Ⅳ型胶原糖基化对表皮干细胞生物学特性的影响

目的研究糖尿病患者皮肤组织中Ⅳ型胶原的糖基化对表皮干细胞生物学特性的影响。方法体外培养表皮干细胞,用免疫细胞化学和免疫荧光化学方法鉴定其标志物(角蛋白19和β1整合素),将表皮干细胞分别接种在包被有正常Ⅳ型胶原和糖基化Ⅳ型胶原的培养板上,比较两者黏附率、生长曲线和克隆生成率。结果糖基化Ⅳ型胶原上生长的表皮干细胞的黏附率和克隆生成率均较正常胶原组低(P<0.05)。结论Ⅳ型胶原的糖基化抑制了表皮干细胞的黏附与增殖,可能是糖尿病患者创面难愈的机制之一。     

人表皮干细胞的快速分离培养及鉴定

目的 探讨人表皮干细胞的体外快速分离和培养方法.方法 运用Dispase Ⅱ酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离获得表皮干细胞.分离的表皮片经表皮干细胞培养基(ESCM)悬浮,接种于IV型胶原包被的培养板中,37 ℃、5%CO2 饱和湿度的细胞培养箱内静置培养10 min,留用贴壁细胞;Ⅳ型胶原黏附、分离并富集后继续培养.倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况;检测细胞克隆形成率及克隆维持时间;免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达.以角质形成细胞作为对照.结果 组织学观察显示,培养24 h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞,且克隆维持时间较长; 免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及Kl9均呈阳性表达.结论 运用Ⅳ型胶原黏附结合ESCM培养可以实现人成体表皮干细胞的快速分离和培养.     

人表皮干细胞的体外分离培养和鉴定

目的:探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定方法.方法:中性蛋白酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离表皮层和真皮层,并获得表皮单细胞悬液,采用Ⅳ型胶原铺板选择性黏附、分离和角质细胞无血清培养基(K-SFM)培养表皮干细胞.倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,检测细胞克隆形成率,免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达;以角质形成细胞作为对照.结果:组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及K19均呈阳性表达.结论:运用Ⅳ型胶原黏附结合K-SFM培养可以实现人表皮干细胞的体外快速分离和培养.     

人表皮干细胞的快速分离培养及鉴定

目的探讨人表皮干细胞的体外快速分离和培养方法。方法运用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离获得表皮干细胞。分离的表皮片经表皮干细胞培养基(ESCM)悬浮,接种于IV型胶原包被的培养板中,37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱内静置培养10min,留用贴壁细胞;Ⅳ型胶原黏附、分离并富集后继续培养。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况;检测细胞克隆形成率及克隆维持时间;免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达。以角质形成细胞作为对照。结果组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞,且克隆维持时间较长;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及Kl9均呈阳性表达。结论运用Ⅳ型胶原黏附结合ESCM培养可以实现人成体表皮干细胞的快速分离和培养。     

表皮干细胞分离及基因特异性表达

目的利用Ⅳ型胶原快速黏附特性分离表皮干细胞,以基因芯片技术检测表皮干细胞基因特异性表达.方法观察表皮角质形成细胞(KCs)在Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白(FN)上的黏附、生长,相差显微镜和扫描电镜观察Ⅳ型胶原快速黏附KCs形态,流式细胞仪测定细胞周期,基因芯片技术检测表皮干细胞基因特异性表达.结果KCs在Ⅳ型胶原上黏附和生长良好,Ⅳ型胶原上快速黏附的KCs形态较为原始;S期、G2/M期细胞比例分别为(2.18±1.85)%和(0.60±0.21)%,明显低于非黏附KCs的(3.92±0.99)%和(1.44±0.78)%,符合表皮干细胞的形态和细胞周期特征.与原代KCs比较,黏附KCs CT-NNB1、TOB1、PP2R5E等21个增殖相关基因上调,17个下调.结论Ⅳ型胶原是表皮干细胞分离的适宜基质,在Ⅳ型胶原上快速黏附的KCs符合表皮干细胞的形态和细胞周期特征.黏附KCs CTNNB、TOB1、PP2R5E等基因表达上调,可能与表皮干细胞特性的维持有关.     

人表皮干细胞的体外培养与鉴定

目的 探讨人表皮干细胞的体外分离培养方法 ,并对培养的表皮干细胞进行鉴定.方法 运用中性蛋白水解酶和胰蛋白酶两步法分离表皮层和真皮层,并获得表皮单细胞悬液,采用Ⅳ型胶原铺板选择性黏附分离角质形成细胞,应用表皮干细胞培养基进行培养.倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,免疫组织化学染色观察表皮干细胞β1整合素、角蛋白19(K19)、CK10的表达. 结果 组织学观察显示,培养中实验组细胞呈现克隆生长,且克隆维持时间较长;免疫组织化学染色显示,实验组的培养细胞β1整合素及K19均呈阳性表达,而CK10阴性表达.结论 应用Ⅳ型胶原黏附和运用表皮干细胞培养基可以实现人体表皮干细胞的分离和培养,为表皮干细胞体外的大量扩增奠定了基础.     

表皮干细胞的分选鉴定及培养

目的 探讨并评价Ⅳ型胶原黏附法分离表皮干细胞的可行性.方法 以不同浓度Ⅳ型胶原及不同黏附时间对表皮细胞进行分选培养.选择0.2mg/ml、15min组细胞,进行免疫细胞化学染色鉴定.结果 黏附浓度对贴壁率影响不明显,而黏附时间的影响显著;0.2mg/ml Ⅳ型胶原黏附15min的细胞,β1整合素、K19免疫荧光细胞化学双重标记阳性细胞的比例约为28.50%.结论 Ⅳ型胶原黏附法分选表皮干细胞仅仅是一种初步的筛选,是目前组织工程产业化种子细胞的分选最可行的方法 ,但要获取高纯度的ESC需要进一步的深入研究.     

表皮干细胞分离及基因特异性表达

目的利用Ⅳ型胶原快速黏附特性分离表皮干细胞 ,以基因芯片技术检测表皮干细胞基因特异性表达。方法观察表皮角质形成细胞 (KCs)在Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白 (FN)上的黏附、生长 ,相差显微镜和扫描电镜观察Ⅳ型胶原快速黏附KCs形态 ,流式细胞仪测定细胞周期 ,基因芯片技术检测表皮干细胞基因特异性表达。结果KCs在Ⅳ型胶原上黏附和生长良好 ,IV型胶原上快速黏附的KCs形态较为原始 ;S期、G2 /M期细胞比例分别为 (2 .18± 1.85 ) %和 (0 .6 0± 0 .2 1) % ,明显低于非黏附KCs的 (3.92± 0 .99) %和 (1.4 4± 0 .78) % ,符合表皮干细胞的形态和细胞周期特征。与原代KCs比较 ,黏附KCsCTNNB1、TOB1、PP2R5E等 2 1个增殖相关基因上调 ,17个下调。结论IV型胶原是表皮干细胞分离的适宜基质 ,在Ⅳ型胶原上快速黏附的KCs符合表皮干细胞的形态和细胞周期特征。黏附KCsCTNNB、TOB1、PP2R5E等基因表达上调 ,可能与表皮干细胞特性的维持有关。     

成人体皮表皮干细胞的定位及分离培养

目的:研究表皮干细胞在成人体皮中的分布及其分离和培养.方法:用免疫组织化学方法检测成人体皮中β1整合素及角蛋白19的表达,对成人体皮中的表皮干细胞进行定位和定量;用Ⅳ型胶原分离培养成人体皮表皮干细胞,通过检测β1整合素及角蛋白19的表达水平及克隆形成率(以角质细胞为对照)对其进行鉴定.结果:β1整合素及角蛋白19的免疫组化阳性信号主要位于表皮的基底部及毛囊周围,阳性细胞在表皮中所占的数量较少,且在真皮中也有少量表达.体外培养,可见细胞呈克隆样生长、β1整合素及角蛋白19免疫组织化学染色呈阳性,且其克隆形成率为17.17%,明显高于对照组的6.83%(P＜0.05).结论:应用Ⅳ型胶原快速贴附法及成人成纤维细胞条件培养液,对成人体皮中表皮干细胞成功进行了分离培养,为表皮干细胞体外的大量扩增奠定了基础.     

人表皮干细胞的分离与鉴定

目的分离人表皮干细胞群并鉴定其相关的分子标记蛋白的表达。方法采用传统方法和快速黏附Ⅳ型胶原的方法分离人正常角质形成细胞群和快速黏附Ⅳ型胶原的人角质形成细胞群,并采用免疫荧光法检测整合素α6,p63蛋白在2种细胞中的表达。结果成功分离了人正常角质细胞群和快速黏附Ⅳ型胶原的人角质形成细胞群;快速黏附Ⅳ型胶原的人角质形成细胞群高表达α6整合素和p63蛋白,与人正常角质细胞群差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究分离的快速黏附Ⅳ型胶原的人角质形成细胞群是富集了人表皮干细胞的细胞群。     

不同酶浓度对差速黏附法分选小鼠表皮干细胞的研究

目的比较不同酶浓度作用后进行分选的表皮干细胞的生长增殖状况.方法用不同浓度的酶消化表皮,再用差速黏附法分离KSC,置于低钙无血清培养基中培养.比较KSC在两种酶浓度作用后生长增殖、克隆形成率、生长曲线和KSC相关标记物的表达等指标.结果在0.05%胰酶和0.02?TA(1:1)混合的酶作用下,能分选出较高比例的呈高克隆形成率的KSC,在较长的体外培养时间内始终保持较高的增殖潜能.两种酶作用下KSC的克隆形成率有显著差异(P＜0.01).角蛋白K19和整粘蛋白β1有强阳性表达.结论体外培养KSC时,使用低浓度胰酶加EDTA消化表皮,更有利于KSC在Ⅳ型胶原上的筛选,也有利于KSC的体外扩增及其表型的维持.     

大鼠表皮基底层干细胞体外分离与培养

目的建立简单、可靠的大鼠表皮基底层干细胞体外分离培养方法。方法取新生大鼠背部皮肤,采用胰酶两步消化法获得单细胞悬液,Ⅳ型胶原差速贴壁法富集干细胞,将慢黏附细胞作为对照组细胞,均以角质形成细胞无血清培养基培养。以β1-整合素和角蛋白19(K19)双重荧光染色鉴定细胞表型,克隆形成实验检测细胞体外增殖能力。结果分离培养的细胞为多角形、呈铺路石样排列,倍增时间约为24h,细胞形态和生长规律符合基底层干细胞的特征。免疫荧光鉴定显示细胞共表达β1-整合素和K19,基底层干细胞克隆形成能力显著强于对照细胞。结论两步消化联合Ⅳ型胶原差速贴壁法获取基底层干细胞简易可行,培养的细胞活力好、表型可靠。     

Ⅰ型胶原支架材料与人脂肪干细胞体外生物相容性研究

目的 观察人脂肪干细胞与I型胶原支架材料的生物相容性,为脂肪组织工程选择适宜的种子细胞载体.方法 将人脂肪干细胞与Ⅰ型胶原支架体外培养复合,采用倒置相差显微镜和扫描电镜,观察细胞在支架上黏附、生长及增殖情况并计算细胞黏附率,XTT比色法检测细胞增殖率.结果 脂肪干细胞能良好的在支架上黏附、生长和增殖.结论 Ⅰ型胶原支架材料具有良好的细胞相容性,可作为脂肪组织工程的种子细胞载体.     

胰岛素样细胞生长因子-1、碱性成纤维细胞生长因子及转化生长因子α对人表皮干细胞增殖的影响

目的 表皮干细胞是组织工程化皮肤的"种子细胞".文中研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、胰岛素样细胞生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)和转化生长因子α(transforming growth factor α,TGFα)对人表皮干细胞增殖的影响.方法 采用两步酶消化法和Ⅳ型胶原差速贴壁相结合的方法获得人原代表皮干细胞,将表皮干细胞分为A组(K-SFM)、B组(K-SFM+bFGF)、C组(K-SFM+IGF-1)及D组(K-SFM+TGFα)进行培养.比较不同组之间表皮干细胞的克隆形成率、生长增殖、生长曲线和细胞周期等指标.结果 B组、C组及D组培养的表皮干细胞在细胞增殖、细胞克隆率方面检测结果均明显高于A组(P<0.05);流式细胞仪检测B组、C组与A组及D组处于G0/G1细胞比例比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 IGF-1、bFGF及TGF-α均对表皮干细胞的增殖有促进作用,IGF-1及bFGF对表皮干细胞表型的维持有较好的作用.     

糖尿病合并肝功能异常患者血清AGEs水平及临床意义

目的 探讨2型糖尿病患者血清晚期糖基化终朱产物(AGEs)水平变化及其与肝功能的关系.方法 选择70例2型糖尿病患者(其中35例肝功能异常,35例肝功能正常)、70例肝硬化患者(其中33例血糖异常,37例血糖正常),另选35例健康者为正常组.检测各组AGEs、ALT、HA、LN、PCⅢ和CⅣ水平,分析AGEs水平变化与血糖、肝功能、肝纤维化指标的相关性.结果 糖尿病组和肝硬化组AGEs的水平均高于正常对照组(1.0±0.5,P<0.01),而肝功能异常的糖尿病患者AGEs水平显著高于单纯糖尿病患者(17.1±11.1 u/mL vs 11.85±5.7 u/mL,P<0.05).肝硬化合并糖尿病患者血清AGEs水平(22.4±9.7 u/mL)显著高于单纯肝硬化患者(4.5±2.6 u/mL)(P<0.05).血清AGEs与肝功(r=0.374)、透明质酸(HA)低度正相关(r=0.457),与血糖水平(r=0.551)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)肝纤维化指标中度正相关(γ值分别为0.509,0.519,0.507).结论 糖尿病合并肝功能异常患者血清AGEs水平明显升高,可能对糖尿病患者的肝病进展具有一定的影响.     

I 型胶原支架材料与人脂肪干细胞体外生物相容性研究

目的观察人脂肪干细胞与I型胶原支架材料的生物相容性,为脂肪组织工程选择适宜的种子细胞载体。方法将人脂肪干细胞与I型胶原支架体外培养复合,采用倒置相差显微镜和扫描电镜,观察细胞在支架上黏附、生长及增殖情况并计算细胞黏附率,XTT比色法检测细胞增殖率。结果脂肪干细胞能良好的在支架上黏附、生长和增殖。结论I型胶原支架材料具有良好的细胞相容性,可作为脂肪组织工程的种子细胞载体。     

大鼠表皮干细胞的分布与体外分离培养

目的 研究大鼠表皮干细胞的分布与体外分离培养.方法 用免疫组织化学技术研究大鼠表皮干细胞的分布;用DispaseⅡ、胰酶二步法消化新生大鼠皮肤,获得单细胞悬液,Ⅳ型胶原筛选,体外培养大鼠表皮干细胞,进行免疫组化鉴定,荧光标记流式细胞仪分析.结果 在表皮基底层、毛囊外根鞘区α 6-integrin、K15等表皮干细胞标记物染色阳性,而分化指标CD71染色阴性;CD34在表皮基底层阴性表达,而在毛囊隆突区阳性表达;体外分离的基底层表皮干细胞生长良好,具有较高的克隆形成率;干细胞标记物α 6-integrin、 K15呈阳性表达,流式细胞仪检测α 6-integrin达到84%,说明较为成功地体外分离培养出大鼠表皮基底层干细胞.结论 在表皮基底层、毛囊外根鞘区存在表皮干细胞.     

高浓度葡萄糖对小鼠表皮干细胞增殖的影响

目的 探讨高浓度葡萄糖对小鼠表皮干细胞增殖的影响.方法 利用Ⅳ型胶原的快速黏附法分离培养小鼠表皮干细胞,观察其形态学;通过免疫荧光法检测表皮干细胞标志物β1整合素和K19来鉴定表皮干细胞;将小鼠表皮干细胞分别放在葡萄糖浓度为5.6、15和30mmol/L的培养基里培养;MTT法检测细胞增殖情况,免疫印迹法检测细胞凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达水平.结果 体外培养的小鼠表皮干细胞呈克隆样生长,增殖速度较快,细胞形态呈铺路石样,边缘细胞呈梭形,细胞核质比较大;免疫荧光法检测到培养的小鼠表皮干细胞β1整合素和K19呈阳性表达且阳性表达率均为100％;MTT法检测到与对照组（5.6mmol/L浓度葡萄糖）相比,15mmol/L浓度葡萄糖刺激72h后检测到细胞增殖速度无明显改变,而30mmol/L浓度葡萄糖刺激24、48和72h后检测到细胞增殖速度降低,差异有统计学意义（P＜0.05）.Western blot法检测到与对照组相比,30mmol/L浓度葡萄糖刺激48h后凋亡蛋白Bax的蛋白表达量明显增加而抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）.结论 本研究结果表明较高浓度（30mmol/L）葡萄糖可以明显抑制小鼠表皮干细胞的增殖,从干细胞角度进一步为糖尿病创面难愈的原因提供了实验室依据.     

糖基化细胞外基质对成纤维细胞生物学行为的影响

目的研究皮肤组织中细胞外基质(ECM)成分的糖基化对成纤维细胞(FB)黏附增殖能力的影响.方法对糖尿病患者皮肤组织中晚期糖基化终末产物(AGEs)的表达进行免疫组化测定;体外将FB的ECM糖基化处理,观察FB细胞的形态变化和糖基化基质对其黏附、增殖能力的影响,以非糖尿病皮肤组织作为对照.结果糖尿病患者皮肤组织中FB的细胞浆和ECM中AGEs的阳性表达明显多于非糖尿病皮肤;体外糖基化基质上接种的FB较小,胞体突起既少又短,黏附的细胞明显少于对照组(P＜0.01);接种1 h,黏附细胞增多,逐渐与对照组接近,但仍低于对照组.结论糖尿病患者皮肤组织中的ECM被糖基化,产生的AGEs可抑制FB的黏附、增殖,可能是糖尿病创面愈合延迟的重要机制之一.     

AGEs在糖尿病粥样硬化动脉壁分布的免疫组化研究

目的研究2型糖尿病动脉壁糖基化终末产物的程度以及糖基化机制在2型糖尿病并发症发生发展中的作用。方法应用抗糖基化终末产物(AGEs)多克隆抗体,对2型糖尿病粥样硬化血管和非糖尿病粥样硬化血管、正常人群的血管进行动脉壁AGEs的免疫组化研究。结果2型糖尿病粥样硬化血管壁AGEs的表达率显著大于非糖尿病粥样硬化血管及正常人群的血管(P<0.01),非糖尿病粥样硬化血管与正常人群的血管亦有差异(P<0.05)。结论血管壁AGEs的免疫组化定性研究更直观地反映血管组织糖基化的程度,进一步说明AGEs在糖尿病并发症中所起的重要作用。