CArG调控元件辐射诱导活性的研究

目的构建含有人工合成CArG调控元件的荧光素酶报告基因重组质粒,研究该元件在多种肿瘤细胞中不同剂量放射线照射下的放射诱导活性。方法将含有9个串联的CCATATAAGG结构的CArG增强子与CMVIEbasalgenepromoter构成的嵌合调控元件插入到pGL3Basic质粒,构建荧光素酶报告质粒。利用脂质体将该报告质粒瞬时转染肿瘤细胞株HeLa、A549、HepG2,给予不同剂量137Csγ射线照射,36h后检测荧光素酶活性,观察该调控序列的放射诱导活性。结果该CArG调控元件在低剂量放射线的诱导下能明显增强下游基因的表达,在3Gy的γ射线照射下诱导活性最强。结论人工合成的CArG调控元件在低剂量的放射线作用下能有效诱导下游基因的表达,在肿瘤的放射-基因治疗中具有较强的应用潜力。     

缺氧反应元件对肺癌放射-基因治疗的乏氧增敏实验研究

目的实体瘤的缺氧微环境限制了放射-基因治疗的效果.本研究利用缺氧反应元件(hypoxia response elements,HREs)实现放射诱导及缺氧增强肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达,以提高乏氧实体瘤的放射-基因治疗效果.方法将HREs与放射敏感性Egr-1启动子串联,构建缺氧/辐射双敏感性HRE-Egr启动子及其调控的TNF-α表达载体,用脂质体介导该载体转染肺癌A549细胞,予以照射(6Gy)和/或缺氧(1%氧浓度)处理后,ELISA法检测转染细胞TNF-α表达水平.通过细胞剂量-存活曲线及其参数D0值,计算氧增比(OER)及增敏比(SER).建立裸鼠A549皮下移植瘤模型,计算50%肿瘤控制所需照射剂量(TCD50)及SER.结果 HREs可使缺氧下转染细胞照射后的TNF-α表达水平较常氧条件下增加到3.4倍,且转染组D0 (1.341Gy)和OER(0.81)均显著低于对照组(6.172Gy,2.65),SER(4.60)则显著升高(P<0.01).两组皮下移植瘤亦有相似的改变.结论成功构建了缺氧/辐射双敏感性HRE-Egr启动子及其调控的TNF-α表达载体,该载体转染的A549细胞及其移植瘤,均有显著的放射乏氧增敏作用.     

放射诱导基因治疗肿瘤的研究进展

近年来，放射诱导基因治疗已成为肿瘤治疗领域新的研究热点之一。该治疗策略一方面将放射治疗与基因治疗有机地结合，发挥协同治疗作用；另一方面由于放疗具有靶向性和可控性，实现了对杀伤基因表达的时空调控。相关的研究已经取得一定进展，作者简要概述目前的研究现状及该技术未来的应用前景。     

GAGA元件相关蛋白在人类细胞中对含有果蝇GAGA元件启动子的调控

目的 探讨在人类细胞中GAGA元件相关蛋白(GRP)是否对含有果蝇GAGA元件(dGAGA)的启动子具有调控作用及其机制.方法 共转染果蝇GAGA因子(dGAF)、GRP与含有野生型或突变型dGAGA的ftz启动子氯霉素乙酰转移酶CAT报告基因质粒,利用实时RT-PCR检测启动子活性;电泳迁移率变更分析检测Jurkat细胞核抽提物与dGAGA探针的结合.结果 Jurkat 细胞内,GRP既可单独、也可协同dGAF激活含野生型GAGA元件的ftz启动子活性,使该活性在一定范围内以剂量依赖关系升高,过量时,则引起阻遏作用;而GRP与dGAF均不能激活含突变型GAGA元件的ftz启动子.电泳迁移率变更分析初步显示Jurkat 细胞内有与GAGA元件结合的蛋白存在.结论 Jurkat细胞中有人类GAGA元件结合蛋白存在,它既可与GAGA元件结合直接参与人类基因的调控,又可介导依赖于GRP剂量对相关基因的双向调节.     

伽马射线对重组质粒(CArG)_6-hTERTp-SEA-GPI在人肿瘤A549细胞和成纤维细胞WI-38中的SEA表达的影响

目的:观察γ-射线对重组质粒(CArG)6-hTERTp-SEA-GPI在人肿瘤A549细胞和人正常细胞WI-38中的SEA表达的影响。方法:重组质粒(CArG)6-hTERTp-SEA-GPI分别转染A549和WI-38细胞,转染后12h2Gyγ-射线照射肿瘤细胞和正常细胞,转染后24h后采用RT-PCR法检测SEA mRNA的表达,转染后48h采用Western blot法检测SEA蛋白的表达。结果:(CArG)6-hTERTp-SEA-GPI能够在肿瘤细胞A549细胞中表达SEA,正常细胞WI-38细胞中不能表达SEA;2Gyγ-射线可以诱导转染(CArG)6-hTERTp-SEA-GPI质粒的A549细胞SEA mRNA和蛋白的表达,表达量分别增加115.4%和24.2%。结论:重组质粒(CArG)6-hTERTp-SEAGPI能够在肿瘤细胞A549中选择性表达SEA,且2Gyγ-射线可以增强SEA的表达水平。     

pEgr-MIP3α重组质粒的构建及其在Lewis肺癌细胞中的辐射诱导表达

目的探讨辐射对转染pEgr-MIP3α质粒的Lewis肺癌细胞MIP3α表达的影响.方法用PCR方法扩增出MIP-3α基因,构建pEgr-MIP3α重组表达质粒,脂质体介导转染Lewis肺癌细胞,用RT-PCR和Western方法检测不同剂量X射线照射后的MIP-3α表达水平.结果所构建的重组质粒pEgr-MIP3α中MIP-3αcDNA正确插入表达载体;各照射组在不同剂量电子线照射后,MIP-3α表达均高于未转染组和假照射组.结论 Egr-1启动子具有辐射启动和诱导下游MIP-3α基因在Lewis肺癌中增强表达的功能,为pEgr-MIP3α用于放射-基因治疗的体内研究提供了实验基础.     

初步建立真核基因调控元件模块的搜索方法

依据基因调控知识对现有方法进行了综合及改进:(1)在序列搜索方面,结合多序列低分值查询与多个保守片段搜索两种方法获得匹配序列,然后序列相互打分,最后进行聚类分析;(2)在位点搜索方面,综合应用位置权重矩阵、成对寡核苷酸及Smith-Waterman等方法;(3)在分析系统方面,采用面向对象的程序设计方法建立跨平台、可扩展、基于数据库的分析系统。本方法对MHC基因家族的初步分析结果表明,能较准确地找到一些基因调控元件模块所在的区域。     

前列腺癌HRE.CArG.HSV-TK重组腺病毒载体基因放射治疗的体外研究

目的 观察NILE.CArG.HSV-TK重组腺病毒栽体Ad.HRE.CArG.HSV-TK联合放射对体外培养的前列腺癌细胞LNCaP和PC-3生长和凋亡的影响.方法 50 MOI重组腺病毒体外转导细胞,Real-timeRT-PCR检测TK基因mRNA表达水平,MTT法检测腺病毒转导联合放射对常氧(37℃,19%氧气,5%二氧化碳)和乏氧(37℃,0.5%氧气,5%二氧化碳)状态下细胞的生长抑制作用,流式细胞术检测凋亡(Annexin V-FITC染色).结果 50MOI腺病毒体外转导细胞48 h后,TK mRNA表达较对照组明显增加(P＜0.05),乏氧和/或放射处理后TK mKNA表达增加更显著.腺病毒体外转导和/或联合射线照射后,细胞抑制率显著增加并可介导细胞凋亡(P＜0.05).乏氧处理时上述效应更明显.结论 腺病毒栽体联合放射可显著抑制体外人前列腺癌细胞生长并诱导凋亡,为前列腺癌进一步的基因-放射治疗研究奠定了基础.     

初步建立真核基因调控元件模块的搜索方法

依据基因调控知识对现有方法进行了综合及改进：(1)在序列搜索方面，结合多序列低分值查询与多个保守片段搜索两种方法获得匹配序列，然后序列相互打分，最后进行聚类分析；(2)在位点搜索方面，综合应用位置权重矩阵、成对寡核苷酸及Smith-Waterman等方法；(3)在分析系统方面，采用面向对象的程序设计方法建立跨平台、可扩展、基于数据库的分析系统。本方法对MHC基因家族的初步分析结果表明，能较准确地找到一些基因调控元件模块所在的区域。     

具有前列腺癌特异性的启动子rPB-DR的活性测定

目的测定本组构建的一个前列腺特异性的、可启动针对雄激素非依赖性前列腺癌的基因治疗的改良启动子rPB-DR的活性。方法将已构建的4种不同拷贝条件的rPB-DR,与质粒连接,转染细胞后,进行荧光素酶活性测定。结果测定结果显示用维甲酸反应元件(RARE)替代雄激素反应元件(ARE)或直接插入RARE,保持了该启动子的活性。结论根据实验设计,构建出的rPB-DR应具有在维甲酸的调控下,针对雄激素非依赖性前列腺癌特异性启动基因治疗的功能,现构建成功不同拷贝条件的rPB-DR,通过活性测定证实了实验设计构想,也比较了各种拷贝条件的rPB-DR启动子活性的优劣,为下一步与治疗基因的连接及功能测定奠定基础。     

基因表达谱芯片筛查子宫内膜癌相关基因的研究

目的 应用基因芯片技术研究子宫内膜癌的基因表达谱,探讨子宫内膜癌的发生、发展与肿瘤相关的基因群及其功能.方法 应用TRIZOL一步法抽提11例子宫内膜癌患者的子宫内膜和3例子宫肌瘤患者的正常增殖期子宫内膜组织的总RNA,并纯化mRNA,将等量的子宫内膜的mRNA反转录合成以Cy5和Cy3标记的cDNA链做探针,混合后在含有8 064条双点人类全长基因的芯片上进行杂交,再经芯片扫描、图像分析处理后,分析子宫内膜癌组织及其与正常增殖期子宫内膜基因表达谱的差异.结果 11例子宫内膜癌组织和3例正常增殖期子宫内膜组织比较,含8 064个基因的基因芯片中共筛选出差异基因274条,其中上调92条,下调182条.结论 子宫内膜癌的子宫内膜组织和正常增殖期子宫内膜组织的基因表达谱存在差异,这些差异基因涉及细胞外基质调节基因、细胞因子、促癌基因/抑癌基因、细胞周期、细胞凋亡等,提示这些基因与子宫内膜癌的发生和发展有关.     

凋亡抑制基因bcl-2产物在肺癌中表达的研究

目的　研究凋亡抑制基因 bcl- 2产物在肺癌中的表达。方法　应用免疫组化 SP法检测凋亡抑制基因 bcl- 2蛋白在 82例肺癌组织中的表达并结合肺癌的临床病理学特征及预后关系进行分析。 40例癌旁正常肺组织作对照。结果　 bcl- 2蛋白在肺癌组织中表达率为 36 .6 % ,而在癌旁正常肺组织中其表达率仅为 7.5 % ,肺癌组织中存在明显的 bcl- 2蛋白过度表达 ,bcl- 2蛋白表达与肺癌的临床分期有关而与肺癌的细胞分化程度及预后无关。结论　 bcl- 2蛋白过度表达在肺癌的发生中起重要作用 ,是肺癌的早期表现 ,有可能成为肺癌早期诊断的重要参考指标。     

BRAF基因在甲状腺癌中表达的研究

近年来,甲状腺癌患病率逐年增加,国内外对于甲状腺癌发生发展可能的基因展开了大量研究,发现甲状腺癌的发生发展与鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)基因的突变、重排有关。BRAF基因是甲状腺癌研究相对热门基因之一,在甲状腺癌特别是乳头状癌中检出率极高。BRAF基因突变与甲状腺癌的发生发展密切相关,测定BRAF基因不仅可以指导甲状腺癌的早期诊断,同时在疾病治疗方案制订、预后评估等应用中也具有较高的价值,是目前临床较认可的甲状腺癌高效风险预测分子标志物。     

大鼠谷胱甘肽S-转移酶P1基因顺式调控元件的搜寻

目的搜寻大鼠谷胱甘肽Ｓ－转移酶Ｐ１基因（ｒａｔｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ－ｔｒａｎｓ－ｆｅｒａｓｅＰ１，ｒＧＳＴＰ１）上游３．０ｋｂ区域内顺式调控元件。方法采用高灵敏度的荧光素酶报告基因载体，以外切酶Ⅲ（ＥｘｏⅢ）、Ｓ１核酸酶对上述３．０ｋｂ片段进行删切后造成缺失，将所获得的一系列缺失质粒分别转染ＨｅＬａ细胞，测定转染细胞裂解液荧光素酶活性。结果当删切从－２．９ｋｂ进展至－２．３ｋｂ时，荧光素酶活性降低６７％（Ｐ＜０．０５），－２．５ｋｂ～－２．２ｋｂ区域能以不依赖于位置、方向性的方式增强基因表达强度，从－１．８ｋｂ缺失到－１．３ｋｂ时，荧光素酶活性升高４倍（Ｐ＜０．０５）。结论ｒＧＳＴＰ１基因上游在－２．５ｋｂ～－２．２ｋｂ及－１．８ｋｂ～－１．３ｋｂ区域内分别存在增强子元件和负调控序列。     

在家蝇中表达人胰岛素基因的研究

目的 研究人胰岛素基因在家蝇中的表达，建立家蝇生物反应器。方法 以家蝇作为实验动物，利用BAEKON6000型基因转移仪将胰岛素基因组基因导入家蝇进行实验研究。收集家蝇新产卵(1—1．5h内)，将环状质粒pCMV—mINS、pCMV-ImINS、pEF1α—mINS、pEF1α—ImINS以10μg/ml浓度分别与新采集的家蝇卵混合后进行电转移。经人工孵化发育为成虫(R)，G418(3．0mg／ml)筛选Fl代，待F1代发育至成虫并产卵后，采用PCR、Tricine-SDS-PAGE和Western-blot技术对F2代蝇蛆进行整合与表达水平检测。结果 四种质粒均能在家蝇中表达人胰岛素，表达量各占蝇蛆总蛋白0．207％、0．357％、0．473％和0．831％。结论 人胰岛素基因能够在蝇蛆中表达，即蝇蛆机体可对人胰岛素原进行翻译后加工。     

星形细胞瘤中抑癌基因蛋白P16和细胞周期蛋白D1表达的研究

目的：探讨抑癌基因蛋白P16和细胞周期蛋白D1在星形细胞瘤中对肿瘤形成，生长和抑制的作用。方法：应用免疫组化染色（LSAB法）和MIAS图像分析系统对结果进行定量分析统计。结果：61例星形细胞瘤中P16和Cyclin D1阳性率面积分别为41．6％和51．4％。其阳性率，阳性颗粒面积，平均光密度和积分光密度及组织学分级均有显著意义（P＜0．01）。结论：P16蛋白可抑制星形细胞瘤的形成和发展过程，Cyclin D1可以促进肿瘤的生长。     

重组葡萄糖脱氢酶基因的表达研究

目的：将重组的葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中表达,优化表达条件,以期获得较高活力的葡萄糖脱氢酶。方法：将枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因与表达载体pET22b连接后转化至大肠杆菌JM109（DE3）进行表达,经对发酵时间、诱导物浓度、诱导时间以及细胞破碎等条件的控制,实现葡萄糖脱氢酶的高表达。结果：重组质粒转化菌发酵2h后进入对数生长期,诱导剂IPTG浓度为0．5mmol／L,诱导2．5～3h后用240W超声破碎细胞,表达的粗提酶活力比诱导前提高了近干倍。SDS-PAGE电泳显示重组菌能表达单体分子量为31．5KD的特异性蛋白。结论：表达质粒的拷贝数、宿主菌培养条件、细胞破碎方式等均能影响酶的表达量。     

卵母细胞基因表达系统的应用研究

目的 :建立研究神经生理及药理的卵母细胞表达模型 ,并对鸡脑mRNA在卵母细胞上表达的氨基酸类受体进行研究。方法 :采用盐酸胍或异硫氰酸胍法抽提总RNA ,经寡聚脱氧胸苷 (oligo -dT)纤维素柱纯化得mRNA。mRNA微注射到卵母细胞内进行表达 ,以双电极电压钳技术研究表达的受体。结果 :模型能明显表达外源性mRNA表达的受体 ,而阴性对照无表达。在卵母细胞膜上表达的γ -氨基丁酸 (γ -aminobutyricacid ,GABA) ,甘氨酸(Glycine ,Gly)及红藻氨酸 (Kainate ,KA)受体 ,施加GABA ,Gly及KA均能引起一剂量依赖的内向电流 ,相应的拮抗剂可阻断其电流。剂量效应曲线显示GABA及KA诱导电流的半有效浓度 (EC5 0 )分别为 2 .9× 10 -5mol/L及 6 .3× 10 -5mol/L。结论 :卵母细胞可明显表达鸡脑mRNA编码的KA ,Gly及GABA受体 ,其药理特性与天然受体相似 ,是一个良好的神经生理及药理研究模型。     

Bcl-xL在非小细胞肺癌中的表达研究

目的:观察非小细胞肺癌组织与癌旁组织中Bcl-xL的基因转录和蛋白表达水平,探讨Bcl-xL在非小细胞肺癌发生发展中的可能作用,为非小细胞肺癌的诊断和治疗提供参考。方法:反转录PCR和免疫印迹的方法分别检测60例临床确诊的非小细胞肺癌组织与癌旁组织中Bcl-xL基因表达和Bcl-xL蛋白的水平,并与肺良性病变组织比较。结果:非小细胞肺癌组织的Bcl-xL mRNA水平明显高于癌旁组织和肺良性病变组织(P<0.01),mR-NA水平与临床分期呈正相关,与其他临床病理相关因素(性别、年龄、肿瘤大小、发生部位、组织学类型、分化程度)无明显相关,而癌旁组织和肺良性病变组织Bcl-xL mRNA水平之间没有差别(P>0.05)。蛋白表达检测结果与mR-NA水平高度一致。结论:非小细胞肺癌组织中Bcl-xL基因和蛋白表达水平明显升高,可能促进了肿瘤的发生发展,可以考虑作为非小细胞肺癌临床分期和评价临床预后的参考指标。