脂多糖诱导肺微血管内皮细胞SSeCKS mRNA表达的研究

目的 研究脂多糖(LPS)对体外培养大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)中Src抑制的蛋白激酶C底物(SSeCKS)mRNA表达的影响,以及甲泼尼龙对其的干预作用.方法 体外培养大鼠PMVEC,根据与LPS孵育时间和LPS剂量不同随机分组,并用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测PMVEC中SSeCKS mRNA的表达变化.结果 正常情况下,PMVEC中SSeCKS mRNA低表达.LPS在体外可诱导SSeCKS mRNA的表达明显增高,表达水平变化与LPS呈剂量和时间依赖关系:LPS孵育1 h后,PMVEC中SSeCKS mRNA的表达量随LPS剂量增加而逐渐增高(正常对照组为0.263±0.033;LPS 0.1 mg/L时为0.529±0.066,1 mg/L时为1.391±0.048,10 mg/L时为2.339±0.055,100 mg/L时为2.861±0.069),组间比较差异有统计学意义(F=639.096,P＜0.05);10 mg/L的LPS与PMVEC共用孵育,0.5 h SSeCKS mRNA表达开始增高,1 h时达峰值,之后逐渐降低,12 h表达仍高于正常水平(正常对照组为0.301±0.022;LPS 0.5 h为1.617±0.018,1 h为2.378±0.031,3 h为2.148±0.056,6 h为1.322±0.042,12 h为0.772±0.044),组间比较差异有统计学意义(F=726.346,P＜0.05).甲泼尼龙干预后可显著抑制LPS诱导的SSeCKS mRNA表达增高(2.664±0.104比1.759±0.151,F=156.000,P＜0.05).结论 ①LPS可诱导大鼠PMVEC中SSeCKS mRNA表达上调,并呈剂量和时间的依赖关系,提示SSeCKS与LPS诱导的大鼠PMVEC损伤有关.②甲泼尼龙参与可抑制LPS诱导的SSeCKS mRNA表达增高.     

TNF-α对肺微血管内皮细胞ERM蛋白表达的研究

目的 观察肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)表达埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ezrin-radixin-moesin,ERM)及磷酸化ERM蛋白(p-ERM)的影响,并初步探讨Rho激酶(ROCK)与ERM蛋白磷酸化的关系.方法 体外培养大鼠PMVEC,随机(随机数字法)分为TNF-α量效组(0、0.1、1、10 μg/L TNF-α与PMVEC孵育60 min)、TNF-α时效组(10 μg/LTNF-α分别与PMVEC孵育0、15、30、60、90、120、180 min)和ROCK抑制剂(Y-27632)干预组:分别以10μg/L的TNF-α和30 μmol/L Y-27632+ 10 μg/LTNF-α与PMVEC孵育60min.Western印迹检测ERM蛋白及p-ERM相对表达量.采用SPSS 16.0软件进行分析,多组变量间比较采用单因素方差分析,以P＜ 0.05为差异具有统计学意义.结果 Western印迹检测到大鼠PMVEC均表达ERM蛋白和p-ERM,量效组p-ERM表达量随TNF-α浓度(0、0.1、1、10 μg/L)增加逐渐升高,分别为0.648±0.102、0.728±0.082、0.926±0.121、1.245±0.134(均P=0.000).时效组p-ERM相对表达量于15 min开始上升(0.777±0.151),90 min达高峰(1.295±0.176),之后渐下降,120 min (0.802±0.139),180 min仍维持较高水平(0.769±0.128),分别与未刺激0 min组(0.631±0.123)比较,P=0.004,0.000,0.001,0.016.ROCK抑制剂预处理PMVEC后再给予TNF-α刺激,p-ERM相对表达量(0.634±0.112)较单独TNF-α刺激组(0.875±0.164)显著减少(P =0.002),而较单独ROCK抑制剂组(0.661±0.108)和未处理组(0.654±0.125)差异无统计学意义(分别为P=0.973,P=0.900).结论 TNF-α诱导大鼠PMVEC中的ERM蛋白磷酸化表达增加,ROCK参与其磷酸化调控.     

血小板活化因子诱导大鼠肺微血管内皮细胞Src抑制的蛋白激酶C底物基因表达

目的 研究血小板活化因子(PAF)对大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVEC)中Src抑制的蛋白激酶C底物(SSeCKS)mRNA表达的影响及其信号转导途径.方法 体外培养RPMVEC,采用细胞原位杂交技术检测不同刺激条件下RPMVEC中SSeCKS mRNA的表达变化.结果 正常RPMVEC中有少量SSeCKSmRNA表达,为棕黄色细颗粒状杂交信号,分布于胞质;用10~(-10)、10~(-9)、10~(-8)、10~(-7) mol/L的PAF分别孵育RPMVEC 1.5 h,SSeCKS mRNA表达随其浓度增加而升高(分别为0.054 9±0.000 7、0.059 9±0.001 8、0.069 0±0.001 8、0.075 4±0.001 9),与正常对照组(0.036 8±0.003 7)比较差异均有统计学意义(均P<0.05);10~(-7) mol/L PAF刺激RPMVEC 0.5、1.5、3、6、12、24 h,SSeCKS mRNA表达水平于0.5 h即显著升高(0.071 0±0.001 5),1.5 h达峰值(0.075 6±0.001 7),之后逐渐下降,24 h时(0.043 9±0.001 0)仍高于正常对照组(0.038 2±0.004 1,均P<0.05);10 μmol/L核转录因子-κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二巯基氨甲酸(PDTC)预处理RPMVEC 1 h可显著下调Par对SSeCKS mRNA的诱导效应(0.049 7±0.003 2比0.071 9±0.001 9,P<0.05),而蛋白激酶C(PKC)抑制剂双吲哚基顺丁烯二酰亚胺(BIM)预处理RPMVEC0.5 h则不影响此效应(0.069 7±0.002 1比0.071 9±0.001 9,P>0.05).结论 PAF呈浓度和时间依赖的方式上调RPMVEC中SSeCKS基因转录;NF-κB信号通路而非PKC参与了PAF的诱导效应.     

谷氨酰胺抑制内毒素诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞TNF-α释放

目的 研究谷氨酰胺(Gin)调节内毒素(LPs)诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)肿瘤坏死因子(TNF)-α分泌及谷胱甘肽(GSH)在其中的作用.方法 原代培养成年雄性SD大鼠AECⅡ细胞,原代培养24 h后,分为空白对照、10.0 mmol/L Gin,1 μg/mL LPS、LPS+(0.5、2.0和10.0 mmol/L)Gln六组,每组3个孔.LPS刺激24 h,Gln在LPS刺激前8 h加入;另一组实验分为l μg/mL LPS,LPS+10.0 mmol/L Gln,LPS+100 μmol/L丁硫氨酸哑砜胺(BSO)、LPS+Gln+(1、10和100 μmol/L)BSO六组,每组3个孔.LPS刺激24 h,BSO和Gln在LPS刺激前8 h加入.以二硫双硝基苯甲酸(DTNB)法测定细胞内GSH浓度,酶联免疫(ELISA)法测定细胞上清TNF-α水平.统计学方法用方差分析(LDS-t检验)比较各组间差异.结果 谷氨酰胺可以提高LPS诱导大鼠AECⅡ细胞的GSH浓度,降低TNF-α的水平,其作用随浓度的增加而增加,在10 mmol/L浓度最为显著,GSH水平从(50.69±3.04)pmol/mgcell上升到(126.74±7.13)pmol/mg cell(P<0.01),TNF-α水平从(1104.5±48.8)pg/mL下降到(329.67±48.27)pg/mL(P<0.01);同时,谷氨酰胺的作用可以被10 μmol/L以上浓度BSO显著阻断(P<0.01).结论 谷氨酰胺可以抑制LPS诱导的大鼠AECⅡ细胞TNF-α的释放,其作用可能是通过促进GSH的合成而实现的.     

脂多糖诱导血管平滑肌细胞分泌白细胞介素-6及p38丝裂素活化蛋白激酶的调控作用

目的 探讨p38丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路在脂多糖(LPS)作用下血管平滑肌细胞(VSMC)分泌白细胞介素-6(IL-6)中的调节作用.方法 将体外培养的大鼠胸主动脉VSMC分为LPS刺激组、p38MAPK抑制剂SB203580干预组、SB203580对照组和溶液对照组.LPS组以终浓度100μg/L的LPS与VSMC共同孵育;干预组VSMC以p38MAPK抑制剂SB203580 10μmol/L预处理2 h,再加入终浓度100 9g/L的LPS共同孵育;对照组仅以SB203580 10 μmol/L预处理2 h;溶液组仅加入去血清培养液培养.各组于培养0、3、6、12、24 h后采用实时聚合酶链反应(real-time PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测细胞IL-6 mRNA和上清液中IL-6蛋白表达.结果 LPS刺激3 h,VSMC中IL-6 mRNA和蛋白表达即出现明显增高CmRNA(21.3±3.2)×104,蛋白(296.2±19.6)ng/L],12 h达高峰CmRNA(131.4±11.2)×104,蛋白(897.7±34.0)ng/L],24 h有所降低[mRNA(15.3±4.7)×104,蛋白(194.3±24.0)ng/L],但仍显著高于溶液组(mRNA(9.4±1.9)×104,蛋白(29.4±4.4)ng/L,均P<0.05].干预组3、6、12 h可明显抑制LPS诱导VSMC中IL-6的分泌[mRNA(15.4±3.6)×104、(43.2±6.6)X 104、(56.2±5.5)×104,蛋白(180.3±23.6)、(432.2±56.8)、(546.2±57.9)ng/L,均P<0.05].结论 LPS诱导VSMC可明显增加IL-6的mRNA和蛋白表达,p38MAPK抑制剂SB203580可显著抑制IL-6转录和蛋白合成,表明p38MAPK信号转导通路可能通过直接或间接作用参与了IL-6的分泌调节作用.     

间充质干细胞对巨噬细胞活化及其功能影响的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSC)对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞活化的影响.方法 采用贴壁筛选法分离、纯化小鼠骨髓MSC,巯基乙酸钠腹腔注射刺激后收集小鼠腹腔巨噬细胞(MPM).实验分为四组(A组:MPM;B组:MPM+LPS;C组:MPM+LPS+MSC;D组:MPM+LPS+MSC上清),建立共培养体系.在LPS(终浓度1 μg/ml)刺激巨噬细胞18 h后收集细胞培养上清,检测TNF-α、TGF-β和一氧化氮(NO)等细胞因子分泌量的变化,同时在体系中加入大肠杆菌标准菌株ATCC25922,共孵育24 h后瑞特染色检查巨噬细胞吞噬功能的变化.结果 巨噬细胞活化后培养上清中TNF-α和NO的含量明显上升[分别为(147.4±37.1)pg/ml,(59.9±8.7)μmol/L];而MSC存在时,TNF-α显著减少[(97.6±30.3)pg/ml,P=0.032],NO降到(50.9±29.5)μmol/L(P＞0.05);当有MSC上清存在时,TNF-α和NO进一步减少为(58.3±31.5)pg/ml,(-3.4±2.3)μmol/L(P＜0.01).MSC对巨噬细胞活化后的吞噬率及吞噬指数没有影响.结论 MSC可抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的活化,而对其吞噬功能没有影响.     

乌司他丁干预对水下爆炸致兔急性肺损伤TNF-α表达的影响

目的探讨乌司他丁干预对水下爆炸致兔急性肺损伤时肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的影响。方法健康新西兰兔随机分为爆炸损伤组与乌司他丁治疗组,以水下爆炸致兔急性肺损伤,用免疫酶联法检测爆炸后4,12和24 h血清中TNF-α浓度。以SPSS17.0统计软件进行分析,P0.05为差异具有统计学意义。结果爆炸后4 h乌司他丁组TNF-α浓度为386.90±109.22ng/L,爆炸损伤组TNF-α浓度为538.20±201.43ng/L,二者相比无变化(t=2.088,P=0.051);爆炸后12h乌司他丁组TNF-α浓度为400.60±78.98 ng/L,爆炸损伤组TNF-α浓度为573.80±178.24ng/L,二者相比差异有统计学意义(t=2.809,P=0.012);24h乌司他丁组TNF-α浓度为356.10±130.99 ng/L,爆炸损伤组为552.30±169.64 ng/L,二者相比差异也有统计学意义(t=2.895,P=0.010)。结论乌司他丁干预下实验兔在爆炸12h后血清TNF-α降低。     

辛伐他汀对脓毒症早期大鼠肝脏损害的影响

目的探讨辛伐他汀对脂多糖(LPS)致大鼠脓毒症模型肝损害的保护作用及相关机制.方法将56只雄性 SD 大鼠按随机数字表法分为对照组(8只)、模型组(24只)、辛伐他汀组(24只).腹腔注射LPS 10 mg/kg 复制脓毒症大鼠模型.对照组和模型组于腹腔注射生理盐水或 LPS 前给予生理盐水1 ml/d 灌胃,辛伐他汀组于制模前给予辛伐他汀20 mg·kg-1·d-1灌胃,均连续1周.于制模后6、12、24 h 测定血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL-6、IL-10)水平及肝脏组织丙二醛(MDA)含量,并观察24 h 肝脏组织病理学改变.结果与对照组比较,模型组和辛伐他汀组各时间点血清 ALT(U/L)、AST(U/L)、TNF-α(ng/L)、IL-6(ng/L)、IL-10(ng/L)及肝组织 MDA(nmol/mg)水平均明显升高(均P<0.05).模型组制模后12 h ALT、AST 达峰值,制模后6 h TNF-α、IL-6、IL-10、MDA 达峰值,以后有所下降.辛伐他汀组制模后24 h ALT、AST 较模型组下降更显著(ALT:60.5±8.9比81.8±13.9,AST:167.9±19.7比200.9±26.9,均 P<0.05),制模后6 h TNF-α较模型组显著降低(105.5±19.5比154.1±24.1,P<0.05),制模后6 h、12 h IL-6、MDA 较模型组明显下降(6 h IL-6:2910.9±353.6比3777.8±687.4,12 h IL-6:386.1±48.3比475.2±45.9;6 h MDA :0.60±0.09比0.73±0.12,12 h MDA :0.49±0.09比0.60±0.12,均P<0.05),IL-10较模型组显著升高(6 h:2090.6±262.5比1690.6±187.0,12 h:548.9±45.4比496.9±45.2,均P<0.05);24 h 肝组织病理学改变较模型组明显改善.结论辛伐他汀通过抗炎及减轻氧化应激反应对 LPS 诱导的脓毒症大鼠肝脏具有保护作用.     

结核病患者细胞因子检测及其保护性免疫机制研究

目的探讨细胞因子及趋化性细胞因子在结核患者保护性免疫中的作用。方法用ELISA方法检测结核患者及正常人外周血单个核细胞(PBMC)经重组人白细胞介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)及脂多糖(LPS)刺激后培养上清液中调节激活正常T细胞表达及分泌因子(RANTES)和巨噬细胞炎性蛋白1-α(MIP1-α)的含量。结果结核患者PBMC用TNF-α或IFN-γ加LPS刺激组RANTES的分泌量[TNF-α组(1731．86±925．60)ng／L、IFN-γ组(2 120．78±1 120．72)ng／L]明显高于单用LPS刺激组[(1 102．56±873．44)ng／L,P<0．01)]。用重组人IL-4加LPS刺激,结核患者PBMC RANTES的分泌量[(1 333．90±621．82)ng／L]与单加LPS刺激组[(1 102．56±873．44)ng／L]相比两组的差异无统计学意义(P>0．05)。正常人及结核患者的PBMC经IL-4、TNF-α、IFN-γ及LPS刺激后MIP1-α分泌量无明显变化。结论TNF-α、IFN-γ及RANTES在结核患者的保护性免疫中可能起着重要的作用。     

乌司他丁对脓毒症大鼠急性肺损伤的保护作用及其机制研究

目的研究乌司他丁对脂多糖诱导的脓毒症大鼠急性肺损伤的保护作用及其机制。方法将52只大鼠分为乌司他丁组和对照组,每组26只。两组大鼠腹腔注射脂多糖溶液(10 mg/kg)以制备脓毒症模型,分别于建模前18 h和3 h,乌司他丁组大鼠给予乌司他丁(100 000 U/kg),对照组注射等量生理盐水。于造模成功后0.5、2、4、12、24、72 h各时间点采血检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-10及肺泡灌洗液蛋白浓度,并通过光学显微镜观察肺组织病理学改变。结果两组大鼠血浆TNF-α、IL-6、IL-10及肺泡灌洗液总蛋白浓度各时间点比较,差异均有统计学意义(F=5.899,P=0.040;F=7.932,P=0.029;F=18.450,P=0.005;F=6.467,P=0.038),且与对照组相比较,乌司他丁组在0.5、2、4、12、24、72 h各时间点的血浆TNF-α[(21.6±3.8)ng/L vs.(14.8±2.5)ng/L,(69.2±3.2)ng/L vs.(48.8±3.9)ng/L,(74.8±6.9)ng/L vs.(56.3±4.2)ng/L,(120.2±43.8)ng/L vs.(106.4±65.8)ng/L,(190.2±30.4)ng/L vs.(119.8±28.9)ng/L,(159.7±10.5)ng/L vs.(112.3±10.2)ng/L]、IL-6[(145±6)ng/L vs.(119±5)ng/L,(344±19)ng/L vs.(225±22)ng/L,(458±36)ng/L vs.(273±28)ng/L,(949±64)ng/L vs.(328±27)ng/L,(841±61)ng/L vs.(306±6)ng/L,(899±35)ng/L vs.(278±16)ng/L]及肺泡灌洗液总蛋白浓度[(320±8)mg/L vs.(290±17)mg/L,(400±7)mg/L vs.(336±9)mg/L,(536±10)mg/L vs.(492±14)mg/L,(806±10)mg/L vs.(608±17)mg/L,(781±17)mg/L vs.(579±16)mg/L,(662±24)mg/L vs.(505±9)mg/L]均明显降低(P均0.05),而血浆IL-10浓度[(5.7±0.8)ng/L vs.(11.7±0.9)ng/L,(17.2±1.6)ng/L vs.(31.9±2.6)ng/L,(22.3±2.1)ng/L vs.(54.7±4.8)ng/L,(42.3±4.9)ng/L vs.(80.7±1.9)ng/L,(29.7±1.4)ng/L vs.(69.4±3.4)ng/L,(21.4±2.9)ng/L vs.(74.3±5.5)ng/L]均明显升高(P均0.05)。对照组大鼠肺泡间隔增厚,间质充血水肿,炎性细胞浸润,肺泡塌陷,而乌司他丁组大鼠上述病理学改变明显减轻。结论乌司他丁是通过下调TNF-α、IL-6,上调IL-10水平,从而抑制炎症细胞在肺部的浸润以及肺组织中蛋白酶的表达来保护脂多糖诱导的脓毒症大鼠急性肺损伤。     

核因子-κB对胰腺AR42J细胞肿瘤坏死因子-α表达的调控

目的 探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对胰腺腺泡AR42J细胞细胞因子表达的影响及其可能机制,进一步阐明急性胰腺炎的发病机制.方法 用不同质量浓度的LPS(0.001,0.01,0.1,1,10,100 mg/L)刺激AR42J细胞18 h,同时用10mg/L的LPS刺激AR42J细胞不同时间(2,6,12,18,24h),RT-PCR检测核因子-κB(NF-κB)P65和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达的变化,放射免疫法(RIA)检测培养液上清TNF-α蛋白浓度的改变.对NF-κB(P65)mRNA的表达与TNF-α mRNA的表达进行相关和回归分析.结果 RT-PCR结果表明0.001 mg/L的LPS处理AR42J细胞时即可出现TNF-α及NF-κB(P65)mRNA表达的明显上调,且呈量效关系;用10 mg/L的IPS处理后,在2 h后即可出现TNF-α及NF-κB(P65)mRNA表达的明显上调,并且呈时效关系.RIA结果表明用0.01 mg/L的LPS处理AR42J细胞后即可出现TNF-α蛋白表达的明显上调,且呈量效关系;用10mg/L的LPS处理后,在6 h后即可出现TNF-α蛋白表达的明显上调,并且呈时效关系.TNF-α mRNA的表达与P65 mRNA的表达呈正相关.结论 LPS可以以时间剂量依赖方式地刺激AR42J细胞NF-κB(P65)和TNF-α的表达,NF-κB(P65)mRNA的表达与TNF-αmRNA的表达呈正相关.针对NF-κB靶点,抑制其活性,可为包括AP的治疗提供一条新的途径.     

B16F10黑素瘤细胞培养上清液对脂多糖刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α和一氧化氮的影响

目的 探讨B16F10黑素瘤细胞培养上清液对脂多糖(LPS)刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和一氧化氮(NO)的影响.方法 体外培养同基因小鼠腹腔巨噬细胞,分为实验组和空白对照组.实验组加入B16F10黑素瘤细胞培养上清液,空白对照组加入RPMI 1640完全培养基,分别用LPS刺激后继续培养24 h,采用免疫细胞化学染色法及L929细胞抑制实验[四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法]检测巨噬细胞TNF-α的表达及活性,Griess法检测NO的含量.结果 实验组TNF-α阳性表达较空白对照组明显减少,TNF-α活性较空白对照组明显降低[吸光度(A值):0.746±0.049比0.387±0.030,P＜0.01];巨噬细胞释放NO的水平明显低于空白对照组(μmol/L:4.830± 1.384比11.455±0.175,P＜0.01).结论 B16F10黑素瘤细胞培养上清液对LPS诱导的同基因小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α、NO具有抑制作用.     

慢性血吸虫感染对脓毒症小鼠保护作用的研究

目的 初步探讨慢性血吸虫(SJ)感染对脓毒症小鼠的保护作用及其机制.方法 选择BALB/c雄性小鼠,按随机数字表法分组进行三部分实验.实验1:经腹部皮肤接种SJ尾蚴感染8周建立慢性SJ感染模型,分为正常组和SJ组,每组10只;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清白细胞介素(IL-4和IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)水平,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测腹腔巨噬细胞IL-10和TNF-α的mRNA表达,了解慢性SJ感染小鼠免疫状态.实验2:以脂多糖(LPS)腹腔注射诱导小鼠脓毒症模型,分为LPS组和SJ-LPS组,每组15只;用ELISA法动态观察注射LPS后0、24、48和72 h细胞因子的变化,0 h的水平相当于正常小鼠和SJ感染8周水平,观察慢性SJ感染对脓毒症过程的影响.实验3:分别以盲肠结扎穿孔术(CLP)和LPS诱导两种不同的脓毒症模型,评价慢性SJ感染对脓毒症小鼠72 h存活率的影响.结果 实验1:SJ组血清抗炎因子IL-4[(151.35±12.24)ng/L]和IL-10[(133.22±11.09)ng/L]水平较正常组[IL-4(56.32±8.66)ng/L,IL-10(48.17±7.23)ng/L]显著升高(均P＜0.05),并可使巨噬细胞向替代活化性巨噬细胞分化,慢性SJ感染使腹腔巨噬细胞高表达IL-10 mRNA(SJ组4.46±1.82,正常组1.52±0.60),抑制TNF-α mRNA表达(SJ组1.61±0.93,正常组2.32±1.03,均P＜0.05).实验2、3:慢性SJ感染小鼠血清IL-4、IL-10于注射LPS后0 h即显著升高,随后下降,至72 h仍明显高于LPS组[IL-4(ng/L):92.2±7.6比41.5±4.5;IL-10(ng/L):92.1±7.8比35.6±4.0,均P＜0.05];TNF-α、IFN-γ均于24 h达峰值后逐渐下降,至72 h SJ-LPS组仍显著低于LPS组[TNF-α(ng/L):82.9±5.6比91.5±5.2;IFN-γ(ng/L):44.1±4.8比52.6±4.0,均P＜0.05].慢性SJ感染可明显改善CLP或LPS所致脓毒症小鼠的存活率(CLP:80%比20%,LPS:70%比30%,均P＜0.05).结论 慢性SJ感染可使脓毒症小鼠血清抗炎因子升高,存活率上升,从而起到保护作用.

Abstract：

Objective To preliminarily study the protective effect of chronic schistosoma japonica (SJ)infestation against sepsis in mice and its mechanism. Methods BALB/c male mice were used, and the experiment was divided into three parts. Experiment 1: chronic SJ infestation model was reproduced by SJ cercaria inoculation through abdominal skin for 8 weeks. Twenty mice were randomly grouped into normal group (n=10) and SJ group (n=10). The levels of interleukins (IL-4, IL-10), tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interferon-γ (IFN-γ) in serum were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Real-time polymerase chain reaction (PCR) was employed to detect the levels of IL-10 mRNA and TNF-αmRNA in abdominal macrophages. This experiment was meant to evaluate immune state in mice with chronic SJ infestation. Experiment 2: lipopolysaccharide (LPS) was intraperitoneally injected to reproduce sepsis model. Thirty mice were randomly grouped into LPS group (n=15) and SJ-LPS group (n=15). The levels of cytokines were determined by ELISA at 0, 24, 48 and 72 hours after LPS injection. This experiment was meant to detect the effect of chronic SJ infestation in mice during the septic process. Experiment 3 : two types of sepsis model were reproduced by cecal ligation and puncture (CLP) and LPS injection, respectively. The survival rate of mice with chronic SJ infestation in 72 hours in either type of sepsis was evaluated. Results Experiment 1, compared with normal group [IL-4 (56.32±8.66) ng/L, IL-10 (48.17±7.23) ng/L],chronic SJ infestation showed an increase in serum IL-4 [(151. 35 ± 12. 24) ng/L] and IL-10 [(133. 22 ±11. 09) ng/L, both P＜0. 05]. Chronic SJ infestation also resulted in an increase in IL-10 mRNA expression (SJ group 4. 46±1. 82, normal group 1. 52±0. 60) and inhibited TNF-α mRNA expression (SJ group 1. 61±0.93, normal group 2. 32±1.03) in abdominal macrophages (both P＜0. 05), indicating that macrophages could be differentiated into alternative activated macrophages. Experiments 2 and 3 showed that the levels of serum IL-4 and IL-10 were increased at 0 hour after LPS injection, and then gradually decreased in SJ-LPS group, but the levels were still higher than those in LPS group at 72 hours [IL-4 (ng/L): 92. 2±7. 6 vs.41.5±4. 5; IL-10 (ng/L): 92. 1±7. 8 vs. 35. 6±4. 0, both P＜0. 05]; the levels of TNF-α and IFN-γ were increased at 24 hours, and then decreased in SJ-LPS group, and the levels were lower than those in LPSgroup at 72 hours [TNF-α (ng/L): 82. 9±5. 6 vs. 91. 5±5. 2; IFN-γ (ng/L): 44.1±4. 8 vs. 52. 6±4. 0,both P＜0. 05]. Therefore, chronic SJ infestation could improve the survival rate of mice with sepsis induced by CLP or LPS (CLP: 80% vs. 20%, LPS: 70% vs. 30%, both P＜0.05). Conclusion Chronic SJ infestation could elevate anti-inflammatory factors in septic mice, thus ameliorating the survival rate, so it has protective effect on mice with sepsis.     

辛伐他汀对脂多糖诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞钠通道α亚基的影响

目的 通过体外给药的方式观察辛伐他汀对脂多糖(LPS)诱导的原代培养大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(ATⅡ)钠通道α亚基(α-ENaC)mRNA表达的影响.方法 ATⅡ细胞原代培养,分为空白对照组、LPS损伤组(终浓度1 mg/L)、辛伐他汀低和高剂量组(20μmol/L、30μmol/L)、溶剂对照组.分别于培养1、12、24 h用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清中肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-1 β(IL-1β)的浓度,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中α-ENaC mRNA表达.结果 LPS损伤后1、12、24 h时TNF-α、IL-1β浓度均较空白对照组显著升高.辛伐他汀低剂量组1、12、24h TNF-α(ng/L)和IL-1β(ng/L)均较LPS损伤组明显下降(TNF-α 1h:1178.80±127.43比2336.00±170.04,12 h:1003.60±59.61比2479.80±210.41,24 h:695.80±25.24比1167.60±132.72;IL-1β 1 h:285.00±42.60比429.60±27.39,12 h:238.60±24.12比822.20±12.74,24 h:213.40±17.87比637.60±22.96,均P＜0.05),高剂量组较低剂量组下降更明显(TNF-α1h:965.60±24.45比1178.80±127.43,12 h:522.80±16.89比1003.60±59.61,24 h:252.40±17.64比695.80 ±25.24;IL-1β 1 h:225.60±34.44比285.00 ±42.60,12 h:190.60 ±17.64比238.60±24.12,24 h:152.80±14.70比213.40±17.87,均P＜0.05),但仍较空白对照组明显上升.在培养1h时各组α-ENaC mRNA表达差异均无统计学意义.培养12h、24 h时,LPS损伤组α-ENaC mRNA表达(A值)明显低于空白对照组(12 h:0.211±0.021比0.496±0.027,24 h:0.253±0.030比0.482±0.030,均P＜0.05);辛伐他汀低剂量组α-ENaC mRNA表达均较LPS损伤组明显上升(12 h:0.363 ±0.030比0.211±0.021,24 h:0.309±0.024比0.253±0.030,均P＜0.05),高剂量组较低剂量组升高更明显(12h:0.413±0.034比0.363±0.030,24h:0.346±0.024比0.309±0.024,均P＜0.05),但仍较空白对照组明显下降.空白对照组与溶剂对照组各指标差异无统计学意义.结论 大剂量辛伐他汀可上调LPS诱导的大鼠ATⅡ细胞α-ENaC mRNA表达,其机制可能与调节TNF-α、IL-β的分泌有关.     

消化道肿瘤贫血患者血清铁调素及炎症介质的表达

目的 研究血清铁调素(Hepcidin)和炎症介质细菌脂多糖(LPS)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素(IFN)等细胞因子在消化道肿瘤贫血患者中的表达特点以及与消化道肿瘤贫血之间的关系.方法 应用双抗夹心生物素-亲和素-酶联免疫吸附试验(ABC-ELISA)检测31例消化道肿瘤贫血患者的Hepcidin、LPS、IL-6、TNF-α、TNF-β 、IFN-β、IFN-γ的水平,分析Hepcidin与炎症介质之间的关系,以同期30例健康体检者作为对照.结果 1.实验组Hepcidin、IL-6、TNF-β、IFN-β、LPS分别为53.8±32.4μg/L、20.3±26.1ng/L、117.4±110.7ng/L、9.8±7.2ng/L、81.6±46.1μg/L,均明显高于对照组的23.1 ±5.2μg/L、7.9±9.6ng/L、65±23.0ng/L、6.0±2.3ng/L、49.0± 19.0μg/L (P＜0.05),而IFN-γ及TNF-α与对照组比较差异无统计学意义.2.Hepcidin与IL-6、LPS之间存在正相关关系(r=0.27,p＜0.01、r=0.222,P＜0.05),与TNF-β、IFN-β呈负相关关系(r=-0.348,P＜0.001,r=0.265,P＜0.01),与IFN-γ、TNF-α之间无相关关系.结论 消化道肿瘤贫血患者高表达Hepcidin、IL-6、TNF-β、IFN-β、LPS,Hepcidin与IL-6、LPS均呈正相关关系.     

黄芪多糖体外对慢性粒细胞白血病患者治疗前后浆细胞样树突细胞功能及成熟的影响

目的 通过体外实验研究黄芪多糖(APS)对浆细胞样树突细胞(pDC)功能及成熟的影响,进一步阐明APS洞节免疫的作用.方法 从初诊未治及缓解期慢性粒细胞白血病(CML)患者外周血分选pDC,分别加入0、50、100、200 mg/L的APS共孵育,24 h后收集上清液,用ELISA法检测pDC的IFN-α、IL-6、TNF-α分泌水平,5 d后收集细胞,用流式细胞术检测DC免疫表型,光学显微镜下观察DC的形态,扫描电镜下观察DC的超微结构.结果 APS可显著提高CML缓解期患者pDC IFN-α、IL-6、TNF-α分泌水平[100 mg/L APS处理24 h与未加药组相比分别为(613±44)对(478±33)、(180±41)对(99±22)、(210±37)对(166±29)ng/L]及初诊未治患者pDC IL-6、TNF-α分泌水平[100 mg/LAPS处理24 h,与未加药组相比分别为(38±7)对(21±5)和(84±20)对(66±19)ng/L],并呈APS浓度依赖性(P＜0.05);APS可促进CML患者pDC向DC分化和成熟,并呈APS浓度依赖性(P＜0.05).结论 APS能够增强CML患者pDC的功能,并促进其向DC的分化和成熟.     

内毒素预处理对内毒素血症大鼠肝损伤的保护作用

目的 探讨内毒素预处理对内毒素血症大鼠肝损伤的保护作用.方法 采用直接注射内毒素的方法建市大鼠急性内毒素血症模型.雄性Wistar人鼠72只,随机分成三组:生理盐水对照组(N组,n=24只)、内素脂多糖(IPS)(L组,n=24只)和LPS预处理组(P组,n=24只),每组义按时间分为2 h组、4 h组、6 h组、12 h组4个亚组,每个亚组6只.P组:首次经腹腔注射LPS 0.25mg/kg;24 h后再经腹腔注射IPSO.5 mg/kg,其余两组给予等容量生理盐水.第二次腹腔注射72 h后,L组和P组经尾静脉一次注射LPS 10 mg/kg,N组给予等量生理盐水,L组和P组在注射LPS后2,4,6,12 h,N组在注射最后一次NS后2,4,6,12 h,各取6只取肝组织制成匀浆检测Toll样受体4(Toll likereceptor-4,TLR-4)、核因子-кB(nuclear factor kappa B,NF-кB)、肿瘤坏死因子-α(tulnor necrosis factor-a,TNF-α)和丙二醛(malondiahtehyde,MDA),抽血检测谷丙转氨酶(ALT),谷草转氨酶(ASF),取肝脏(肝左上叶)用10%的中性甲醛固定.采用SPSS 13.0统汁软件进行单因素方差分析.结果 内毒素血症时符时间点肝脏组织TLR-4,NF-кB和TNF-α浓度较对照组显著升高,而内毒素预处理后则有明显下降,其中内毒素血症时4 h组肝脏组织TLR-4,NF-кB和TNF-α分别为(38.76±0.67),(170.82±31.40),(293.16±49.49)和(6.263±0.351),显著高于对照组(P＜0.05),而内毒素预处理后上述指标降至(22.32±1.35),(135.55±26.44)和(234.23±44.96),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 内毒素预处理可减轻内毒素血症时的肝损伤,其机理可能与肝组织TLR-4,NF-кB和TNF-α的表达减少有关.     

血必净干预对水下爆炸致兔急性肺损伤血清和支气管肺泡灌洗液NE,TNF-α表达的影响

目的探讨血必净干预对水下爆炸致兔急性肺损伤肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)在血清和支气管肺泡灌洗液(broncho alveoloar lavage fluid,BALF)中表达的影响。方法将20只实验兔随机分为爆炸损伤组和血必净治疗组.以水下爆炸装置对实验免造成急性肺损伤,爆炸后24 h测定血清和BALF中的TNF-α和NE含量。结果血必净治疗组血清(353.30±166.86 ng/L)TNF-α浓度与爆炸损伤组(552.30±169.64 ng/L)相比显著下降(t=2.645,P=0.016)。血必净治疗组NE在血清中的表达(63.40±36.09 ng/ml)显著低于爆炸损伤组(97.60±36.20 ng/ml;t=2.116,P=0.049);在BALF的表达(102.10±9.50 ng/ml)也低于爆炸损伤组(136.70±13.60 ng/ml;t=6.593,P=0.000)。结论血必净干预治疗能够显著降低水下爆炸致兔急性肺损伤血清TNF-α水平以及NE在血清和BALF中的浓度。     

乌司他丁通过p38丝裂原活化蛋白激酶通路治疗大鼠脓毒症急性肝损伤的相关性研究

目的探讨乌司他丁对脂多糖(LPS)诱导的大鼠脓毒症急性肝损伤的治疗作用及相关机制,并与p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路特异性阻断剂SB203580的疗效进行比较。方法通过尾静脉注射5 mg/kg的LPS制造LPS诱导的大鼠脓毒症急性肝损伤模型。将清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠32只分为4组:空白组(尾静脉注射1 m L等渗Na Cl溶液),LPS组(尾静脉注射1 m L的LPS),LPS+乌司他丁(UTI)组(建模后立即腹腔注射1 m L乌司他丁),LPS+p38MAPK通道阻断剂(SB)组(建模后立即腹腔注射1 m L SB203580),每组8只。建模后24 h处死大鼠,取下腔静脉血测定大鼠血清中谷氨酸-丙酮酸转氨酶(ALT)、胆红素(BIL)和碱性磷酸酶(AKP)的浓度,利用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测大鼠肝组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,Western-blotting法测定大鼠肝组织磷酸化p38蛋白水平表达,以及通过肝组织病理切片和电镜下观察肝细胞微结构的变化。结果建模后24 h,LPS组有2只大鼠死亡。四组大鼠血清AKP水平无显著性差异(F=1.153,P=0.351);与空白组比较,LPS组大鼠血清ALT[(10.7±1.8)U/L vs.(46.3±5.0)U/L]、BIL[(0.63±0.12)μmol/L vs.(1.55±0.16)μmol/L]、肝组织TNF-α[(4 621±793)ng/L vs.(7 222±773)ng/L]、磷酸化p38蛋白水平[(12 073±172)ng/L vs.(15 515±630)ng/L]均显著升高(P均0.05);病理切片提示LPS组肝细胞水样变性、炎症细胞浸润、肝细胞再生;电镜结果也提示肝细胞核固缩,线粒体嵴肿胀、断裂或者消失,内质网结构不清。而LPS+UTI组和LPS+SB组肝组织TNF-α、磷酸化p38蛋白表达均与空白组无显著差异(P均0.05);病理切片提示两组肝细胞水样变性、炎症细胞浸润、肝细胞再生较LPS组轻,但较空白组仍严重;电镜结果显示肝细胞核、线粒体及内质网结构变化较LPS组减轻。与空白组相比,LPS+SB组血清ALT无显著差异(P0.05),而LPS+UTI组血清ALT明显升高[(10.7±1.8)U/L vs.(29.5±2.5)U/L,P0.05],提示SB203580对血清ALT作用更明显;而与空白组比较,LPS+UTI组血清BIL水平无显著差异(P0.05),而LPS+SB组血清BIL明显升高[(0.63±0.12)μmol/L vs.(1.52±0.20)μmol/L,P0.05],提示乌司他丁对血清BIL作用更明显。结论乌司他丁可减轻LPS引起的大鼠脓毒症急性肝损伤,是通过p38MAPK通路来发挥炎症抑制作用的。与p38MAPK通路特异性阻断剂比较,两者在减轻TNF-α、磷酸化p38蛋白等作用上相似,但是对血清学指标的影响有一定差别。     

氨溴索对急性肺损伤的保护作用

目的 通过建立急性肺损伤大鼠模型和体外肺泡巨噬细胞培养体系,观察急性肺损伤中,肺泡巨噬细胞在氨溴索干预前后细胞因子表达的情况,探讨氨溴索可能的肺损伤保护机制.方法 一、体内实验:大鼠24只,随机分成3组,每组8只:(1)正常对照组;(2)急性肺损伤组:采用腹腔注射酵母悬液方法复制大鼠急性肺损伤模型;(3)氨溴索治疗组:建立ALI大鼠模型后用氨溴索干预.观察指标主要有:肺部病理学改变、测量大鼠肺系数、血氧分压,肺泡巨噬细胞TNF-α、IL-10、IL-24 mRNA的表达则采用通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测.二、体外实验:收集肺泡巨噬细胞后分3组:(1)正常对照组:肺泡巨噬细胞中加无菌生理盐水;(2)LPS组:予LPS 10 mg/L刺激肺泡巨噬细胞;(3)LPS+氨溴索组:予LPS10 mg/L和氨溴索180 μmol/L刺激肺泡巨噬细胞.分别于刺激前(0 h),刺激后(6、12、24 h)留取细胞.通过RT-PCR技术检测肺泡巨噬细胞TNF-α、IL-10、IL-24 mRNA的表达变化.结果 氨溴索治疗组在病理改变,肺系数,动脉血氧分压等各项指标均优于急性肺损伤组,氨溴索干预治疗组,TNF-α、IL-10、IL-24 mRNA表达水平均明显下降,与急性肺损伤组比较差异有统计学意义(P＜0.05),但仍高于正常对照组.体外实验也得出了相同的结论.结论 氨溴索可抑制急性肺损伤或LPS刺激的肺泡巨噬细胞TNF=α、IL-10、IL-24细胞因子mRNA的表达水平.