胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长

目的探讨小鼠胚胎干细胞(mESCs)来源的饲养细胞是否具备支持自体mESCs未分化生长的能力。方法先诱导mESCs形成类胚体(EB),进一步诱导其分化为成纤维细胞(mEB-dFE),以用作饲养细胞。采用形态学、集落形成率、细胞分化率、免疫细胞化学、碱性磷酸酶染色和RT-PCR对生长在mEB-dF上的mESCs的未分化特性进行鉴定。采用RT-PCR和诱导mESCs体内外分化方法鉴定mESCs多分化潜能特性。结果从EB三个发育阶段(EB贴壁10、15、20 d)分离出48个mEB-dF系,其中5个(来自15 d的EB)能维持mESCs未分化生长和多潜能性达10代以上。生长在这种饲养层上的mESCs与生长在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上一样,其特性无明显差异,均表达碱性磷酸酶和特殊的mESCs标记,包括SSEA-1、OCT-4、NANOG,在体外形成EB和体内形成畸胎瘤;其他43个mEB-dF系则不具有这种能力。结论研究不仅为mESCs体外培养提供了一种新的饲养细胞,避免了MEF作饲养细胞的许多不足;而且还提示mESCs可诱导出不同功能的成纤维样细胞,其差异的分子机制值得进一步研究。     

小鼠胚胎干细胞无饲养层培养及其生物学特性

目的建立小鼠胚胎干（ES）细胞株S8在无饲养层的条件下短期内连续传代体系,获得大量纯的ES细胞。方法ES-S8细胞无饲养层连续传代后,检测其未分化指标以及多分化潜能。结果ES-S8细胞在无饲养层条件下培养5代,AKP染色、SSEA-1免疫荧光、OCT-4均显阳性,以及经拟胚体（EB）途径自发分化后,能形成多种类型的细胞。结论ES-S8细胞能够在无饲养层条件下培养,至少传5代仍能保持未分化特异性指标和多分化潜能。     

人脐带间充质干细胞作为维持人胚胎干细胞生长饲养层细胞的研究

目的寻找可以维持人胚胎干细胞未分化生长的人源性细胞作为饲养层细胞,从而解决使用鼠源性细胞作为饲养层带来的安全问题。方法尝试以人脐带间充质干细胞作为饲养层细胞来培养人胚胎干细胞,检验其是否可以维持人胚胎干细胞的未分化生长状态。用胶原酶消化法分离人脐带间充质干细胞,光镜下观察细胞形态;流式细胞仪检测其表面标志;诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞进行分化。将人胚胎干细胞系H1接种于丝裂霉素C灭活后的人脐带间充质干细胞上,每隔5d进行一次传代。培养20代后,对人胚胎干细胞特性进行相关检测,包括细胞形态、碱性磷酸酶染色、相关多能性基因的表达、分化能力。结果从人脐带中分离出的间充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞高表达CD44、CD29、CD73、CD105、CD90、CD86、CD147、CD117,不表达CD14、CD38、CD133、CD34、CD45、HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能。人胚胎干细胞在人脐带间充质干细胞饲养层上培养20代后,继续保持人胚胎干细胞的典型形态,碱性磷酸酶染色为阳性,免疫荧光染色显示OCT4、Nanog、SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60的...     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的 为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞.方法 以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1.传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能.结果 hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长.经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织.结论 SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能.     

不同饲养层细胞对胚胎干细胞和内细胞团的影响

目的探讨不同饲养层细胞对小鼠胚胎干细胞（ESC）和兔囊胚内细胞团（ICM）的影响。方法分别用成系小鼠胚胎成纤维细胞（SNL）、兔胚胎成纤维细胞（REF）、兔肾脏成纤维细胞（RRF）作为饲养层饲养小鼠ESC和兔囊胚，观察它们的生长状态，并分别检测其碱性磷酸酶活性。结果生长在REF上的小鼠ESC具有最显著的未分化形态，保持未分化时间最长．碱性磷酸酶活性最强。在REF上呈聚集生长的兔囊胚ICM的比例最高。结论REF能维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态及促进兔囊胚ICM聚集生长，可以作为ESC的饲养层细胞。     

小鼠胚胎干细胞饲养层制备条件的研究

目的:建立稳定高效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于分离克隆胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞).方法:取妊娠13.5～14.5d的胎鼠,采用组织消化法结合组织块培养法分离、培养小鼠成纤维细胞;MTT法测定细胞生长曲线,结合倒置显微镜观察筛选小鼠成纤维细胞饲养层的最佳种植密度;MTT法筛选丝裂霉素c作用的最佳浓度和时间.取妊娠3.5d的小鼠囊胚在经丝裂霉素C处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞生长情况.结果:组织消化法结合组织块培养法是分离培养小鼠成纤维细胞的较好的方法;1 × 105～2×105个/ml种植密度适于饲养层铺板;丝裂霉素c 10μg/ml作用3.5h或20μg/ml作用2.5h能抑制成纤维细胞增殖,细胞至少在7d内维持稳定的水平;妊娠3.5d小鼠囊胚在饲养层上培养能形成Es集落.结论:制备的胎鼠成纤维细胞饲养层能有效地支持小鼠胚胎干细胞的生长.     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备

目的：探讨小鼠胚胎干细胞饲养层细胞的制备。方法：小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞培养胚胎干细胞。另在无饲养层细胞培养液中,含白血病抑制因子条件下培养小鼠胚胎干细胞,观察两种情况下胚胎干细胞的生长情况。结果：小鼠胚胎成纤维细胞呈放射状或旋涡状走行,胚胎干细胞呈克隆状生长。结论：胚胎干细胞能良好生长,且保持未分化状态。     

人成纤维细胞饲养层的制备及其对胚胎干细胞生长支持作用

 目的 为建立不含动物细胞成分的人胚胎干细胞( human embryonic stem cell, hESc)体外培养系统,本实验欲用人包皮成纤维细胞(human postnatal foreskin fibroblasts, hPFF)制备细胞饲养层并观察其对hESc体外生长的支持功能及生物学特性的维持作用。方法 利用儿童阴茎包皮环切术后遗弃包皮组织分离培养成纤维细胞,纯化增殖细胞,采用35Gyγ射线照射灭活法制备成饲养层。将hESc（HS181细胞株）接种在该饲养层上,连续传代至20代,倒置显微镜观察其形态学变化,测定其细胞碱性磷酸酶活性,类胚体形成实验及干细胞转录因子表达,严重联合免疫缺陷的小鼠(severe combined immune deficiency mice, SCID)体内畸胎瘤形成及体内全能分化特性实验对hESc生物学特性进行鉴定。 结果 hPFF体外培养过程中生长增殖旺盛,连续传20代以上能保持正常细胞形态学和生物学特性。经γ射线照射使其停止增殖,24h内能较好地保持细胞活力和形态学特征,具备饲养层细胞基本条件。HS181 hESc在hPFF上传到20代任能较好地保持未分化状态,细胞呈克隆性生长,高度表达碱性磷酸酶及Oct-4、Nanog等胚胎干细胞转录因子;悬浮法培养连续传20代的hESc可获得由3个胚层细胞所形成的类胚体（Embryoid bodies, EB）结构, 可检测到CD90、Flt-1、Nestin基因的表达,证明得到的类胚体中含了3个胚层细胞,说明hESc具有体外多能干性特征。体内全能分化实验显示：将第20代的hESc接种到SCID小鼠体内,6周后可形成畸胎瘤,组织学切片分析其包含了源于全部3个胚层的各种分化细胞,直接证明其具有体内多向分化的全能性。结论 hPFF可作为一种来源丰富,取材方便的人源化饲养层细胞,能有效地支持hESc体外生长。克服了目前hESc建系和体外培养过程中使用动物细胞饲养层带来的异种蛋白污染和致病微生物的危险,初步解决了hESc临床应用的生物安全性问题。     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备及两种不同饲养层的比较

目的探讨建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，用于胚胎干细胞的培养。方法取孕10．5～18．5d的昆明小鼠胚胎，用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，在体外培养体系中，观察细胞在增殖，传代，冻存及复苏等方面的条件；取购买的小鼠胚胎成纤维细胞系制成饲养层，比较两种细胞用于制备饲养层在胚胎干细胞培养方面的优缺点。结果（1）12．5～14．5d的胎鼠最适合于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，所分离的细胞含杂细胞最少，细胞较多，繁也快；（2）在37℃，0．25％胰酶-0．02％EDTA的混合消化液消化时间最好为3～5min，此时消化下的细胞最多，活力最好；（3）原代细胞平均培养4d即可传代，丝裂霉素-C抑制成纤维细胞增殖的合适浓度为10～20μg／mL（4）原代小鼠胚胎成纤维细胞较小鼠胚胎成纤维细胞系更适合于制备饲养层。结论原代小鼠胚胎成纤维细胞及小鼠胚胎成纤维细胞系均可用于制备饲养层。     

血管内皮细胞作为饲养层细胞对胚胎干细胞的生长支持作用

目的:探讨人脐静脉血管内皮细胞是否可作为饲养层来支持胚胎干细胞的生长,并维持其未分化状态.方法:使用健康产妇剖宫产后遗弃的脐带培养内皮细胞,并进行细胞传代培养和增殖扩增.将脱离饲养层克隆生长良好的E14.1胚胎干细胞接种到经丝裂霉索C(10 mg/L)灭活后的2～5代内皮细胞饲养层上进行传代培养,对培养的胚胎干细胞进行碱性磷酸酶、Oct-4及体内全能分化实验鉴定.结果:E14.1胚胎干细胞在人脐静脉内皮细胞上传3～8代后能较好地保持未分化状态,高度表达碱性磷酸酶及干细胞因子Oct-4;体内全能分化实验显示,在内皮细胞上生长6代和10代以上的E14.1胚胎干细胞被接种到裸鼠6周后,形成含三个胚层的组织细胞畸胎瘤.结论:(1)人脐静脉血管内皮细胞可作为饲养层支持胚胎干细胞的生长;(2)胚胎干细胞在内皮细胞上能保持未分化状态;(3)人脐静脉血管内皮细胞可以作为一种来源丰富,取材方便的人源化饲养层细胞新来源,为胚胎干细胞的临床应用奠定了基础.     

大鼠胚胎干细胞饲养层制作方法的改进

目的 采用两种方法制备饲养层细胞,对比观察培养效果,求得最佳培养方法,以期实现其有效利用。方法 取大鼠胚胎分离成纤维细胞,分别采用细胞悬液法和胰酶消化植块培养法对其进行培养。在生长细胞形态,活细胞百分率等方面对两种方法进行比较。结果 胰酶消化植块培养法在细胞获得量、细胞活力和贴壁细胞的形态上均优于常规的细胞悬液法,且操作简单,速度快。结论 胰酶消化植块培养法是一种能够获得高成活率、高收获量、细胞形态和生长状况良好的体细胞培养方法。     

不同滋养层对维持人胚胎干细胞的生长作用

目的 比较不同滋养层对保持连续传代培养的人胚胎干细胞(hESC)不分化和高增殖能力作用的差异.方法 分别用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、人包皮成纤维细胞(hFF)、人骨髓间充质细胞(hMSC)作为滋养层培养hESC系H9细胞,采用碱性磷酸酶染色和台盼蓝染色观察不同滋养层支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量和细胞存活率,并采用免疫荧光染色对传代5代以后的hESC进行生物学鉴定.结果 3种滋养层细胞均可维持hESC呈克隆样生长,但是不同滋养层支持的克隆的形态差异大.3种滋养层细胞支持的hESC的大鼠抗阶段特异性胚胎抗原-3及碱性磷酸酶染色均呈阳性.MEF支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量和细胞存活率均显著高于人来源滋养层(均P<0.01).hMSC支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量均显著高于hFF的hESC(均P<0.01).结论 3种滋养层细胞均可支持hESC的正常生长.MEF最有利于hESC的增殖,但是两种人来源滋养层细胞为去除动物源性的hESC培养体系奠定了基础.在维持hESC增殖方面,hMSC优于hFF.     

无血清无饲养层条件下培养小鼠胚胎干细胞

目的 研究在无血清无饲养层条件下小鼠胚胎干细胞的培养方法,为最终建立无血清无饲养层培养系统打下基础.方法 比较小鼠胚胎于细胞ES-S8株在无血清培养体系和有血清培养体系中的生长情况,分析ES-S8细胞克隆形成效率,测定其生长速度;然后在撤去血清和饲养层的条件下培养ES-S8细胞,进行AKP染色和表面标记物SSEA-1免疫荧光检测.结果 ES-S8细胞在无血清培养条件下细胞生长速度减缓,克隆形成率降低,但AKP染色、SSEA-1免疫荧光均显阳性;在无血清无饲养层条件下ES-S8细胞培养仍能形成克隆,且AKP染色、SSEA-1免疫荧光均显阳性.结论 研究表明ES-S8细胞能够在无血清无饲养层的培养条件下生长,保持其良好的未分化特性.     

人胚胎干细胞源性表皮样干细胞分化潜能

[目的]探讨人胚胎干细胞源性表皮样干细胞的分化潜能,为研究其分化的调控机制及寻找新的人皮肤组织工程种子细胞奠定基础.[方法]将人胚胎干细胞与人羊膜共培养 4 d,定向诱导其分化为表皮样干细胞克隆,用胰酶消化后移植裸鼠皮下 20 d、 30 d及 50 d.对移植后细胞的分化情况进行了形态学和免疫组织化学观察分析.[结果]人胚胎干细胞源性表皮样干细胞在裸鼠皮下 20～ 30 d后,细胞分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状或泡状结构,它们可分别呈 CEA和 CK18阳性.种植 50 d后,除上述结构外,可见角化复层扁平上皮、毛囊样、汗腺样及皮脂腺样等结构.[结论]研究结果提示人胚胎干细胞源性表皮样干细胞具有分化为角化复层扁平上皮及毛囊样、汗腺样和皮脂腺样等结构的潜能.     

用密度梯度离心法富集源于小鼠胚胎干细胞的运动神经元样细胞前体（英文）

目的：我们的目标是从源于胚胎体（EBs）的小鼠胚胎干细胞（mESCs）中分离运动神经元样细胞前体（MNLCPs）,以用于发展针对运动神经元疾病的药物筛选试验和移植疗法。天然Shh蛋白（或Shh通路激动剂）和维甲酸诱导的胚胎体中,MNLCPs和未分化细胞的含量是不确定的。如果不把未分化的细胞从细胞培养中充分去除,其可能会干涉药物筛选试验或在移植后增生。我们开发了一种以密度梯度离心法为基础的富集MNLCPs的方法。方法：我们用Wichterle等人2008年改进的方法,将mESCs（HBG3：eGFP：HB9）扩大和分化。通过化学和酶学的无研磨处理,含有绿色荧光蛋白的MNLCPs和未分化细胞的胚胎体被小心轻轻地离解成单细胞。利用OptiprepTM8%~20%逐步梯度离心技术将MNLCPs回收。拥有绿色荧光蛋白的MNLCPs的含量由流式细胞仪检测。结果：我们的结果表明,在胚胎体形成前,mESCs在明胶包被的培养板上生长,其分化为MNLCPs的能力减少。比较mESCs在明胶,明胶与PMEFs,及PMEFs包被的培养板上的生长发现,mESCs在PMEFs包被的培养板上产生含绿色荧光蛋白的MNLCPs的得率为（54.1±11.0）%（x±s;n=12）,在明胶包被的培养板上的得率为（2.8±1.1）%（x±s;n=9）。用密度梯度离心法获得的含绿色荧光蛋白的MNLCPs的平均含量为（87.7±5.5）%（x±s;n=3）。结论：我们的数据表明,不使用细胞分选器,无研磨解离和密度梯度离心法也能用于富集具有高存活率的MNLCPs。有必要对MNLCPs在体外、体内和表型上进行进一步的生理学意义（如神经轴突的生长及形成神经肌肉接头的能力）上的鉴定。