胃肠外营养相关肝损伤机制的实验研究

目的建立幼兔胃肠外营养(PN)相关肝损伤模型,探讨氧化损伤及凋亡在PN相关肝损伤机制中的作用。方法20只新西兰种白兔随机分为对照组(母乳喂养,n=10)和PN组(n=10),PN组经右颈静脉置入硅胶管,连续24 h输注静脉营养液,10 d后比较两组间血清肝功能生化指标、肝脏病理变化及电镜下肝细胞细胞器的变化。用比色法检测肝细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性;硫代巴比妥酸法测定肝组织丙二醛(MDA)水平;免疫印迹法检测肝细胞线粒体释放细胞色素C活性;ELISA法检测肝细胞caspase-3活性;原位末端标记法检测肝细胞凋亡。结果PN组血清胆汁酸、总胆红素、MDA水平和细胞色素C、caspase-3活性及肝细胞凋亡指数均明显高于对照组(P<0.01);而SOD活性却显著低于对照组(P<0.01)。PN组肝脏病理学观察可见门脉区炎症细胞浸润,有肝细胞变性、坏死或胆汁淤积;电镜下主要表现为胞浆空泡样变,毛细胆管微绒毛稀疏等。结论PN肝脏损伤机制可能是PN某些配方成分应用中,脂质过氧化导致肝细胞氧化损伤,同时损伤线粒体膜,促使线粒体膜通透性增加,释放细胞色素C等凋亡相关因子,激发caspase-3等级联反应,产生肝细胞凋亡,导致肝损伤。     

线粒体-细胞色素C途径在非酒精性脂肪肝大鼠肝细胞凋亡中的作用

目的 研究大鼠非酒精性脂肪肝形成中肝细胞凋亡以及线粒体-细胞色素C途径在其中的作用.方法 Wistar大鼠40只,随机分为正常对照组和高脂饲料2、4、8和12周组(其中每组各8只);HE染色光镜观察肝脏组织病理改变;采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(TUNEL)以及流式细胞仪检测肝细胞凋亡指数;激光共聚焦显微镜检测肝细胞线粒体膜电位;免疫组织化学检查caspase-3在肝脏表达分布,Western blotting检测细胞色素 C以及caspase-3含量变化.结果 高脂饮食组4～12周组肝细胞线粒体膜电位与对照组比较明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01);高脂饮食组肝细胞凋亡指数与对照组比较明显增加,随着脂肪肝的加重逐渐增高,差异有统计学意义(P＜0.01);高脂饮食组细胞色素C含量以及caspase-3蛋白表达随着时间延长逐渐增高,以12周增加明显,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 大鼠非酒精性脂肪肝引起的肝细胞损伤与肝细胞凋亡密切相关,线粒体-细胞色素C途径参与了其调控过程.     

1类多巴胺受体对细胞凋亡的线粒体信号通路的影响

目的 以细胞凋亡的线粒体途径为切入点,探讨1类多巴胺受体(DR1)活性变化对缺氧-复氧诱导的心肌细胞凋亡的影响及可能机制.方法 乳鼠心肌细胞以缺氧、缺血清培养2小时,复氧、复血清培养24小时的方法建立心肌细胞缺氧-复氧损伤模型.RT-PCR和Western blotting分别检测Bcl-2、caspase-3、caspase-9和细胞色素C(Cyt c)mRNA和蛋白质的表达;TUNEL、流式细胞仪、MTT检测心肌细胞的凋亡情况;紫外分光光度计检测细胞培养液中LDH、SOD活性和MDA含量;透射电镜观察心肌细胞形态变化.结果 与正常组比较,缺氧-复氧组细胞培养液中LDH活性和MDA含量增加,SOD活性降低;心肌细胞凋亡指数增加;心肌细胞超微结构损伤加重;促凋亡因子(Cyt c、caspase-3、caspase-9)表达增加,抑凋亡因子(Bcl-2)表达亦增加.与缺氧-复氧组比较,DR1激动剂SKF-38393进一步增加LDH活性和MDA含量,降低SOD活性,增加心肌细胞凋亡指数,加重心肌细胞损伤,上调促凋亡因子表达,下调抑凋亡因子表达;DR1抑制剂SCH-23390对上述指标影响不明显.结论 DR1激活可促进缺氧-复氧诱导的心肌细胞凋亡,其机制与上调线粒体途径有关.     

线粒体膜通透性转换作用对再灌注损伤后肝细胞凋亡的影响

目的观察大鼠肝脏常温缺血再灌注后肝细胞线粒体通透性转换(mitochondrial permeability transition,MPT)作用及其与肝细胞凋亡的关系;同时观察线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,PTP)开放抑制剂环孢素A(CsA)对MPT的抑制作用,以及对肝细胞凋亡的影响和可能的机制.方法将SD大鼠随机分为3组:假手术组、缺血再灌注组(I/R)、CsA组(I/R CsA).CsA组术前连续给予CsA 10 mg·kg-1·d-1灌胃4 d,其余组给予等量生理盐水.大鼠热缺血再灌注模型参考Nauta的方法,热缺血时间60 min,分别于再灌注0、1、6、24、72 h等不同时相收取肝组织标本,免疫组化法检测细胞质活性caspase-3;Western blot检测胞浆细胞色素C,TUNEL法检测肝细胞凋亡.结果缺血再灌注引起肝细胞线粒体发生MPT作用,细胞色素C由线粒体释放入细胞质,再灌注后0、1、6、24 h,I/R组及CsA组与假手术组相比,细胞质caspase-3的阳性程度明显增强,肝细胞凋亡明显增多(P<.01);CsA组与L/R组相比,再灌注1、6 h细胞色素C释放显著减少,再灌注1、6、24 h,caspase-3阳性程度明显下降(P<.01);再灌注后6、24、72 h,细胞凋亡明显减少(P<.05).结论缺血再灌注后肝细胞线粒体发生MPT作用可能是引起肝细胞凋亡的关键环节;CsA可能通过抑制PT孔的开放而抑制MPT作用、减少再灌注后细胞色素C释放、抑制caspase-3活化、缓解再灌注后大鼠肝细胞的凋亡.     

线粒体-细胞色素C途径在兔非酒精性脂肪肝肝细胞凋亡中的作用

目的探讨线粒体-细胞色素C途径在兔非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)肝细胞凋亡中的作用。方法雄性日本大耳兔40只,随机分为正常对照组(8周)和NAFLD模型组(4、6、8周组),每组各10只。模型组按1.2 m L/kg皮下注射花生油,2次/周,建立日本大耳兔NAFLD模型。按各组时间点处死兔子,测定兔血清中生化指标水平;HE染色观察肝组织病理形态改变,流式细胞仪检测肝细胞凋亡率;提取肝脏线粒体,分光光度法检测线粒体通透转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)的状态变化;免疫组织化学法检查Bcl-2、Bax、细胞色素C和caspase-3在肝组织中的表达情况;Western blot检测细胞色素C以及caspase-3含量变化。结果与正常对照组相比,模型组肝脏脂质代谢指标和相关炎症因子表达水平升高,模型组肝细胞凋亡率与对照组比较显著增加(P0.01)。造模4周时出现肝功能损伤,脂质代谢紊乱,随着NAFLD病程的发展,Bcl-2、Bax、细胞色素C和caspase-3表达量逐渐增加,线粒体通透转换孔开放率随高脂饮食饲养时间延长明显增加(P0.01)。结论线粒体-细胞色素C途径在NAFLD引起的肝细胞凋亡中起到了一定的调控作用。     

萱草花黄酮对酒精性肝损伤氧化应激及肝细胞凋亡机制的探讨

目的 探讨萱草花黄酮对急性酒精性肝损伤小鼠肝细胞凋亡及相关蛋白表达的影响.方法 40只小鼠分为4组,分别为空白对照组、模型对照组和萱草花黄酮低、高剂量组,每组各10只.连续灌胃给药7d,末次给药1h后,造模组小鼠一次性灌胃50％乙醇12 mL/kg,空白对照组给予同体积蒸馏水.测定各组小鼠血清中天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)活性;肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平;HE染色观察肝脏病理学改变;利用流式细胞仪检测肝细胞悬液中细胞凋亡率;Western blot检测肝细胞caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表达.结果 萱草花黄酮各组可降低血清AST、ALT活性;还可降低肝组织匀浆MDA水平,提高SOD的活性;肝组织病理学检查可见,萱草花黄酮高剂量组可使肝细胞变性、坏死的程度明显减轻,缓解肝组织的病理学改变;与模型组比较,萱草花黄酮各组肝细胞的凋亡率均有明显下降;Western blot结果显示萱草花黄酮各组caspase-3蛋白水平降低,Bcl-2蛋白表达增加,而Bax蛋白表达减少,Bax/Bcl-2比值降低.结论 萱草花黄酮对小鼠急性酒精性肝损伤具有明显的保护作用并且能够抑制肝细胞凋亡,其作用机制可能与其抗氧化作用及调节凋亡相关蛋白caspase-3、Bcl-2和Bax的表达有关.     

热休克预处理对大鼠心肌细胞凋亡和金属硫蛋白表达的影响

目的:探讨热休克预处理对大鼠心肌细胞凋亡和金属硫蛋白表达的影响.方法:将体外培养的大鼠心肌细胞随机分为3组:对照组(C组)、H2O2损伤组和热休克预处理组,检测心肌细胞的凋亡、心肌细胞Caspase-3活性,并用Western blotting检测线粒体中细胞色素C和金属硫蛋白的表达.结果:与对照组相比,H2O2损伤组心肌细胞凋亡数目增加(P＜0.01),Caspase-3活性明显增高(P＜0.01),线粒体中细胞色素C和金属硫蛋白的蛋白表达量明显增高(P＜0.01),而给予热休克预处理的心肌细胞的凋亡数量和坏死细胞数较H2 O2损伤组明显下降(P＜0.01),参与细胞凋亡执行的Caspase-3活性明显降低(P＜0.01),细胞色素C和金属硫蛋白的蛋白表达量持续升高(P＜0.01).结论:热休克预处理能够抑制心肌细胞凋亡,增加对心肌起保护作用的金属硫蛋白的表达,减少线粒体细胞色素C的释放,从而对心肌细胞起保护性作用.     

S-腺苷蛋氨酸对大鼠缺血再灌注肝线粒体超微结构的影响

[目的]研究S-腺苷蛋氨酸(SAM)预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤线粒体超微结构的影响.[方法]大鼠随机分为对照组(A组)、I/R组(B组)和SAM处理组(C组),SAM组大鼠在缺血再灌注前2 h先行腹腔注射SAM预处理.三组动物在阻断肝门30 min后(A组仅做分离,不阻断肝门),于再灌注0、1、6 h抽取下腔静脉血检测ALT、AST,切取肝组织用电镜观察线粒体的超微结构及制备线粒体匀浆检测SOD、MDA.[结果]再灌注1 h,B组MDA(5.15±0.33)nmol/mg、SOD(29.73±4.48)u/mg;C组MDA(4.57±0.15)nmol/mg、SOD(36.61±3.09)u/mg.再灌注6h,B组MDA(6.82±0.27)nmol/mg、SOD(23.86±1.68)u/mg;C组MDA(5.52±0.21)nmol/mg、SOD(28.38±2.18)u/mg.电镜下A组线粒体结构基本正常;B组线粒体数量减少,肿胀明显,部分细胞核固缩,可见凋亡小体;C组线粒体轻度肿胀,未见到细胞凋亡现象.[结论]SAM能抑制脂质过氧化反应,保护线粒体的形态和结构,肝细胞缺血再灌注后的损伤程度.     

瑞芬太尼对大鼠肠缺血再灌注损伤时肝细胞凋亡及caspase-3的影响

目的 探讨瑞芬太尼对大鼠肠缺血再灌注损伤时肝细胞凋亡及caspase-3的影响. 方法 成年健康Wistar大鼠42只,随机分为3组:对照组(C组,n=6)、肠缺血再灌注组(IR组,n=18)、瑞芬太尼干预组(R组,n=18).各组根据再灌注时间分为1,3,6 h三个时相.通过夹闭肠系膜上动脉制作肠缺血再灌注损伤模型,实验结束后即刻取肝左叶做标本.用免疫组化法检测caspase-3蛋白表达量,TUNEL法检测肝细胞凋亡指数(AI). 结果与C组比较,IR组和R组肝组织caspase-3蛋白含量、AI均增加(P<0.05);与IR组比较,R组caspase-3蛋白表达和AI减少(P<0.05). 结论 瑞芬太尼可以下调大鼠肠缺血再灌注时caspase-3蛋白表达,使肝细胞凋亡减轻,从而对肝损伤有一定的保护作用.     

肝细胞糖原拮抗缺血肝脏肝细胞凋亡及相关机制

目的探讨增加肝细胞糖原含量能否拮抗缺血肝脏肝细胞凋亡及相关机制。方法制备糖原含量显著不同的3组兔肝脏模型（A组、B组及C组）,在各组肝脏缺血再灌注过程中,检测肝组织内肝细胞凋亡及SOD、MDA水平。结果 3组肝脏于再灌注1h,组织内可见明显的肝实质细胞凋亡现象,其凋亡细胞数量依次为,A组〉B组〉C组,且3组彼此间差异均具有统计学意义,并且此时各组肝组织中SOD活性及MDA含量也差异均有统计学意义。结论增加肝细胞内糖原含量可显著拮抗肝脏缺血再灌注过程中肝细胞凋亡。其间,肝细胞糖原可能是通过抑制肝组织内氧自由基的产生而达到拮抗肝实质细胞凋亡的发生。