赖氨酰氧化酶表达干扰对乳腺癌裸鼠移植瘤生长影响及机制研究

目的:探讨抑制乳腺癌细胞MD-MB-231中赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)的表达对乳腺癌裸鼠移植瘤生长的影响及可能机制。方法:设计合成特异性LOX基因慢病毒干扰载体(LOX-RNAi-LV)转染乳腺癌细胞MDA-MB-231,采用荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测LOX mRNA和蛋白的表达;建立乳腺癌裸鼠原位移植模型,观察移植瘤的生长情况。采用免疫组化方法检测移植瘤组织中LOX蛋白及肿瘤增殖、转移相关蛋白Ki-67、MMP-2、MMP-9和HIF-1α的表达。结果:转染LOX-RNAi-LV的人乳腺癌细胞MDA-MB-231中LOX mRNA和蛋白的相对表达量分别为0.102±0.083和0.156±0.004,与空白对照组(0.945±0.158和0.916±0.007)相比,表达率均明显下调,抑制率分别为89.2%和83.0%。裸鼠原位接种癌细胞后6d均有肿瘤生成,40d后接种转染LOX-RNAi-LV的MDA-MB-231细胞的裸鼠移植瘤体积为(108.89±26.61)mm3,质量为(0.117±0.021)g;均明显低于空白对照组(400.15±79.81)mm3,(0.433±0.068)g,以及阴性对照组(380.15±65.81)mm3,(0.404±0.053)g,差异有统计学意义,P值均为0.000。移植瘤组织中LOX、Ki-67、MMP-2、MMP-9和HIF-1α蛋白相对表达水平分别为0.198±0.036、0.347±0.054、0.379±0.048、0.335±0.067和0.307±0.073,较空白对照组和阴性对照组明显降低,P值均<0.01。结论:干扰MDA-MB-231中LOX的表达,可抑制乳腺癌裸鼠移植瘤的生长侵袭,LOX可能通过调节Ki-67、MMP-2、MMP-9和HIF-1α蛋白的表达,在乳腺癌的侵袭转移中发挥作用。     

PAMAM-NK4纳米复合物对乳腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的:探讨新型纳米材料聚酰胺-胺型树枝状高聚合物(polyamidoamine dendrimer,PAMAM)介导NK4基因对乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞生长的抑制作用及对MDA-MB-231细胞移植瘤裸鼠模型的治疗作用.方法:制备PAMAM-NK4纳米复合物颗粒,纳米复合物和空载体PAMAM分别转染MDA-MB-231和MCF-7细胞作为实验组和对照组.MTT实验、West-ern blotting和流式细胞术分别检测转染PAMAM-NK4对细胞增殖、NK4蛋白表达和细胞凋亡的影响.40只雌性裸鼠经皮下注射建立MDA-MB-231细胞移植瘤裸鼠模型,随机分成4组,每组10只裸鼠:空白组肿瘤接种部位旁皮下注射0.2 ml 0.9％NaCl溶液、空载体组注射0.2ml含100μg PAMAM-LacZ质粒的溶液、给药组注射0.2 ml含100 μg PAMAM-NK4质粒的溶液、阳性对照组腹腔注射0.2 ml多柔比星(100 μg)溶液.连续注射7d,第30天处死裸鼠,完整摘除肿瘤,测量肿瘤体积和质量.Western blotting检测各组移植瘤组织NK4蛋白表达.结果:PAMAM-NK4纳米粒转染MDA-MB-231、MCF-7细胞后能够稳定表达NK4蛋白、抑制细胞增殖和增加细胞凋亡率.成功建立MDA-MB-231细胞移植瘤裸鼠模型,给药组和阳性对照组肿瘤体积及质量显著低于空白组(P＜0.05),且安全性良好;给药组NK4蛋白表达显著高于空白组(P＜0.05).结论:PAMAM-NK4纳米粒对乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞生长具有抑制作用,并对人乳腺癌细胞移植瘤裸鼠模型具有治疗作用.     

天花粉蛋白抑制乳腺癌生长的实验研究

目的 探讨天花粉蛋白(TCS)对MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞及乳腺癌裸鼠移植瘤的影响.方法 四唑盐比色法(MTT)检测TCS处理前后细胞的增殖情况;流式细胞术(FCM)检测TCS处理前后细胞周期变化和凋亡率;将MDA-MB-231细胞接种于裸鼠,成瘤后分为对照组、TCS组和盐水组.检测各组裸鼠移植瘤体积、瘤重和肝、肾功能、血常规变化.结果 随着TCS作用时间延长、浓度增大、MDA-MB-231和MCF-7细胞生长受到明显抑制;TCS处理后细胞阻滞于G0/G1期,并可检测到凋亡峰;TCS组裸鼠移植瘤体积和瘤重较对照组明显缩小,TCS对荷瘤裸鼠肾功能、血常规无明显影响,可引起谷丙转氨酶轻度升高.结论 TCS可抑制MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞增殖和乳腺癌裸鼠移植瘤生长.     

转染REGγ基因对乳腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响

目的:研究转染蛋白酶体激活因子REGγ基因的乳腺癌MDA-MB-231细胞在裸鼠体内的成瘤作用及其机制.方法:以脂质体转染法将构建的重组质粒pcDNA3.1-REGγ导入MDA-MB-231细胞,以G418(600 mg/L)筛选获得稳定高表达该基因的细胞株(实验组).以转染空载体及未施加处理因素的细胞作为对照组.将此3组细胞接种于裸鼠皮下,观察移植瘤的生长情况并计算抑瘤率.RT-PCR检测REGγ基因在移植瘤中的表达,FCM检测移植瘤的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)中CD16的表达以及肿瘤细胞周期和细胞凋亡,免疫组织化学法检测移植瘤中p21的表达.结果:与对照组相比,实验组的移植瘤生长速度较快、体积较大,瘤体质量明显增加(P＜0.05);REGγ基因在移植瘤中的表达增加(P＜0.01);FCM检测提示CD16阳性率明显降低(P＜0.05);G0/G1和G2/M期细胞减少,S期细胞明显增多,肿瘤细胞的凋亡率明显降低(P＜0.05);p21的表达明显降低(P＜0.05).结论:REGγ基因在体内具有促进乳腺癌发生、发展的作用,其机制可能与加速细胞周期、抑制细胞凋亡、抑制自然杀伤细胞活化以及对p21的特异性降解有关.     

骨形态发生蛋白9对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein9,BMP9)在体内、外对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响。方法:将pAdtrack-CMV/BMP9和pAdtrack-CMV/GFP腺病毒感染MDA-MB-231细胞,RT-PCR法检测MDA-MB-231/GFP和MDA-MB-231/BMP9细胞中BMP9mRNA的表达,MTT法、平板集落形成实验和FCM法检测细胞增殖和凋亡的情况。建立裸鼠MDA-MB-231、MDA-MB-231/GFP和MDA-MB-231/BMP9移植瘤模型,测量移植瘤体积,TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡情况。结果:MDA-MB-231和MDA-MB-231/GFP细胞中无BMP9mRNA的表达,MDA-MB-231/BMP9细胞中有明显BMP9mRNA表达;MDA-MB-231/BMP9细胞增殖抑制率高于MDA-MB-231/GFP细胞(P<0.05),而细胞集落形成率明显低于MDA-MB-231/GFP和MDA-MB-231组(P<0.05),细胞凋亡率则明显高于MDA-MB-231/GFP和MDA-MB-231组(P<0.05)。MDA-MB-231/BMP9组的裸鼠移植瘤体积明显小于MDA-MB-231/GFP和MDA-MB-231组(P<0.001),而移植瘤细胞中的凋亡指数则明显高于MDA-MB-231/GFP和MDA-MB-231组(P<0.001)。结论:BMP9可在体内、外抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖并促进其凋亡。     

miR-125a增强多西他赛对乳腺癌生长的抑制作用

背景与目的:研究表明miR-125a通过下调Her-2或者Her-3的表达抑制乳腺癌细胞生长,可能是指导乳腺癌治疗的靶点.本研究旨在观察miR-125a是否具有增强多西他赛对乳腺癌细胞株和裸鼠荷瘤模型的生长抑制作用.方法:转染miR-125a联合不同浓度多西他赛处理MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞株和MDA-MB-231乳腺癌裸鼠模型,观察细胞株和裸鼠接种肿瘤的生长情况.结果:miR-125a与多西他赛可协同抑制MDA-MB-231及MCF-7乳腺癌细胞株、MDA-MB-231乳腺癌裸鼠模型肿瘤的增殖,单纯转染miR-125a也可抑制MDA-MB-231及MCF-7乳腺癌细胞株的增殖.结论:miR-125a与多西他赛有协同抗乳腺癌作用,可成为乳腺癌靶向治疗的潜在靶点.     

外源性TGFBI抑制乳腺癌细胞生长的体内外实验

目的 研究转化生长因子β诱导基因 (transforming growth factor-β induced gene, TGFBI) 是否能抑制人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)的体内外增生。方法 将外源性TGFBI稳定转染到人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)中,测定细胞增殖率、细胞周期、软琼脂克隆形成率及P21、P53蛋白表达变化,检测乳腺癌细胞的致瘤性。结果 外源性TGFBI在人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)中能够稳定地高表达;外源性TGFBI可以明显地抑制乳腺癌细胞因血清生长因子刺激的增生;与转染空质粒的对照组细胞V23101比较,外源性TGFBI相对软琼脂克隆形成数减少了90.89%; TGFBI可以使人乳腺癌细胞阻滞在G1期,延缓其进入S期的时间。外源性TGFBI可以延长裸鼠肿瘤发生的潜伏期,并降低肿瘤发生率。结论 TGFBI能够抑制人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)的体内外增生。     

LKB1基因与Hedgehog信号通路对乳腺癌MDA-MB-231细胞抑制机制的探讨

目的:探讨乳腺癌细胞中LKB1基因与Hedgehog信号转导途径的关系.方法:以乳腺癌MDA-MB-231细胞为研究对象,LKB1基因转染或干扰处理后,反转录-聚合酶链反应和蛋白质印迹法分别检测Hedgehog信号通路中Shh、Sufu、Ptch、Smo、Gli 1、Hip mRNA和蛋白表达的变化.建立LKBI 基因表达抑制的细胞移植瘤模型,验证体外实验结果并进行对比分析.结果:Hedgehog 信号通路激动因子Ptch的mRNA和蛋白的表达在各组细胞中差异无统计学意义.而激动因子Shh、Gli1和Smo的mRNA和蛋白的表达在MDA-MB-231正常细胞及其空质粒细胞、siRNA无关序列细胞中差异无统计学意义;在LKB1转染细胞中降低(F=29.56,P＜0.05),在LKBI转染siRNA细胞中升高(F=32.15,P＜0.05).而抑制因子Sufu、Hip的mRNA和蛋白的表达正好相反,在LKB1转染细胞中升高,在LKB1转染siRNA细胞中降低,F=30.25,P＜0.05.移植瘤检测Shh、Sufu、Smo、Gli 1、Hip蛋白表达与体外实验相似,F=8.40,P＜0.01.而且发现LKB1转染siRNA细胞组裸鼠肿瘤平均体积显著大于对照组(F=4.68,P＜0.05),生存时间显著短于对照组,F=3.50,P＜0.01.LKB1基因与Hedgehog信号通路相关因子表达呈负相关,r=0.232,P＜0.05.结论:LKB1基因与Hedgehog信号通路相关因子表达在乳腺癌细胞中呈负相关,LKB1基因可能通过Hedgehog信号通路抑制乳腺癌细胞的发生,两者之间的相互作用对乳腺癌的诊治可能有重要影响.     

LOX在乳腺癌中的表达及与MMP-2、MMP-9相关性的实验研究

目的 探讨赖氨酰氧化酶(LOX)在不同侵袭、转移潜能的乳腺癌细胞株的表达及LOX与MMP-2、MMP-9的关系.方法 以RT-PCR检测LOX mRNA在乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7的表达水平.40只裸鼠随机分为2组,每组裸鼠的乳腺脂肪垫内分别接种上述不同的细胞,建立人乳腺癌原位移植瘤模型.6周后测定肿瘤体积,SP免疫组织化学法检测移植瘤中LOX、MMP-2、MMP-9的表达情况,并对数据进行统计学处理.结果 高侵袭、转移潜能的乳腺癌细胞后第6天均有肿瘤形成,至6周时MDA-MB-231组肿瘤体积为(758.84±241.08)mm3,MCF-7组为(210.36±101.06)mm3,差异有统计学意义(P＜0.01).LOX与MMP-2、MMP-9的表达呈正相关(P＜0.01).结论 乳腺癌细胞高侵袭、转移的潜能可能与LOX、MMP-2、MMP-9的高表达及其相互之间协同作用相关.     

HAP1基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影响

[目的]研究HAP1基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影响及作用机制.[方法]取对数生长期已构建好的MDA-MB-23 1/HAP1和MDA-MB-231/Pb稳转细胞株(5×106),接种于5周龄BALB/C雄性裸鼠左腹股沟部皮下,建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型,21d裸鼠皮下肿瘤长径到达0.6～0.9cm时,分为4组(n=5):MDA-MB-231/Pb组,MDA-MB-231/HAP1组,MDA-MB-231/Pb+放射组和MDA-MB-231/HAP1+放射组.放射组在第21d给予5Gy X线照射一次后继续饲养3周左右.期间每隔4d测量1次肿瘤的长径及短径,计算肿瘤体积.第6周时处死各组裸鼠统计瘤重.免疫组织化学方法分析Cleaved-caspase-3和Cleaved-caspase-9表达,TUNEL分析细胞凋亡.[结果]MDA-MB-231/HAP1+放射组裸鼠肿瘤生长明显迟缓,平均体积小于其他3组(P均＜0.01),MDA-MB-231/HAP1+放射组平均瘤重明显小于其他3组(P均＜0.01).TUNEL凋亡实验结果表明,MDA-MB-231/Pb组细胞平均凋亡率为3.27％ ±1.51％,MDA-MB-231/HAP1组为36.77％ ±3.78％,MDA-MB-231/Pb+放射组为46.27％±2.98％,MDA-MB-231/HAP1+放射组为83.07％±0.21％,MDA-MB-231/HAP1+放射组凋亡率明显高于其他3组(P＜0.05).免疫组织化学染色评分结果显示,MDA-MB-231/Pb组,MDA-MB-23 1/HAP1组,MDA-MB-231/Pb+放射组,MDA-MB-231/HAP1+放射组中凋亡蛋白Cleaved-caspase-3平均积分分别为1.67±0.47,6.00±1.63,7.00±1.41和14.67±1.89,凋亡蛋白Cleaved-caspase-9平均积分分别为2.00±0.82,4.67±0.94,5.33±0.94和11.00±1.41;Cleavedcaspase 3和cleaved-caspase 9在MDA-MB-231/HAP11+放射组中的水平明显高于其他3组(P＜0.05).[结论] HAP1基因可能通过调控肿瘤细胞的凋亡来增强人乳腺癌细胞对放射治疗的敏感性.