人TβRⅡ-ⅠgG1Fc融合基因重组腺病毒载体的构建

目的构建含有人TGF-βRⅡ型受体胞外区及ⅠgG1Fc段融合基因的腺病毒载体，并进行初步的功能活性鉴定。方法RT-PCR扩增人TGF-β1Ⅱ型受体胞外区及IgG1Fc段基因。通过Overlap PCR融合为目的基因hTTβRⅡ-ⅠgG1Fc；克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒．线性化后转染含骨架质粒的BJ5183菌．同源重组构建腺病毒质粒；将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞，并扩增、纯化、RT-PCR鉴定；ELISA初步检测重组腺病毒的功能活性。结果目的基因经酶切分析、测序鉴定正确；RT—PCR及ELISA表明重组腺病毒能表达hTβRⅡ-ⅠgG1Fc，中和HLF分泌的TGF-β1。结论成功构建了含融合基因hTβRⅡ-ⅠgG1Fc的腺病毒载体，体外实验证实表达的蛋白具有中和TGF-β1的作用，为进一步研究放射性肺纤维化的基因治疗提供实验依据。     

TGF-βRⅡ/Fc融合基因真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 构建TGF-βRⅡ/FC融合基因的真核表达载体pIg-TRⅡ，使其在中国仓鼠肾细胞（CHO）中呈分泌性表达，为肺间质纤维化基因治疗的研究奠定基础。方法 采用RT-PCR方法从正常人肺组织中扩增出目的基因TGF-βRⅡcDNA的胞膜外部分，再将TGF-βRⅡcDNA片段亚克隆到pIg真核表达载体，该载体在其多克隆位点下游含有人IgG1Fc基因组片段，由此可形成TGF-βRⅡ/FC融合基因；采用脂质体转染技术转染CHO细胞使其瞬时表达融合蛋白；应用细胞免疫荧光技术检测融合蛋白的表达；采用免疫沉淀的方法检测CHO细胞培养上清内融合蛋白的表达。结果 DNA测序结果在Blast上作同源性比较证明插入片段就是TGF-βRⅡcDNA的胞膜外部分，细胞免疫荧光染色呈阳性反应，CHO细胞培养上清内检测到融合蛋白的表达。结论 pIg-TRⅡ真核表达载体构建成功，并能够在CHO细胞中分泌性表达有活性的融合蛋白TGF-βRⅡ/FC。     

人截断型转化生长因子β受体Ⅱ真核表达载体的构建和表达

目的构建无细胞内段基因的人转化生长因子βⅡ型受体（△TβRⅡ）的真核表达载体pEGFP／△TβRⅡ，转染L02细胞以表达融合蛋白EGFP／△TβRⅡ，并检测其生物学活性。方法以质粒H2-3FF为模板，用PCR方法扩增得到人转化生长因子βⅡ型受体（TpRⅡ）胞外段和跨膜段的cDNA，将该cDNA克隆到真核表达载体pEGFP-N2上，构建成pEGFP／△TβRⅡ重组质粒。经双酶切和核酸测序鉴定，将该重组质粒转染L02细胞，用倒置荧光显微镜观察融合蛋白EGFP的表达，并检测其生物学活性。结果L02细胞转染pEGFP／△TβRⅡ重组质粒后，在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP的表达，所表达的蛋白能显著减轻TGF-β1对L02细胞G1～S期的阻滞作用。结论成功构建了pEGFP／△TβRⅡ重组质粒，并表达了有活性的融合蛋白EGFP／△TβRⅡ，为进一步探讨其生物学效应奠定了基础。     

人TβRⅡ-IgG1Fc融合基因重组腺病毒载体的构建

目的 构建含有人TGF-β1Ⅱ型受体胞外区及IBG1Fc段融合基因的腺病毒载体,并进行初步的功能活性鉴定.方法 RT-PCR扩增人TGF-β1Ⅱ型受体胞外区及IgG1Fc段基冈,通过Overlap PCR融合为目的 基因hTβRⅡ-IgG1Fc;克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒,线性化后转染含骨架质粒的BJ 5183菌,同源重组构建腺病毒质粒;将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞,并扩增、纯化、RT-PCR鉴定;ELISA初步检测重组腺病毒的功能活性.结果 目的 基因经酶切分析、测序鉴定正确;RT-PCR及ELISA表明重组腺病毒能表达hTβRⅡ-IgG1Fc,中和HLF分泌的TGF-β1.结论 成功构建了含融合基因hTβRⅡ-IgG1Fc的腺病毒载体,体外实验证实表达的蛋白具有中和TGF-β1的作用.为进一步研究放射性肺纤维化的基因治疗提供实验依据.     

原发性肝癌中转化生长因子β1及其Ⅱ型受体表达与病理学意义

目的：研究原发性肝癌中TGF－β1及其Ⅱ型受体（TGF－β1RⅡ，TβRⅡ）表达及其与病理学特征的关系。方法：运用免疫组化方法（SABC法）检测67例肝癌和癌旁组织中TGF－β1及TβRⅡ的表达。结果：TGF－β1癌旁组织中表达高于癌组织，实质细胞，间质细胞均有不同程度的表达；在肝外转移组，包膜浸润组其表达显著增高。TβRⅡ在肝癌细胞中多为阴性，但部分癌细胞胞浆中有表达；癌旁肝细胞中其表达较正常对照减少；在门脉癌栓组，包膜浸润组，Edmondson分级Ⅲ-Ⅳ级的肝癌组织中TβRⅡ的表达显著降低。结论：肝癌中TGF－β信号途径发生障碍。TGF－β1表达增高，通过自分泌和旁分泌方式发挥作用。肝癌组织中TβRⅡ表达降低，并可能存在转运障碍。TGF－β1的上调及TβRⅡ的缺失，转运障碍是肝癌发生，演进中的重要步骤。     

大鼠转化生长因子βⅡ型受体胞外区与γ干扰素融合蛋白真核表达载体的构建

目的:在哺乳动物细胞中表达有生物学活性的大鼠转化生长因子βⅡ型受体胞外区与γ干扰素(rsTGFβRⅡ-IFNγ)融合蛋白.方法:提取大鼠肝脏mRNA,用RT-PCR方法分别扩增sTGFβRⅡ和IFNγ基因并克隆至同一真核表达载体pSecTag2A,构建pSecTag2A/rsTGFβRⅡ-IFNγ重组体,以脂质体转染至CHO细胞,用ELISA及Western印迹法检测rsTGFβRⅡ-IFNγ表达,并检测该融合蛋白的生物学活性.结果:转染pSecTag2A/rsTGFβRⅡ-IFNγ的CHO细胞培养上清表达rsTGFβRⅡ-IFNγ融合蛋白,该融合蛋白具有明显的抗病毒活性,能拮抗TGFβ1对CCL-64细胞的增殖抑制作用,能抑制TGFβ1诱导的体外培养的HSC活化.结论:本实验构建的pSecTag2A/rsTGFβRⅡ-IFNγ表达质粒能在哺乳动物细胞中表达具有生物学活性的rsTGFβRⅡ-IFNγ融合蛋白.     

人可溶性转化生长因子βⅡ型受体真核表达载体的构建及表达

目的:构建人转化生长因子βⅡ型受体胞外区(sTGFβRⅡ)基因的真核表达载体,转染真核细胞CHO以表达sTGFβRⅡ蛋白,并检测其生物学活性.方法:以TGFβRⅡ的重组质粒为模板,用PCR方法扩增得到人TGFβRⅡ胞外区(1-159位氨基酸)的cDNA,将该cDNA重组到真核表达载体pCDNA3.1/myc-his(-)B(pCDNA)的EcoRⅠ和HindⅢ多克隆位点上,构建成pCDNA-sTGFβRⅡ重组质粒.经双酶切和核酸测序鉴定,将该重组质粒转染CHO细胞,用Western blotting法检测sTGFβRⅡ的表达,并测定其生物学活性.结果:CHO细胞转染pCDNA-sTGFβRⅡ重组质粒后,其培养上清经 Western blotting分析,显示有特异性的蛋白条带,所表达的蛋白能明显抑制TGFβ1对貂肺上皮细胞的增殖抑制作用.结论:成功克隆了sTGFβRⅡ基因,并获得有生物学活性的sTGFβRⅡ蛋白.     

肝外胆管癌中TGF-β1, TGF-β2, TGF-β RI和TGF-β RⅡ的表达及意义

目的：探讨TGF－β1，TGF－β2，TGF－βRI及TGF－βRⅡ在肝外胆管癌中的表达及其与肿瘤的临床分期、病理分级的关系。方法：用抗TGF－β1，TGF－β2，TGF－βR I及TGF－βRⅡ的多克隆抗体，进行免疫组化染色，分别检测38例肝外胆管癌、14例非肿瘤胆管组织（8例胆总管囊肿、6例正常胆管)中TGF－β1，TGF－β2，TGF－βR I及TGF－βRⅡ的表达。结果：(1)TGF－β1及TGF－β2的阳性表达率增高（94．75％与92．11％）；TGF－βR I及TGF－βⅡ的阳性表达率明显降低（31．58％与28．95％）。（2）TGF－βRI，TGF－βRⅡ的阳性表达率在转移组中明显低于未转移组（12．5％，14．29％，33．33％对66．67％及18．75％，14．29％，0对58．33％）。结论：TGF－β1，TGF－β2，TGF－βRI及TGF－βRⅡ在肝外胆管癌中的异常表达，提示它们在肝外胆管癌的发生中起着重要作用，对其进行检测可作为肝外胆管癌的辅助诊断参考指标之一，并可为肝外胆管癌自然病程的判断和治疗方法的选择提供部分依据。     

Ⅰ型和Ⅱ型TGF—β受体在人增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中表达的研究

运用免疫组化技术检测增生性瘢痕（HTS）和瘢痕疙瘩（KS）中Ⅰ型（RⅠ）和Ⅱ型（RⅡ）TGF－β受体的表达和分布情况，了解TGF－β受体在人HTS和KS形成中的作用。结果发现，HTS成纤维细胞（Fb）表面RⅠ和RⅡ有阳性表达，而且随着病程的延长，受体表达逐渐减弱，直到消失；KS浸润部Fb表面RⅠ和RⅡ呈强阳性表达，中央部未见受体表达阳性的Fb；正常皮肤Fb表面受体表达阴性。提示在HTS形成过程中，不仅TGF－β增高，Fb表面Ⅰ型和Ⅱ型TGF－β受体也增高，使TGF－β作用放大；TGF－β及其受体可能与KS的浸润性生长有关。     

隔药灸调节大鼠溃疡性结肠炎肠纤维化TGF-β及其受体的研究

目的：观察隔药灸对大鼠溃疡性结肠炎肠纤维化结肠组织TGF－β及其受体基因表达的影响，探讨隔药灸防治大鼠溃疡性结肠炎肠纤维化的相关机制。方法：在建立大鼠溃疡性结肠炎肠纤维模型的基础上，采用针灸进行治疗，疗程结束后，剖取大鼠结肠组织，应用RT－PCR法检测各组动物结肠组织中TGF－β1及其TGF－βRⅠ、TGF－βRⅡmRNA表达情况，结果：与正常动物相比较，模型大鼠结肠组织中TGF－β1及其TGF－βRⅠ、TGF－βRⅡmRNA表达均有显著的上升，经隔药灸治疗则可明显改善这种异常状况，结论：隔灸防治溃疡性结肠炎肠纤维化可能与调节大鼠溃疡性结肠炎肠纤维化结肠TGF－β1及其受体TGF－βRⅠ、TGF－βRⅡmRNA表达，减少炎症组织TGF－β1的产生，并抑制其受体信号转导有关。     

大鼠转化生长因子β型受体胞外区与γ干扰素融合蛋白真核表达载体的构建

目的 :在哺乳动物细胞中表达有生物学活性的大鼠转化生长因子β 型受体胞外区与γ干扰素(rs TGFβR - IFNγ)融合蛋白。方法 :提取大鼠肝脏 m RNA,用 RT- PCR方法分别扩增 s TGFβR 和 IFNγ基因并克隆至同一真核表达载体 p Sec Tag2 A,构建 p Sec Tag2 A/rs TGFβR - IFNγ重组体 ,以脂质体转染至 CHO细胞 ,用EL ISA及 Western印迹法检测 rs TGFβR - IFNγ表达 ,并检测该融合蛋白的生物学活性。结果 :转染 p Sec Tag2 A/rs TGFβR - IFNγ的 CHO细胞培养上清表达 rs TGFβR - IFNγ融合蛋白 ,该融合蛋白具有明显的抗病毒活性 ,能拮抗 TGFβ1对 CCL- 6 4细胞的增殖抑制作用 ,能抑制 TGFβ1诱导的体外培养的 HSC活化。结论 :本实验构建的p Sec Tag2 A/rs TGFβR - IFNγ表达质粒能在哺乳动物细胞中表达具有生物学活性的 rs TGFβR - IFNγ融合蛋白。     

TGFβl及其受体TGFβRⅡ在宫颈鳞状上皮癌组织中的表达

目的 观察转化生长因子β1(TGFβ1)及其Ⅱ型受体(TGFβRⅡ)在宫颈鳞状上皮癌中的表达情况，探讨其与宫颈癌发生发展的关系。方法 应用免疫组化SP法检测40例宫颈鳞状上皮癌(病理分级I—Ⅲ级)中TCFβ1和TGFβRⅡ的蛋白表达，并与正常宫颈组织及慢性宫颈炎组织作半定量比较。结果 (1)正常宫颈组织及慢性宫颈炎组织中TGFβl和TGFβRⅡ表达于上皮细胞的脑浆内，两组表达水平差异无显著性(P＞0．05)；宫颈鳞状上皮癌组织中TGFβl和TGFβRⅡ蛋白表达位于癌细胞的脑浆内；(2)宫颈鳞状上皮癌组织中TCFβl蛋白表达水平明显上升，与前二组比较差异有显著性(P＜0．01)；(3)宫颈鳞状上皮癌组织中TCFβRⅡ蛋白表达明显下降，与前二组比较差异有显著性(P＜0．01)；(4)随着宫颈癌病理分级的增加，TGFβl表达水平上升，其差异也有显著性(P＜0．贴)，但TGFβRⅡ表达无显著性差异。结论 宫颈鳞状上皮癌的发生发展可能与TGFβl蛋白的高表达和TGFβRⅡ蛋白的低表达有关。     

肠型胃癌中TGF-β及细胞周期蛋白A过表达的临床意义

目的：探讨TGF－β1、TGF－β2、细胞周期蛋白A（CyclinA)在肠型胃癌及癌旁组织中表达的意义。方法：采用免疫组化法检测TGF－β1、TGF－β2、CyclinA的表达，结果：胃癌组织中TGF－β1、TGF－β2、CyclinA阳性率分别为59．5％（25／42）、73．6％（31／42）及85．7％（36／42），显著高于癌旁组织；有区域淋巴结转移，侵及浆膜或组织分化程度高者TGF－β1、TGF－β2阳性表达率显著增高（P＜0．05）。结论：胃癌组织TGF－β1、TGF－β2、CyclinA过表达可能在肿瘤分化程度、浸润、转移及预后中起重要作用。     

IL-2/Fc融合基因真核表达载体的构建和表达

目的：构建含人IL-2 cDNA基因和免疫球蛋白Fc片段融合基因的真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在真核细胞中表达，以期用于乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗的研究。方法：应用重叠延伸剪切技术(SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段IL-2／Fc，回收后克隆到中间pGEM—T：Easy TA克隆载体，得到合适的酶切位点后，用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA 3．1中，得到真核重组载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc。然后用脂质体法转染SP2／0细胞。结果：对重组载体进行限制性酶切鉴定及测序分析，证明连接正确；经ELISA检测证实，该重组载体能够在真核细胞中外分泌表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在SP2／0细胞中有效表达。     

TGFβRII-siRNA对肝星状细胞TGFβR/Smad信号通路的影响

目的：研究转化生长因子βⅡ型受体小干扰RNA（TGFβRⅡ-siRNA）对肝星状细胞TGFβR/Smad信号通路的影响。方法：构建TGFβRⅡ-siRNA的表达质粒,将TGFβRⅡ-siRNA质粒采用脂质体转染HSC-T6细胞。转染72 h后,采用半定量RT-PCR检测TGFβRⅡ、Samd2、Smad3、Smad7的mRNA的表达变化,放射免疫法测上清液Ⅲ型前胶原、IV型胶原和透明质酸含量变化。结果：与无关siRNA比较,TGFβRⅡ、Smad2和Smad3 mRNA表达差异有显著性（P〈0.01）,但Smad7表达差异无显著性,上清液Ⅲ型前胶原、IV型胶原和透明质酸含量明显减少（P〈0.01）。结论：TGFβRⅡ-siRNA下调TGFβRⅡ、Samd2、Smad3 mRNA表达,减少肝星状细胞胶原合成,但对Smad7 mRNA无明显下调。     

人TGFβ1cDNA高表达重组质粒的构建

目的为了得到基因工程制备的人重组TGFβ1,构建人TGFβ;cDNA高表达重组质粒。方法从人血小板中提取总RNA,经RT－PCR得到TGFβ;cDNA基因,并克隆到表达质粒pBLMVL2中,构建了在PL启动控制基因表达质粒pBLMVL2－TGFβ;,使其在大肠杆菌中进行温敏诱导表达。结果RT－PCR得到的TGFβcDNA经DNA序列分析与文献报道一致,pBLMVL2－TGFβ1在大肠杆菌中表达产物人重组TGFβ1经还原型SDS－PAGE电泳,呈一条蛋白条带,分子量12．5kd,表达产物约占全菌蛋白20％。结论构建的重组质粒pBLMVL2－TGFβ1能高表达人重组TGFβ1。     

人MR1/IgG1 Fc二聚体融合蛋白的构建、表达及功能检测

目的 构建MR1/IgG1 Fc融合蛋白杆状病毒表达载体并使其在昆虫细胞内表达获得MR1/IgG1 Fc二聚体,制备人工抗原提呈细胞用于黏膜相关恒定T细胞(MAIT)反应性代谢物及MAIT细胞功能调控研究。方法 从人外周血单个核细胞中扩增β2m编码基因。商业化合成MR1胞外段和IgG1 Fc融合基因的全序列基因MR1/IgG1 Fc,与β2m基因重组构建pFastBac^TM Dual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]表达载体;利用Bac-to-Bac昆虫表达系统表达MR1/IgG1 Fc二聚体融合蛋白,并通过双抗体夹心ELISA、Western blot及流式细胞术进行检测。建立MR1/IgG1 Fc二聚体加载的人工抗原提呈细胞(artificial antigen presenting cells, aAPCs),即MR1 aAPCs,提呈大肠埃希菌(DH5α)来源的代谢物,与人外周血单个核细胞共培养,检测MAIT细胞的活化和增殖水平。结果 经PCR及测序鉴定证实pFastBac^TM Dual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]载体中MR...     

子宫内膜样腺癌间质细胞和癌细胞TGFβR/Smads的表达

目的探讨子宫内膜间质细胞转化生长因子β受体（TGFβR）、Smad蛋白（Sma-and Mad-related protein )信号通路的状态和癌细胞TGFβR/Smads信号通路的关系,及其这一信号通路可能对子宫内膜癌发生发展的影响。方法采用SP免疫组化方法检测12例子宫肌瘤、18例子宫内膜样腺癌中TGFβRⅠ、TGFβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达。结果在正常子宫内膜细胞中均有TGFβRⅠ、TGFβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达,正常子宫内膜腺体上皮细胞和间质细胞中TGFβR蛋白与Smads蛋白的表达一致,两者成正相关（r=0.86, r=0.78）;子宫内膜癌癌细胞和间质细胞中TGFβR/Smads蛋白的表达不一,子宫内膜癌本身的间质细胞TGFβR/Smads蛋白表达缺陷。结论正常子宫增生期／分泌期内膜细胞存在TGFβR/Smads信号表达,子宫内膜癌本身的间质细胞存在TGFβR/Smads信号缺陷;探讨内膜间质细胞TGFβR/Smads信号通路作用,为内膜癌的基因治疗提供了新的靶点。     

皮肤黑色素瘤细胞中TGF-βRⅠ型和Ⅱ型受体表达的研究

目的：探讨转化生长因子β受体（TGF‐βR）Ⅰ、Ⅱ型在皮肤黑色素瘤细胞中的表达情况。方法应用反转录‐实时荧光定量PCR（RT‐PCR）和蛋白免疫印迹（Westernblot）方法,对TGF‐βRⅠ、Ⅱ型的mRNA及其蛋白在人皮肤黑色素瘤A375细胞和人正常黑素细胞中的表达进行检测。结果A375细胞中TGF‐βRⅠ、Ⅱ型的mRNA和蛋白表达均显著低于正常人黑素细胞。结论在黑色素瘤细胞的TGF‐β／Smad信号通路中出现TGF‐βR表达的下调,可能是皮肤黑色素瘤发病机制之一。     

LTβR-Ig融合蛋白的真核表达及其体外生物学功能的研究

目的 为了研究LTβR-Ig的生物学功能,构建重组的LTβR-Ig/pcDNA3.1（＋）真核表达载体,在CHO细胞中表达,无血清扩大培养,并初步研究了融合蛋白LTβR-Ig的体外生物学活性。方法 将鼠LTβR胞外段cDNA与人IgG1 Fc段cDNA共同克隆至真核表达载体pcDNA3.1（＋）,转染CHO-K细胞表达,阳性克隆进行无血清培养,采用PtoteinA亲和层析的方法进行纯化;3[H]TdR参入法检测对细胞增殖的影响。结果经PCR和限制性酶切鉴定以及DNA测序,结果 表明克隆了正确序列的LTβR胞外段序列,成功构建了重组表达质粒LTβR-Ig/pcDNA3.1,并在CHO细胞中稳定表达了LTβR-Ig的融合蛋白,证明LTβR-Ig融合蛋白能抑制混合淋巴细胞反应。结论 本研究建立了能稳定表达有生物活性的LTβR-Ig融合蛋白的真核表达系统,为今后研究LTβR在移植排斥中的作用机制,及开展基因重组药物进行疾病的生物治疗奠定了基础。