人结肠癌LS174T/5-Fu多药耐药细胞系的建立

目的建立人结肠癌多药耐药细胞系,并研究其生物学特性。方法以5-氟尿嘧啶(5-Fu)为诱导药物,LS174T细胞株为研究对象,利用浓度递增诱导法,建立LS174T/5-Fu多药耐药细胞系。MTT法测定药物敏感性,光镜、细胞计数法、流式细胞仪及RT-PCR等方法观察其生物学特征及多药耐药相关基因(MRP)mRNA表达。结果历时6个月成功建立人结肠癌多药耐药细胞系LS174T/5-Fu,对5-Fu耐药指数为40.24,且与羟基喜树碱、顺铂、依托泊苷和脱氧氟尿苷等多种化疗药物有不同程度的交叉耐药性;细胞形态发生改变;倍增时间较亲代细胞延长;细胞周期发现其G1和S期细胞增加,G2期细胞减少;MRP mRNA表达增高。结论LS174T/5-Fu细胞是一种可靠的人结肠癌多药耐药细胞系,该细胞系的建立为深入研究5-Fu诱导人结肠癌多药耐药的发生机制奠定了基础。     

上皮-间质转化在人结肠癌细胞系SW480对西妥昔单抗及氟尿嘧啶耐药中的作用

目的探讨人结肠癌细胞系SW480上皮-间质转化现象与其在化疗药物及靶向药物耐药中的作用.方法西妥昔单抗(cetuximab,C225)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)以及二者联合处理人结肠癌细胞系SW480,观察细胞形态,免疫荧光化学方法检测处理前后SW480细胞骨架改变以及E-钙粘素(E-cardherin)、波形蛋白(vinmentin)表达差异,Western blot方法检测实验组与对照组SW480细胞E-cardherin、Vinmentin以及多药耐药蛋白(MRP)、P-糖蛋白(P-gp)表达差异;体外药物敏感试验(cell Counting Kit-8,CCK-8比色法)分别检测实验组与对照组SW480细胞存活能力.结果 SW480细胞经C225、5-Fu以及二者联合处理后细胞形态由上皮细胞向间质细胞转化;细胞免疫荧光显示处理前后SW480细胞骨架改变,微丝蛋白排列极性增强,E-cardherin表达下降,Vinmentin表达升高,同时伴随MRP、P-gp表达增高.SW480细胞经C225与5-Fu联合处理较单独应用2个药物细胞存活率明显降低(P<0.05).结论 SW480细胞经单独使用靶向药物或化疗药物以及两者联合应用可诱导细胞发生EMT,且此EMT对肿瘤细胞耐药有影响.     

两种人大肠癌多药耐药株的建立及耐药性比较

目的比较递增药物质量浓度持续作用、恒定药物质量浓度周期作用两种方法建立的人大肠癌多药耐药细胞株的耐药性。方法用递增药物质量浓度持续作用、恒定药物质量浓度周期作用方式分别建立人大肠癌5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)多药耐药细胞亚系L2和L3,MTT检测两种细胞株的耐药指数,流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡率,实时荧光定量PCR检测多药耐药(multidrug resistance,MDR)基因mRNA表达,Western blot检测p-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达。结果递增药物质量浓度持续作用法诱导8个月后,细胞可以在含2.5μg/mL 5-Fu的培养液中正常生长,对5-Fu的耐药指数为26.53,对该细胞亚系命名为L2;以含2.5μg/mL 5-Fu的培养液进行筛选,6个月后细胞能稳定生长,所得细胞亚系命名为L3,其对5-Fu的耐药指数为13.78。与L2相比,G1期细胞数量较少,细胞凋亡较多,MDR1 mRNA转录水平和P-gp表达相对较低。结论大肠癌LOVO细胞株经递增药物质量浓度持续作用、恒定药物质量浓度周期作用两种诱导方式作用后,成功建立的人大肠癌5-Fu多药耐药细胞亚系L2和L3均可产生MDR;其耐药机制可能与MDR1 mRNA和P-gp的过表达有关。两种方法建立的肿瘤多药耐药模型在耐药性上有一定差异。     

醋酸甲羟孕酮对人结肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:检测醋酸甲羟孕酮(MPA)对人结肠癌细胞LS174T增殖和凋亡的影响并初步分析其机制.方法:人结肠癌细胞LS174T体外培养,以不同浓度的MPA(12.5、25、50和100 μmol/L)进行干预120 h,MTT法测定其对细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪分析细胞周期、凋亡率和细胞表面Fas表达.结果:不同浓度MPA对结肠癌细胞具有显著的抑制作用. MPA处理后阻止G1期细胞向S期的进程,S期和G2/M期细胞相对减少.LS174T细胞的自然凋亡率为4.8%,12.5 μmol/L组细胞凋亡率为15.1%,25 μmol/L组细胞凋亡率为25.6%; MPA作用后结肠癌细胞表面Fas表达显著增强.结论:MPA对结肠癌细胞具有显著的抑制作用和诱导凋亡的作用,其机制可能与MPA使结肠癌细胞停滞于G1期及细胞表面Fas表达上调有关.     

多药耐药细胞系A549/ADM的建立及部分特性

目的建立多药耐药细胞系A549/ADM和初步探讨人肺腺癌细胞多药耐药的发生。方法对肺腺癌细胞A549采用持续低浓度和逐渐增加阿霉素浓度间歇诱导,建立多药耐药细胞系;使用流式细胞仪器分别检测敏感细胞系和耐药系的P-gp和MRP的表达;采用MTT法检测其对多种常用化疗药物的耐药程度。结果与母细胞系相比,耐药细胞系A549/ADM对ADM的耐药程度增加了14.29倍,对VCR、DDP、VP-16均有不同程度的耐药,对5-FU无耐药性;耐药细胞系A549/ADM表面P-GP、MRP表达分别为74.8%和61.2%(P<0.01)。结论A549/ADM对多种常用肿瘤化疗药物表现有不同程度的耐药,其耐药性可能与P-GR和MRP高表达有关。     

人膀胱癌耐药细胞系T24/ADM的建立及其耐药机制

目的建立人膀胱癌耐药细胞系,对其耐药机制进行初步探讨。方法采用阿霉素浓度梯度递增诱导法,建立多药耐药细胞系T24/ADM。相差显微镜观察细胞,用MTT法检测该耐药细胞株对多种化疗药物的多药耐药性,应用RT-PCR和Western blot比较两种细胞P-GP、MRP和LRP的表达差异来探讨可能的耐药机制。结果建立了T24/ADM耐药细胞系,对ADM、VCR和VP16有交叉耐药,P-GP、MRP和LRP在耐药细胞系中表达升高。结论 T24/ADM具有明确的多药耐药性,其多药耐药相关基因表达升高是T24/ADM获得耐药的主要机制之一。     

藤龙补中汤对结肠癌细胞LS174T增殖和凋亡的影响

目的：观察藤龙补中汤对结肠癌细胞LS174T增殖和凋亡的影响。 方法：用不同浓度藤龙补中汤处理人结肠癌细胞LS174T和人结肠上皮细胞CRL-1790。用细胞计数检测试剂盒检测细胞增殖,平板法检测细胞克隆形成数目并计算抑制率,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,比色法检测细胞中半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（caspase-3）、caspase-8和caspase-9的活性。 结果：与对照组比较,藤龙补中汤对人结肠上皮细胞CRL-1790增殖无明显影响;1 mg/mL藤龙补中汤作用72 h,2 mg/mL藤龙补中汤作用48、72 h,5~20 mg/mL藤龙补中汤作用24~72 h均可显著抑制LS174T细胞增殖;1~20 mg/mL藤龙补中汤可显著抑制LS174T细胞克隆形成;5~20 mg/mL藤龙补中汤可诱导LS174T细胞凋亡,使LS174T细胞阻滞在G0/G1期,增强LS174T细胞caspase-3、caspase-8和caspase-9活性。 结论：藤龙补中汤可抑制结肠癌LS174T细胞增殖,阻滞LS174T细胞于G0/G1期,促进LS174T细胞凋亡;藤龙补中汤促LS174T细胞凋亡作用可能与增加caspase-3、caspase-8、caspase-9活性相关。     

HL60/VCR白血病细胞多药耐药机制的初步探讨

目的探讨白血病细胞产生耐药的机制,以及VEGF在白血病细胞产生耐药过程中的作用。方法采用反复暴露并逐渐提高诱导药物浓度的方法建立HL60/VCR多药耐药细胞系,MTT法检测细胞的耐药性及交叉耐药性;RT-PCR检测诱导前后mdr1、MRP、TopoⅡα、GSTπ和VEGF mRNA的表达情况。结果诱导后的HL60/VCR耐药细胞不仅对VCR高度耐药,对其他类化疗药物亦具有交叉耐药性;与HL60相比,HL60/VCR的mdr1、TopoⅡα和VEGF mRNA的表达明显增强,GSTπmRNA的表达无明显变化;HL60和HL60/VCR均不表达MRP mRNA。结论耐药基因mdr1和TopoⅡα以及VEGF共同参与HL60/VCR多药耐药的形成。     

干扰结肠癌上皮细胞Ascl2的表达致其向杯状细胞表型分化

目的探讨转录因子Ascl2对结肠癌细胞分化的影响。方法采用Ascl2分子干扰质粒和对照质粒对结肠癌HT-29和LS174T细胞进行转染,通过G418筛选建立稳定转染的细胞系,采用RT-PCR和Western blot方法检测干扰Ascl2分子表达对肠杯状细胞标志物Muc2和TFF3表达的影响。结果成功构建了shRNA-Ascl2/EGFP质粒以及对照质粒shRNA-control/EGFP,经测序与预期相符,G418筛选获得shRNA-Ascl2/HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-Ascl2/LS174T和shRNA-Ctr/LS174T稳定转染细胞。RT-PCR和Western blot检测证实干扰质粒能够有效地抑制HT-29和LS174T细胞内的Ascl2的表达(P<0.01)。RT-PCR检测发现Muc2和TFF3 mRNA表达水平在Ascl2干扰后的HT-29细胞内均明显上调(P<0.05);Muc2 mRNA表达水平在Ascl2干扰后的LS174T细胞内明显上调,差异有统计学意义(P<0.05),但是TFF3 mRNA表达水平在Ascl2干扰后的LS174T内升高不明显(P>0.05)。Western blot检测发现Muc2蛋白质表达水平在Ascl2干扰后明显上调(P<0.05)。结论干扰结肠癌HT-29和LS174T细胞内Ascl2的表达导致其向杯状细胞的表型分化。     

乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/A的建立

目的建立人乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/A,对其生物学特性进行初步分析评价,为后续乳腺癌多药耐药机制研究提供一株较理想的细胞模型.方法以阿霉素(ADM)为诱导药物,人乳腺癌细胞系MCF-7为诱导对象,采用ADM低浓度持续加量诱导方法,建立人乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/A,比较两组细胞形态变化和倍增时间,MTT法测定细胞耐药倍数及多药耐药指数,实时荧光定量PCR检测MDR1、MMP-2、CD44v6 mRNA表达水平.结果建成的MCF-7/A耐药细胞株,耐ADM指数为74,撤药培养60d后耐药指数仍维持在50以上,耐药性稳定,并与多种化疗药物有交叉耐药性,MCF-7/A耐药细胞株撤药培养倍增时间较亲本细胞明显缩短,MDR1、MMP-2、CD44v6 mRNA表达水平较亲本细胞均有明显增加(均P<0.01).结论建立的MCF-7/A模型具有多药耐药细胞的基本生物学特性,可用于乳腺癌多药耐药及侵袭转移机制的研究.