肝损伤大鼠骨髓源性肝干细胞的筛选分化与扩增

目的探讨利用肝损伤早期和淤胆血清培养体系从大鼠骨髓细胞中筛选、诱导分化和扩增肝干细胞亚群,以快速、高效地获取骨髓源性肝干细胞。方法建立淤胆型肝损伤大鼠模型和制备含5%淤胆血清病理条件培养液,以促进骨髓源性肝干细胞的体内、外筛选和扩增,采用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法检测培养2周时骨髓细胞各种肝干细胞标志表达。结果病理条件培养液培养2周的骨髓细胞形成肝细胞样集落,细胞表达胚胎期肝干细胞特征性蛋白。结论淤胆型肝损伤早期大鼠体内环境和含淤胆血清体外病理微环境可能有效地从骨髓细胞中筛选骨髓源性肝干细胞,从而为临床细胞移植治疗各种肝脏疾病提供种子细胞。     

骨髓源性肝干细胞的研究进展

肝干细胞用于肝病治疗的研究日益增多,尤其是骨髓分离骨髓源性肝干细胞.文章就骨髓源性肝干细胞的分离、培养、纯化、诱导分化、检测及肝内移植的可能机制和应用前景进行综述.     

骨髓源性肝干细胞的研究进展

肝干细胞用于肝病治疗的研究日益增多,尤其是骨髓分离骨髓源性肝干细胞。文章就骨髓源性肝干细胞的分离、培养、纯化、诱导分化、检测及肝内移植的可能机制和应用前景进行综述。     

转基因骨髓源性肝干细胞移植对大鼠肝纤维化的影响

目的 探讨尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因修饰骨髓源性肝干细胞(BDLSC)移植对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化的影响.方法 采用淤胆型肝损伤大鼠模型和含5%淤胆血清的培养液筛选和扩增BDLSC,使用RT-PCR方法检测培养2周时肝干细胞标志表达.体外将携带人uPA基因的腺病毒(AduPA)转染BDLSC并移植入CCl4诱导的肝纤维化大鼠体内,观察大鼠肝功能、胶原面积及病理组织学的变化.结果 病理条件培养液培养2周的骨髓细胞形成肝细胞样集落,并表达胚胎期肝干细胞特征性蛋白.体内研究显示,与模型组和BDLSC组相比,BDLSC-uPA组大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)及总胆红素(TBIL)水平均有不同程度的降低,凝血酶原时间(PT)时间缩短,白蛋白(ALB)水平升高,肝组织细胞外基质(ECM)水平及羟脯氨酸(Hyp)含量明显降低;肝组织结缔组织增生程度减轻,假小叶形成不明显,胶原面积明显减少.结论 uPA基因修饰BDLSC移植能有效抑制CCl4诱导的大鼠肝纤维化,改善纤维化大鼠的肝功能,从而为转基因BDLSC移植治疗肝纤维化的临床应用提供理论依据和实践基础.     

转基因骨髓源性肝干细胞移植对大鼠肝纤维化的影响

目的探讨尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因修饰骨髓源性肝干细胞(BDLSC)移植对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化的影响。方法采用淤胆型肝损伤大鼠模型和含5%淤胆血清的培养液筛选和扩增BDLSC,使用RT-PCR方法检测培养2周时肝干细胞标志表达。体外将携带人uPA基因的腺病毒(AduPA)转染BDLSC并移植入CCl4诱导的肝纤维化大鼠体内,观察大鼠肝功能、胶原面积及病理组织学的变化。结果病理条件培养液培养2周的骨髓细胞形成肝细胞样集落,并表达胚胎期肝干细胞特征性蛋白。体内研究显示,与模型组和BDLSC组相比,BDLSC-uPA组大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)及总胆红素(TBIL)水平均有不同程度的降低,凝血酶原时间(PT)时间缩短,白蛋白(ALB)水平升高,肝组织细胞外基质(ECM)水平及羟脯氨酸(Hyp)含量明显降低;肝组织结缔组织增生程度减轻,假小叶形成不明显,胶原面积明显减少。结论uPA基因修饰BDLSC移植能有效抑制CCl4诱导的大鼠肝纤维化,改善纤维化大鼠的肝功能,从而为转基因BDLSC移植治疗肝纤维化的临床应用提供理论依据和实践基础。     

骨髓源性肝干细胞研究进展

近年来,全球掀起了有关干细胞的研究热潮,而肝干细胞是引人注目的内容之一。肝干细胞的起源可能是多源性的。肝内干细胞有卵圆细胞、小肝细胞,肝外来源可以是胰腺的上皮细胞、胰岛前体细胞、胚胎干细胞,另一个重要来源是骨髓细胞。本文对骨髓源性肝干细胞研究进行综述。     

TPO+HGF+IL-3方案对人骨髓源性肝干细胞各亚群体外扩增的促进作用

目的体外观察血小板生成素(TPO)+促肝细胞生长素(HGF)+白细胞介素-3(IL-3)方案对人骨髓源性肝干细胞(BMDLSC)各亚型的增长促进作用。方法实验组为添加有TPO 50 ng/mL、HGF 40μg/mL、IL-3 10 ng/mL的高糖DMEM培养基体系,对照组则不含TPO+HGF+IL-3,分别在第1、7、14天,计算细胞总数,并采用流式细胞技术分别测算表达CD90、CD105、CD117、CD184、CD326的人BMDLSC各亚群的数量变化。结果实验组表达CD90、CD105、CD117、CD184、CD326的人BMDLSC各亚群的扩增倍数在第7天分别为(4.94±0.07)、(4.89±0.06)、(6.70±1.75)、(5.72±0.32)、(5.03±0.05)倍,第14天数量增长倍数为(7.60±0.11)、(7.76±0.16)、(11.70±3.06)、(21.38±1.13)、(8.12±0.13)。结论此方案对人BMDLSC各亚型的体外扩增有明显的促进效果,其中以CD184亚群的扩增效果最为明显。     

大鼠骨髓源性肝干细胞形态学特征的实验研究

目的：探讨大鼠骨髓源性肝干细胞的形态特性和来源。方法：HGF体外诱导大鼠骨髓干细胞向肝样细胞分化,诱导第0、7、14、21天,相差显微镜观察细胞形态特征,电镜观察第21天诱导组与非诱导组细胞超微结构变化;免疫细胞化学法检测甲胎蛋白（AFP）、细胞角质蛋白18（CK18）的表达;PAS检测细胞糖原。结果：HE染色较深的小圆形细胞在非诱导条件下各时相直径未发生明显变化,AFP、CK18、糖原染色均为阴性;诱导组HE染色较深的小圆形细胞与AFP、CK18、糖原染色阳性的细胞形态大小一致,随诱导时间延长其直径增大。透射显微镜观察：第21天诱导组细胞间有大量的微绒毛,细胞内可见到丰富的粗面内质网、线粒体、溶酶体、吞饮泡;第21天非诱导组细胞间仅有少量微绒毛,细胞质较少。结论：骨髓源性肝干细胞很可能来源于集落中HE染色较深的小圆形细胞,在HGF诱导下可以分化为肝样细胞,其形态学及超微结构与肝细胞结构相符合。     

骨髓造血干细胞横向分化肝干细胞的可塑性

干细胞作为细胞生物学的一个基本概念已有近100年的历史,但其研究并没有失去新颖和创新的光环.20世纪90年代末,干细胞自我更新、组织重建的传统概念受到了严重挑战,传统认为成体组织或器官内的干细胞具有组织特异性,只能分化成特定的细胞或组织.但新的研究表明成体细胞(ma-ture cells)具有强大的分化可塑性,组织特异性干细胞同样具有分化成其他细胞或组织的潜能.     

射频肝损伤血清诱导兔骨髓干细胞向肝细胞样分化

目的:观察射频肝损伤血清能否诱导自体骨髓间充质下细胞(MSCs)向肝样细胞分化,以寻求一种自体肝组织的修复方法.方法: 射频治疗灭活40%兔肝脏组织,于36 h后取全血及骨髓.用体外细胞培养技术从骨髓血中分离、纯化兔骨髓MSCs后,于自体射频肝损伤血清中培养,流式细胞仪测定细胞周期并观察其增殖及生长特征,免疫荧光法鉴定细胞性质及功能.结果: 原代、传代培养及流式细胞仪结果显示,兔骨髓MSCs具有活跃的增殖能力,并在射频肝损伤血清诱导下向肝样细胞分化.2 wk后免疫荧光染色可见分化后细胞表达肝细胞标志物CK18和白蛋白.结论: 射频肝损伤兔血清可促进自体骨髓MSCs增殖并向肝样细胞诱导分化.在射频治疗同时行肝样细胞移植修复肝损伤具有可能性.     

小鼠骨髓来源树突细胞体外扩增和鉴定

目的　探讨从小鼠骨髓分离纯化及大量扩增树突细胞 (DC)的方法 ,并对其行免疫表型和形态鉴定。　方法　制备 Balb/ c小鼠骨髓细胞 ,利用 0 .83% NH4 Cl- Tris溶液、抗鼠 CD4 / CD8/ CD4 5R单克隆抗体和补体溶液 ,依次去除红细胞、淋巴细胞、单核 -巨噬细胞、粒细胞等混杂细胞以获得纯化的 DC,再将其培养于含有小鼠重组的粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子 (m GM- CSF)和白细胞介素 4 (m IL - 4 )的 RPMI 1 6 4 0营养液中 ,培养第 6～ 8天收集悬浮的细胞 ,电子显微镜观察细胞形态并用流式细胞术检测小鼠 DC细胞表面特有的 CD1 1 b抗原和 MHC- 类分子的表达量。　结果　每只小鼠可扩增到 (2～ 4 )× 1 0 6个 DC细胞 ,细胞纯度 >85 % ;细胞表面高水平表达小鼠 DC细胞特异性抗原 CD1 1 b和 MHC- 类分子 ,电镜下细胞形态符合典型的树突细胞形态。　结论　联合应用 m GM- CSF和m IL- 4刺激小鼠骨髓细胞可扩增到大量高纯度的树突细胞     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经细胞样细胞分化

目的：研究大鼠骨髓问充质干细胞(MSCs)离体分离和培养方法,诱导MSCs向神经细胞样细胞分化。方法：通过梯度离心从大鼠骨髓中分离有核细胞,进行培养,去除不贴壁的细胞,分离纯化MSCs,对其生长特性进行分析。分别用硫代甘油和β-巯基乙醇对MSCs诱导分化,观察细胞形态变化,免疫组化检测分化细胞中nestin,神经元特异性烯醇化酶(NSE),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,进行鉴定。结果：用含15％胎牛血清(FCS)的L—DMEM培养MSCs,原代细胞贴壁生长,细胞形态均一,为纺锤形,有克隆形成。传代培养时,形态变为成纤维细胞样,生长特征呈“S”形,有较强的增殖能力,于第10代以后开始出现衰老征象。MSCs经硫代甘油和巯基乙醇诱导分化后,细胞形态发生改变,nsetin,NSE和GFAP阳性,分化为神经元或胶质细胞样细胞。结论：大鼠MSCs可以离体分离,培养,并能诱导向神经细胞样细胞分化。     

"左归丸"配伍规律对骨髓源成体干细胞定向分化的调控作用

目的：研究＂左归丸＂不同配伍对骨髓源成体干细胞（adult stem cells,ASC）定向分化的调控作用。方法：以免疫组化法鉴定＂左归丸＂撤药各方诱导ASC定向分化的干/祖细胞为指标,观察左归丸的配伍规律。结果：从方中撤出牛膝后Ⅱ型胶原表达明显降低;撤出山药碱性磷酸酶活性降低。撤出枸杞、山茱萸神经元烯醇化酶（NSE）表达降低,但撤出熟地后NSE表达明显升高;撤出枸杞、熟地后Ⅷ因子表达降低,但撤出山茱萸后Ⅷ因子表达明显升高。结论：牛膝可诱导ASC向软骨细胞方向分化;山药可诱导ASC向成骨细胞方向分化。枸杞、山茱萸可诱导ASC向神经元方向分化,但方中熟地可能具有抑制ASC向神经元方向分化的作用;枸杞、熟地可诱导ASC向内皮细胞方向分化,但山茱萸可能具有抑制ASC向内皮细胞方向分化的作用。结果提示,左归丸配伍规律在诱导干细胞分化与抑制分化方面起着重要的调控作用。     

骨髓间充质干细胞在神经系统疾病中的应用现状

骨髓间充质干细胞是一群存在于骨髓中的非造血干细胞,具有较强的自我更新能力和多向分化潜能,在体外不同的诱导条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、神经细胞、平滑肌细胞等多种细胞。骨髓间充质干细胞的应用是目前国际上神经系统疾病领域中重要的研究内容,具有广泛的临床应用前景。近年来,许多实验室从分子、生化、物理等水平对其向神经细胞分化调控进行了深入研究,取得了较大的进展。     

胎儿肝干细胞的分离、鉴定及培养

目的：分离、鉴定人胎肝中肝干细胞并短期培养,为体外扩增及诱导分化实验提供细胞来源。方法：采用原位两步胶原酶灌注结合Percoll液密度梯度离心的方法分离、纯化胎肝中肝干细胞,用光镜、电镜观察所得细胞形态,通过免疫细胞化学染色检测细胞AFP、CK19、CD34。测量肝脏重量及获得的肝干细胞数量,计算肝干细胞产量,对肝干细胞进行短期培养。结果：两步胶原酶灌注可有效消化胎儿肝脏结缔组织,分离的肝脏细胞经不连续Percofl密度梯度离心,可得到肝干细胞,细胞活性率为（88．35±2．45）％（n=30）。光镜下肝干细胞呈卵圆形,直径约为成熟肝细胞的1／3,电镜下肝干细胞直径约10um,细胞大部分被卵圆形细胞核所占据,细胞质少,核浆比例大,内质网、线粒体、高尔基体等细胞器不发达。ABC法免疫细胞化学染色显示：胎儿肝干细胞CK19、CD34及AFP呈阳性信号。对肝干细胞进行培养,12h后肝干细胞逐渐粘附、贴壁、铺展,呈现为圆形、椭圆形,呈上皮细胞样平铺生长。肝干细胞产量为（8．76±0．46）×10^6个／g（n=15）。结论：两步胶原酶灌注结合不连续Percoll液密度梯度离心法可较好地分离纯化胎儿肝干细胞,所得细胞可体外培养,可做为进一步实验的材料。     

骨髓间充质干细胞移植和动员对重症急性胰腺炎大鼠肝肾细胞凋亡的保护作用

目的探讨自体骨髓间充质干细胞移植和干细胞动员对重症急性胰腺炎大鼠肝肾细胞凋亡的保护作用。方法腹腔注射L-精氨酸制备大鼠SAP模型,随机分为假手术组、模型组、骨髓干细胞移植(mesenchymal stem cells,MSC)组、重组人粒细胞集落刺激因子组(G-CSF)及MSC+G-CSF组(n=48),各组再按术后不同观察时间段分为12、24、48、72h亚组(n=12)。MSC组造模后6h经股静脉注入自体骨髓间充质干细胞1.2ml,G-CSF组造模前连续3天皮下注入G-CSF 40μg/kg,MSC+G-CSF组则联合应用,假手术组仅腹腔注射等体积生理盐水。在术后相应时间点观察各组大鼠的死亡率,肝肾脏组织的病理变化,比较Bax、Bcl-2蛋白水平和细胞凋亡指数差异。结果各治疗组48h前未见死亡,72h死亡率与模型组比较无显著差异(P>0.05);肝脏、肾脏病理变化均较模型组减轻;治疗组各时间点肝肾细胞Bax表达较模型组下调,Bcl-2蛋白上调,凋亡指数较模型组有明显下降。MSC+G-CSF组24h点后Bax含量,48h、72h点Bcl-2含量,24h/48h点后细胞凋亡指数与MSC组和G-CSF组比较差异显著(P<0.05),MSC组和G-CSF组各时间比较无显著差异(P>0.05)。结论联合自体骨髓MSC移植与动员能有效抑制重症急性胰腺炎时肝脏和肾脏的细胞凋亡。     

骨髓间充质干细胞抑制外周血单核细胞向树突状细胞分化

目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSC)对单核细胞分化为树突状细胞(DC)的影响。方法:将分离培养的MSC与单核细胞共培养,加入DC分化诱导因子GM-CSF和IL-4(MSC+-DC),并以培养分化体系中无MSC存在的作为阳性对照(MSC--DC)。6d后收集悬浮细胞并用TNF-α诱导成熟48h。分别用流式细胞术、混合淋巴细胞反应及扫描电子显微镜检测细胞的表型、免疫功能及细胞形态。结果:同阳性对照DC相比,与MSC共培养得到的细胞上DC相关分子的表达明显较低,包括CD80,CD86,CD1a,CD83;而CD14分子则持续性高表达;与MSC共培养的细胞刺激异基因T淋巴细胞增殖的能力亦显著降低。形态学上,细胞胞体小,胞质突起不明显甚至缺如。结论:MSC抑制单核细胞向DC分化和成熟。