微载体cytodex 3大量扩增成人骨髓间充质干细胞的初步研究

目的建立一种体外分离、大量扩增培养成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的方法。方法用Percoll梯度离心结合贴壁法分离hMSCs,用微载体cytodex 3培养hMSCs,以普通单层聚苯乙烯(TCPS)培养作对照,用流式细胞仪(FCM)和MTT法对其细胞表型和增殖活性检测。结果①梯度离心结合早期换液是分离hMSCs的较好方法,FCM检测表明hMSCs表面表达CD29、CD44和CD105,而不表达CD14、CD34、CD45、VLA-1和HLA-DR。hMSCs细胞周期分布显示:G0/G1期(86.4±3.8)%,S G2 M期(13.6±4.2)%;②hMSCs与cytodex 3有良好的相容性,MTT法表明hMSCs在cytodex 3表面悬浮生长时具有比普通单层TCPS培养时更高的数量和增殖活性,FCM分析表明两者的细胞表型和细胞周期分布相同,无显著性差异(P>0.05)。结论微载体cytodex 3培养方法是扩增组织工程种子细胞hMSCs的有效方法。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养和表型鉴定

目的建立成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的分离培养方法,并对其表面标志进行检测,研究骨髓间质干细胞(MSC)基本生物学特性.方法采用Percoll(1.073 g/mL)梯度离心分离hMSCs,体外扩增,流式细胞仪检测hMSCs表面抗原表达.结果成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代及传代培养显示,hMSCs具有活跃增殖的能力,每10 mL骨髓可获得(1.25±0.56)×106个原代细胞,7代可获得(5.32±1.15)×1010个细胞(n=5),随着传代次数的增加,细胞的增殖能力下降.流式细胞仪检测生长良好的第3代hMSC显示CD29、CD44、CD106、CD105、CD166、HLA-A/B/C表达阳性,CD34、CD45、CD14、CD31、CD49d、CD54、HLA-DR/DP/DQ表达为阴性.细胞周期分析显示,hMSCs中,S+G2+M期的细胞约占(16.25±3.18)%,其中S期为(4.12±2.35)%;而处于G0+G1期的细胞总数占(76.35±5.28)%,说明大部分细胞仍然处于静止期.流式细胞仪检测表明分离的hMSCs具有间充质干细胞的特征.结论 hMSCs有很强的自我更新能力,在体外传代培养可维持良好的干细胞生物学特性,为进一步深入研究hMSCs作为组织工程种子细胞的应用提供参数.     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养和表型鉴定

目的 建立成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的分离培养方法,并对其表面标志进行检测,研究骨髓间质干细胞(MSC)基本生物学特性。方法 采用Percoll(1.073 g/mL)梯度离心分离hMSCs,体外扩增,流式细胞仪检测hMSCs表面抗原表达。结果成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代及传代培养显示,hMSCs具有活跃增殖的能力,每10 mL骨髓可获得(1.25±0.56)×106个原代细胞,7代可获得(5.32±1.15)×1010个细胞(n=5),随着传代次数的增加,细胞的增殖能力下降。流式细胞仪检测生长良好的第3代hMSC显示CD29、CD44、CD106、CD105、CD166、HLA-A/B/C表达阳性,CD34、CD45、CD14、CD31、CD49d、CD54、HLA-DR/DP/DQ表达为阴性。细胞周期分析显示,hMSCs中,S+G2+M期的细胞约占(16.25±3.18)％,其中s期为(4.12±2.35)％;而处于G0+G1期的细胞总数占(76.35±5.28)％,说明大部分细胞仍然处于静止期。流式细胞仪检测表明分离的hMSCs具有间充质干细胞的特征。结论 hMSCs有很强的自我更新能力,在体外传代培养可维持良好的干细胞生物学特性,为进一步深入研究hMSCs作为组织工程种子细胞的应用提供参数。     

模拟微重力环境促进人间充质干细胞体外高效增殖

目的观察人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)在模拟微重力环境中的体外增殖情况.方法在旋转细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)模拟的微重力环境中,用Cytodex-3微载体技术培养hMSCs,通过相差显微镜、细胞计数、MTT法、CCK-8(cell counting Kit-8)观察检测hMSCs的增殖状况.结果试验组hMSCs较平皿培养组延长指数生长期提高2倍,细胞增殖速度提高近2倍,培养密度增加15.8倍.结论模拟微重力环境能促进hMSCs的体外增殖速度,利于体外规模化扩增组织工程的种子细胞.     

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为脂肪细胞方法的建立

目的：分离和培养人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,并在体外定向诱导hMSCs分化为脂肪细胞。方法：利用Percoll梯度分离法、贴壁筛选法及单克隆培养法,分离、培养、扩增hMSCs;应用地塞米松、吲哚美辛、IBMX及胰岛素定向诱导hMSCs分化为脂肪细胞。结果：体外分离、培养出高度同源性的hMSCs,hMSCs具有独特的细胞免疫学表型,即CD73、 CD105、CD166、CD90及CD44阳性,CD34、CD31及CD45阴性。诱导3 d后,hMSCs细胞内有小脂滴出现,诱导2周后,脂滴数量增加并相互融合,细胞由长梭形变为圆形或多边形。结论：成功建立hMSCs分离培养方法,体外定向诱导hMSCs分化为脂肪细胞。     

人胎盘源间充质干细胞对T细胞周期及其活化的抑制作用研究

目的 探讨人胎盘源间充质干细胞(hPMSCs)对T细胞增殖抑制作用机制,为其在临床细胞治疗中的应用提供理论依据.方法 应用消化法分离、培养hPMSCs,体外扩增培养3代后用于实验.应用流式细胞术分析hPMSCs对PHA激发下T细胞周期和早期表型CD25、CD69表达的影响,ELISA法检测细胞因子水平.结果 hPMSCs体外可使PHA刺激下的T细胞滞留于细胞周期的G0/G1期,下调活化T细胞早期表型CD25、CD69的表达,抑制IL-2、IFN-r的分泌.结论 hPMSCs体外可通过对T细胞周期的影响抑制其活化和增殖.     

大鼠骨髓间充质干细胞的无血清培养与鉴定

目的探索大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外分离纯化、培养、扩增及鉴定方法,为MSCs后续研究提供种子细胞。方法采用Percoll密度梯度离心法和贴壁法相结合分离纯化MSCs并传代,在无血清组和有血清组培养基DMEM/F12中培养,传代扩增。倒置相差荧光显微镜下观察两组细胞生长特性和形态,采用MTT(噻唑蓝)法检测增殖水平并绘制生长曲线,检测两组细胞周期。分别取两组细胞第三代MSCs,采用流式细胞仪检测细胞表型。结果无血清组培养基培养9~10 d有明显的细胞丛生长,略晚于有血清组的7~8 d;MTT测定生长曲线显示两组细胞增殖能力相似;流式细胞仪检测两组培养方式下细胞均表达CD29、CD54,不表达CD34、CD45;细胞周期检测显示无血清组G0/G1期细胞为68.0%,明显高于有血清组的46.4%,两组差异有显著性。结论无血清培养基的条件能较好地使细胞处于G0/G1期,保持更好的分化潜能及干细胞特性。     

体外培养组织工程用人骨髓间充质干细胞的试验性研究

目的 本研究对人骨髓问充质干细胞(hBMMSCs)进行基本生物学特性研究,并探讨以微载体培养技术进行大量增殖的可能性.方法 对成人骨髓血用Percoll淋巴细胞分离液进行密度梯度离心,以获取hB-MMSCs.原代和传代培养后描绘细胞增长曲线.以流式细胞术对所获取的hBMMSCs进行细胞表型鉴定.以Cytodex3微载体对hBMMSCs进行动态培养,并与无微载体培养的细胞进行数量对比.结果 以Percoll淋巴细胞分离液可成功地对人骨髓血进行间充质干细胞的分离,原代和传代培养后细胞生长良好.以流式细胞术对hBMMSCs进行表型鉴定,其中CD29、CD44、CD73、CDl05和CD147呈阳性表达,阳性率高于96%;CD71、CD90的阳性率为86.74%和71.01%;而CD14、CD34、CD38、CD45和HLA-DR呈阴性表达,且大多低于2%.以Cytodex3微栽体进行动态培养时,hBMMSCs能够在微栽体上迅速贴附、铺展并生长.在相同的时间点,当hBMMSCs在微载体表面长满时,细胞数目均显著多于无微栽体的培养方法 (P＜0.001),其细胞密度和培养速度至少是普通培养法的4.5～9.6倍.Cytodex3上细胞数目的 大量增长大约在第8天后进入平台期.结论 应用PercoH淋巴细胞分离液能便捷地将hBMMSCs从人骨髓血中分离提取出来,对细胞活性影响小,并可以流式细胞术快速有效地鉴定其表面标记物.已获取的hBMMSCs的纯度较高,而且表型也较均一.与普通培养相比较,Cytodex3微载体培养体系可以在相同时间内获取大量的hBMMSCs,便于进一步开展在心血管外科领域的组织工程学应用.     

Bmi-1基因表达与人骨髓间充质干细胞增殖关系的探讨

目的:建立人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的体外培养体系,研究hMSCs表面抗原的表达情况,以及体外传代培养对Bmi-1基因表达变化的影响,为进一步探讨Bmi-1基因在hMSCs增殖中的作用及调控机制提供依据.方法:骨穿抽取骨髓,以1.077g/ml的Ficoll分离液梯度密度离心,收集单个核细胞进行培养和传代,观察细胞形态和生长周期.取P4代的hMSCs,流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达情况.通过SA-β-gal的染色检测细胞的老化程度,通过抽提各代次细胞的RNA,逆转录PCR定量Bmi-1基因量的变化,分析与细胞倍增代数的关系.结果:体外培养的hMSCs贴壁生长,呈长梭形,可增殖形成克隆.经分离纯化培养后,流式细胞仪显示细胞表型为CD13,CD105,少量表达CD33,不表达造血细胞的标志CD34及CD117.SA-β-gal的染色显示随细胞培养时间延长,SA-β-gal染色更明显和清晰.逆转录PCR显示随传代次数的增加,hMSCs的增殖能力逐渐下降,Bmi-1基因表达随培养时间而减少.结论:本培养体系可获得纯度较高的hMSCs,具有强大的增殖能力.Bmi-1基因极可能是影响MSC增殖能力的一个重要基因.     

微载体在培养人骨髓间充质干细胞成骨诱导中的作用

目的探讨微载体在培养人骨髓间充质干细胞(hMSCs)成骨诱导中的作用,建立一种大量、快速获得骨组织工程种子细胞的方法.方法将普通培养瓶培养的第3代hMSCs分别应用搅拌式生物反应器和微载体成骨诱导培养,分别于培养的第2、4、6、8、10、12、14天检测诱导细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性,并与普通成骨诱导方法进行对比.观察细胞增殖情况,比较两种方法细胞增殖速度(细胞数/d).结果接种24 h后,88%的hMSCs细胞粘附于微载体并铺展,3 d后生长加速,约8～9 d后生长达最大值,最终细胞收获密度为接种时的16～22倍.细胞增殖速度约为普通培养法的3.2倍(P＜0.05).诱导细胞的ALP的活性在第12天达最大值,且微载体成骨诱导培养的细胞ALP活性与普通培养法无显著差异(P＞0.05).结论应用微载体技术可成功地进行hMSCs的成骨诱导培养和快速扩增,能满足骨组织工程的需要.