定.结果 pcDNA3.0-iNOS基因转染的3T3细胞有人iNOS基因mRNA的表达,细胞中有iNOS蛋白的表达,空载体和对照组没有表达.结论人iNOS基因能够在3T3成纤维细胞得到稳定转染和表达.     

内皮型一氧化氮合酶基因多态性与脑梗死的研究

一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)的一个重要指征是不仅合成一氧化氮(Nitric Oxide，NO)，也能产生超氧离子。目前已确定的NOS的亚型有三种，根据不同的基因编码分别称为神经元型NOS(neuronal NOS，nNOS)、诱导型NOS(inducibl eNOS，iNOS)、内皮型NOS(endothel ialNOS，eNOS)。三种NOS亚型在血管内皮细胞中均可表达，但在生理情况下，血管内皮细胞中的eNOS合成和释放NO无疑是血管张力的主要调节因子。而nNOS与iNOS产生的NO则主要产生氧化作用，具神经毒性作用。     

低氧对肺动脉内皮细胞一氧化氮合酶及细胞间黏附因子-1表达的影响

目的通过检测低氧状态血管内皮细胞一氧化氮合酶（eNOs）及细胞间黏附因子（ICAM1）表达的变化．探讨低氧对血管内皮细胞功能的影响。方法采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）及Western blot测定低氧条件下不同时间点大鼠动脉内皮细胞中eNOS、ICAM-1 mRNA及蛋白质的表达变化情况。结果同常氧组相比，低氧1h时eNOS、IcAM-1 mRNA及蛋白表达无变化．而6、12、24h时eNOS、ICAM-1mRNA及蛋白表达明显升高（P〈0.05），但eNOS mRNA与ICAM-1mRNA的表达变化在同一时间点并不一致。结论低氧状态下血管内皮细胞eNOS与ICAM-1表达升高，可能参与了低氧性肺血管疾病的发病机制。     

加味小陷胸汤含药血清对BAECs增殖及eNOS表达的影响

目的:观察加味小陷胸汤含药血清对牛主动脉内皮细胞(BAECs)的保护作用。方法:以原代培养的牛主动脉内皮细胞为研究对象,采用MTT法检测细胞生长活性,WesternBlot法检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达。结果:一定浓度(5%、10%、15%)的加味小陷胸汤含药血清能明显促进牛主动脉内皮细胞增殖和eNOS蛋白表达,高浓度(20%)的加味小陷胸汤含药血清能抑制细胞增殖和eNOS蛋白表达。结论:加味小陷胸汤可通过促进牛主动脉内皮细胞增殖和eNOS的表达而起到保护血管内皮细胞的作用。     

脂质体介导转染培养细胞的基因表达及转染程序的简化

目的：以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）作为报道基因，观察脂质体介导转染培养细胞后基因的表达时间和表达效率，并探讨简化转染程序的影响。方法：用MCF-7细胞分别以无血清和低血清转染PEGFP—C2,从转染后4h开始，每隔1h在荧光显微镜下观察。结果：用无血清和低血清转染的转染效率无明显区别，5～6h开始表达，20～24h达到最强，48h荧光未见减弱，72h仍可见荧光。结论：血清不影响转染效率。能简化转染程序。基因在转染5h后开始表达，暗示转染10h后，基因表达可能属于其相关基因表达产物对细胞生理活动的刺激影响。     

LacZ基因在哺乳动物细胞中的稳定表达及其检测方法

目的：构建含有LacZ标记基因的真核表达载体和稳定表达LacZ的转基因细胞，并建立简易有效的检测方法。方法：采用脂质体转染法将装有LacZ基因的真核表达载体pcDNA3导入鼠成纤维细胞L929，G418筛选LacZ基因稳定表达细胞株，并应用超声波破碎和贴壁细胞悬浮培养的方法来检测转基因细胞的转染率及目的蛋白的表宕。结果：成功构建了稳定表达LacZ基因的转基因细胞，超声波破碎后其上清与β－半乳糖苷酶（LacZ）的底物X－gal反应显兰色；辅有固体琼脂粉的平皿中细胞培养至第4天开始显兰色，并随时间的延长，比率增加，最终可高达100％。结论：LacZ基因在哺乳动物细胞中可稳定表达，建立的检测方法具有简单及重复性好的特点。     

人骨髓间充质干细胞与血管内皮细胞的基因表达差异分析

目的探索人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的分子生物学机制及调控靶标。方法应用基因表达谱芯片技术,检测人骨髓间充质干细胞和脐静脉内皮细胞的基因表达差异。结果在检测的3946条基因中,人骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞非差异表达基因占84%。差异表达基因中,间充质干细胞高表达283条,低表达344条。这些基因可以划分为5个主要的功能群:①细胞骨架和运动蛋白基因;②细胞受体相关基因;③细胞信号和传递蛋白相关基因;④发育相关基因;⑤蛋白翻译、合成相关基因。结论人骨髓间充质干细胞有潜在的内皮分化能力,分化机制和分化调控与以上五类特异基因的表达有关。     

VEGFR-3基因转染淋巴管内皮祖细胞后可溶性VEGFR-3蛋白的分泌

目的 研究携带BABL/c小鼠VEGFR-3(1-3Ig)基因的重组腺病毒转染淋巴管内皮祖细胞(LEPCs)后,对可溶性VEGFR-3蛋白分泌及其生物学特性的作用.方法 采用巢式RT-PCR技术从BABL/c小鼠胎盘组织中扩增VEGFR-3(1-3Ig)的编码基因,并通过重组PCR技术在基因的N端加上人CD33的信号肽.将该基因片段亚克隆入腺病毒表达载体(pDC316-IRES-EGFP),重组质粒经酶切及测序验证后,与包装质粒共转染293细胞以产生重组腺病毒.将构建好的携带有小鼠VEGFR-3(1-3Ig)基因的重组腺病毒转染淋巴管内皮祖细胞,通过ELISA检测转染细胞上清液中可溶性VEGFR-3蛋白的分泌及其对VEGF-C的中和作用.结果 成功构建了带有信号肽的BABL/c小鼠VEGFR-3(1-3Ig)基因的腺病毒表达质粒,并获得高滴度的携带有小鼠VEGFR-3(1-3Ig)基因的重组腺病毒,重组腺病毒转染淋巴管内皮祖细胞后,可使转染细胞分泌可溶性VEGFR-3蛋白,该蛋白具有中和VEGF-C的作用.结论 成功地制备了携带BABL/c小鼠VEGFR-3(1-3Ig)基因的重组腺病毒,用该病毒转染淋巴管内皮祖细胞可使其分泌可溶性VEGFR-3,该蛋白在体外具有中和VEGF-C的作用,这为临床抑制肿瘤淋巴管新生奠定了基础.     

Bmi-1基因表达与血管内皮细胞衰老的相关性

目的:探讨Bmi-1基因与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)衰老的相关性,为研究血管内皮细胞衰老的分子机制打下基础。方法:采用细胞传代及肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激方法模拟内皮细胞衰老,用SA-β-半乳糖酐酶(SA-β-gal)染色检测衰老,Real-time PCR检测P16INK4A及Bmi-1基因的表达变化。结果:随着细胞传代次数的增加,HUVECs体积变大,细胞浆内颗粒和空泡增多,β-gal阳性染色率显著增多,P16INK4A mRNA表达逐渐升高(第6、8代与第1代相比P<0.05),同时Bmi-1 mRNA表达下降(第2、4、6、8代与第1代相比均P<0.05)。TNF-α(10 ng/mL)孵育HUVECs 48 h,与对照组相比,P16INK4A mRNA表达明显增加(P<0.05),Bmi-1 mRNA表达下降(P<0.05)。结论:Bmi-1在衰老内皮细胞中表达显著降低,提示其在血管内皮细胞衰老发生发展中起重要作用。     

bcl-2基因克隆、转染及其在PC12细胞中的表达

【目的】研究bcl 2基因 (bcl 2 )在PC12细胞中的表达。【方法】构建真核表达载体pcDNA3 bcl 2 ,采用脂质体介导将重组质粒导入PC12细胞 ,Westernblot和原位免疫组化检测外源基因表达。【结果】本实验成功构建了真核表达载体pcDNA3 bcl 2 ,并用脂质体介导的方法获得了稳定表达bcl 2的细胞克隆 ;Westernblot显示有 2 6ku的蛋白质表达 ,bcl 2单克隆抗体免疫组化染色呈阳性反应。【结论】重组质粒 pcDNA3 bcl 2经转染能够在PC12细胞中有效表达 ,为进一步研究 bcl 2对PC12细胞的生物学功能奠定了基础。     

转染反义寡核苷酸对人胆管癌QBC939细胞XIAP基因表达及细胞周期作用的实验研究

目的研究转染反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN）对人胆管癌细胞株QBC939细胞凋亡抑制蛋白基因（X-linked inhibitor of apoptosisprotein,XIAP）表达的抑制作用及对细胞周期凋亡的影响．方法脂质体介导ASODN瞬时转染QBC939细胞,荧光显微镜观察ASODN转染入细胞的情况,并计算转染率;RT—PCR检测转染前后XIAPmRNA表达的变化;流式细胞仪检测转染后细胞周期的变化和凋亡率．结果转染后24h可达到最佳的转染效果;ASODN组的XIAP基因水平明显低于对照组（P〈0．05）,流式结果显示转染后QBC939G0／G1期细胞高于阴性对照组,凋亡率高于对照组（P〈0．05）．结论脂质体介导转染ASODN能特异性地抑制QBC939细胞中的XIAP基因表达,使其发生G0／G1期阻滞,并诱导胆管癌细胞凋亡,有望成为胆管癌基因治疗新的靶点．