利用流式细胞仪检测人外周血NK细胞毒性方法的建立

目的利用流式细胞仪（FAcs）技术检测人外周血NK细胞的毒性。方法首先将pEGFP-N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562，经过G418筛选后进一步单克隆化，得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的K562细胞。取对数期的K562-EGFP细胞与人外周血单个核细胞分别按5：1、10：1、20：1、40：1的比例混合，分别孵育0．5、1、2、4h后用碘化丙啶（PI）标记，用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数，最后计算NK细胞的杀伤效率。结果0．5、1、2、4h均能得到明显的杀伤效果，而且以2h的杀伤率最高。此时杀伤率与传统乳酸脱氢酶法（LDH）具有显著相关性（7=0．997，P=0．003），而且显示出更强的敏感性。结论利用流式细胞仪检测NK细胞毒活性的方法可作为传统^51Cr释放法、LDH法的一个补充，而且具有经济、快速和敏感的特点。     

流式细胞术检测NK细胞活性在获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断中的应用

本研究目的旨在建立一种准确、稳定的NK细胞杀伤活性检测方法,应用于获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断。21例疑似患者及20例健康对照者纳入本研究。根据HLH-2004标准将疑似患者分为确诊组和排除组,将pEGFP—N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562,经过G418筛选后进一步单克隆,得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的EGFP—K562细胞,将EGFP—K562细胞与人外周血单个核细胞按10：1的比例混合孵育2小时后,用碘化丙啶（PI）标记,用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数,最后计算NK细胞的杀伤效率;同时采用LDH释放法测定外周血NK细胞对单纯K562细胞的杀伤活性,并进行比较。结果表明：获得了稳定表达绿色荧光蛋白的EGFP—K562细胞;流式细胞仪检测表明健康人NK细胞杀伤率与病人组之间存在明显差异,流式细胞仪技术检测NK细胞杀伤活性与传统LDH释放法检测NK细胞杀伤活性具有显著相关性。结论：EGFP—K562细胞株作为靶细胞用于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性,无需预先染色和标记靶细胞,操作简便、省时、稳定、重复性高,可应广泛应用于获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断。     

表达增强型绿色荧光蛋白K562细胞株的建立及其检测自然杀伤细胞活性的效果评价

目的建立一种准确、稳定的自然杀伤细胞(NK)活性检测方法。方法通过电穿孔法将含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒转入K562细胞,经G418筛选后进行克隆,获得EGFP阳性表达细胞株;采用流式细胞仪和乳酸脱氢酶法检测10名健康人外周血NK细胞活性。结果通过基因转染的方法得到1株稳定表达EGFP的K562细胞,转染EGFP对细胞生长无影响,10名健康人外周血NK细胞对转染EGFP的细胞及未转染细胞的杀伤活性无差异(P>0.05);表达EGFP的K562细胞在效靶比为40∶1时,用流式细胞仪检测培养2和4h时的NK细胞杀伤率分别为(21.5±1.3)%和(23.7±1.5)%,二者无差异(P>0.05);而用乳酸脱氢酶法测定培养4h的NK细胞对K562和EGFP-K562的杀伤率[分别为(23.6±2.3)%和(23.7±2.3)%]均高于2h的杀伤率[(18.0±1.1)%和(18.2±1.3)%,P<0.05]。结论成功建立了表达EGFP的K562细胞株,将该细胞株作为靶细胞用于流式细胞术检测NK细胞活性时,无需预先染色和标记靶细胞,且操作简便、省时、稳定、可靠。     

同种异体NK细胞对AML细胞体外杀伤活性及初步机制

目的探讨同种异体自然杀伤细胞(NK细胞)对急性髓系白血病(AML)细胞株KG1a的杀伤活性及其分子机制。方法以NK敏感的K562细胞株为对照,免疫磁珠法分离5例健康志愿者NK细胞,乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定在不同效靶比时NK细胞对KG1a细胞的杀伤活性,并用流式细胞仪检测KG1a细胞表面人类白细胞抗原I(HLA-I)类分子和NKG2D的配体主要组织相容性复合体(MIC)A/B、ULBP1-3的表达情况。结果效靶比1∶1、5∶1、10∶1、20∶1时NK细胞杀伤K562和KG1a细胞的活性不同,NK细胞对KG1a细胞的杀伤活性较K562细胞明显减低(P<0.01);K562细胞低表达HLA-I类分子,高表达NKG2D配体MIC可溶性Ⅰ类分子相关蛋白A(MICA)、MICA有亲源性的蛋白(MICB)、ULBP1、ULBP2、ULBP3,而KG1a细胞高表达HLA-I类分子,低表达NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3。结论同种异体NK细胞对AML细胞株KG1a的杀伤率低于K562细胞;其杀伤率不同的分子基础与其分子表面配体表达差异和HLA-I分子表达率不同有关。     

K562和K562/AO2细胞HLA I类分子与MICA/B的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响

本研究探讨K562亲本细胞株及多药耐药细胞株K562/AO2细胞表面HLAI类分子和MHCI类链相关分子(MICA/B)的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响。用流式细胞仪检测K562和K562/AO2细胞株HLAI类分子和MICA/B的表达情况;LDH释放法测定3例健康人NK细胞在不同效靶比时对K562和K562/AO2细胞的杀伤活性;效靶比10∶1时,用抗HLAI类分子单克隆抗体(W6/32)和抗MICA/B单克隆抗体(BAMO-1)分别封闭MHCⅠ类分子和MICA/B,观察NK细胞杀伤K562及K562/AO2细胞活性的变化。结果表明:K562和K562/AO2细胞均不表达HLAI类分子,K562细胞的MICA/B表达较K562/AO2明显增高(P<0.01)。效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性分别为(29.32±0.12)%、(45.33±0.78)%、(58.37±0.87)%、(72.37±0.96)和(12.47±0.91)%、(24.36±1.11)%、(33.29±1.03)%、(53.87±1.27)%,各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较K562/AO2细胞明显增强(P=0.000);效靶比10∶1时W6/32不抑制NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性,BAMO-1能明显抑制NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性。结论:MICA/B在K562和K562/AO2细胞表达的差异与NK细胞的杀伤活性有关;NK细胞对K562/AO2细胞杀伤活性降低与HLAI类分子无关;MICA/B在多药耐药肿瘤细胞的低表达导致耐药肿瘤细胞对NK细胞杀伤敏感性下降。     

双色法和三色法检测NK细胞杀伤功能的实用性比较

目的 比较双色法和三色法检测自然杀伤细胞（NK cell）的体外杀伤功能。方法 选取20例自2019年至2021年于中山大学附属第三医院献血者外周血,体外诱导扩增NK细胞（效应细胞）,在培养第14天按10∶1、20∶1效靶比分别与K562细胞（靶细胞）混合共培养,且在1 h、2 h、3 h、4 h共4个时间组取样,分别采用CFSE/PI双色法和CFSE/Annexin-V/7-AAD三色法进行流式染色,检测K562细胞的凋亡。结果 在不同效靶比实验组,两种染色方法都能检测出NK细胞在效靶比20∶1杀伤功能显著高于效靶比10∶1,差异有统计学意义（P<0.05）,在4个时间点实验组中,效靶细胞共培养4 h时NK细胞杀伤功能最强。其中,三色法检测出细胞杀伤功能显著高于双色法,差异有统计学意义（P<0.05）。结论三色荧光染色法比双色法能更灵敏更特异地检测NK细胞杀伤功能,结果更为可靠。     

姜黄素提高白血病KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤的敏感性及其分子机制探讨

目的：研究姜黄素作用前后白血病KG1a细胞对同种异体自然杀伤（NK）细胞杀伤的敏感性变化,并初步探讨其分子机制。方法：以对同种异体NK细胞杀伤高度敏感的白血病K562细胞为对照,乳酸脱氢酶释放法检测KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤的敏感性,流式细胞仪检测细胞表面NKG2D配体（MICA/B、ULBP1、ULBP2、ULBP3）和HLA-Ⅰ类分子蛋白表达,逆转录PCR法检测细胞表面NKG2D配体和HLA-Ⅰ基因mRNA的表达水平。CCK-8法检测姜黄素对KG1a细胞半数抑制量（IC50）,以此含量作用KG1a细胞,再次乳酸脱氢酶释放法检测姜黄素作用后的KG1a对同种异体NK细胞杀伤的敏感性,流式细胞仪检测姜黄素作用后的KG1a细胞表面NKG2D配体和HLA-Ⅰ类分子蛋白表达水平。结果：与K562细胞比较,KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤呈低度敏感,KG1a细胞表面NKG2D各配体蛋白表达阳性率均明显低于K562细胞（P〈0.01）,HLA-Ⅰ蛋白表达阳性率则明显高于K562细胞（P〈0.01）;在mRNA水平两种白血病细胞表面均有NKG2D配体和HLA-Ⅰ基因表达。当效靶比为5∶1、10∶1、20∶1时,姜黄素作用后NK细胞对KG1a细胞杀伤率明显高于作用前（P〈0.01）;作用后KG1a细胞各NKG2D配体表达率均明显升高（P〈0.05或0.01）,HLA-Ⅰ类分子无明显变化（P〉0.05）。结论：姜黄素能提高KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤的敏感性,其机制可能与姜黄素提高KG1a细胞表面NKG2D配体的表达有关。     

K562和K562/AO2细胞HLA Ⅰ类分子与MICA/B的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响

本研究探讨K562亲本细胞株及多药耐药细胞株K562/AO2细胞表面HLA Ⅰ类分子和MHC Ⅰ类链相关分子(MICA/B)的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响.用流式细胞仪检测K562和K562/AO2细胞株HLAⅠ类分子和MICA/B的表达情况;LDH释放法测定3例健康人NK细胞在不同效靶比时对K562和K562/AO2细胞的杀伤活性;效靶比101时,用抗HLA Ⅰ类分子单克隆抗体(W6/32)和抗MICA/B单克隆抗体(BAMO-1)分别封闭MHC Ⅰ类分子和MICA/B,观察NK细胞杀伤K562及K562/AO2细胞活性的变化.结果表明K562和K562/AO2细胞均不表达HLA Ⅰ类分子,K562细胞的MICA/B表达较K562/AO2显增高(P＜0.01).效靶比51、101、201、301时NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性分别为(29.32±0.12)%、(45.33±0.78)%、(58.37±0.87)%、(72.37±0.96)和(12.47±0.91)%、(24.36±1.11)%、(33.29±1.03)%、(53.87±1.27)%,各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较K562/AO2细胞明显增强(P=0.000);效靶比101时W6/32不抑制NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性,BAMO-1能明显抑制NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性.结论MICA/B在K562和K562/AO2细胞表达的差异与NK细胞的杀伤活性有关;NK细胞对K562/AO2细胞杀伤活性降低与HLA Ⅰ类分子无关;MICA/B在多药耐药肿瘤细胞的低表达导致耐药肿瘤细胞对NK细胞杀伤敏感性下降.     

基于CD_(107a)标记流式细胞仪检测NK细胞毒性方法的建立

目的建立基于CD107a标记、利用流式细胞仪检测NK细胞毒性的方法。方法首先将外周血单个核细胞(PBM-Cs)与K562细胞以3∶1比例混合,2 h后加入莫能菌素,1.5 h后加入CD107a和CD56标记抗体,流式细胞仪分析CD107a阳性细胞的频率。其次观察CD107a抗体孵育时间、不同效靶比例对CD107a阳性细胞检测的影响。最后观察该方法与传统LDH释放法检测NK细胞毒活性的一致性。结果 NK细胞活化后可在其表面检测到高水平表达的CD107a分子,效靶细胞孵育结束后加入CD107a抗体可降低检测背景,低效靶比例同样具有检测敏感性。该方法与LDH释放法的检测结果一致。结论利用CD107a抗体标记检测NK细胞毒活性的方法具有快速、敏感、所需效应细胞少的优点。     

IL-2和IL-15刺激脐血NK细胞对K562/Jurkat细胞的杀伤活性研究

本研究旨在探讨脐血(cord blood,CB)NK细胞的杀伤功能及细胞因子IL-2和IL-15对NK细胞杀伤K562/Jurkat细胞活性的影响。采用autoMACS及CD3阴选后CD56阳选两步免疫磁珠分选法从脐血单个核细胞纯化NK细胞,分选后NK细胞用流式细胞仪测定纯度,通过IL-2及IL-2和IL-15两种细胞因子组合培养3天,用LDH释放法检测培养前后脐血NK细胞对白血病细胞株K562和Jurkat的细胞毒活性(效靶比10∶1),并记录不同细胞因子培养体系条件下NK细胞的生长状况。结果表明,CB-MNC中CD3-CD56+细胞含量为(14.88±9.2)%,分选后CD3-CD56+细胞含量为(92.39±0.8)%;培养3天后,IL-2组NK细胞形成集落数为148.60±13.0,IL-2复合IL-15组NK细胞形成集落数为831.80±23.0,两者比较,有显著性差异;以K562为靶细胞时,新鲜纯化CB-NK的杀伤活性为(27.76±8.8)%,IL-2组杀伤活性为(61.9±9.1)%,IL-2复合IL-15组杀伤活性为(87.62±3.7)%,差别有统计学意义;以Jurkat为靶细胞时,新鲜纯化CB-NK细胞的杀伤活性为(29.32±2.5)%,IL-2组杀伤活性为(69.43±4.4)%,IL-2复合IL-15组杀伤活性为(92.95±3.2)%,差别有统计学意义。结论:脐血新鲜纯化NK细胞对K562、Jurkat细胞有一定的杀伤作用,但自发细胞毒活性较低,IL-2/IL-15刺激后杀伤活性显著提高,IL-15复合IL-2对促进脐血NK细胞的生长和提高其细胞毒活性明显优于单用IL-2。     

Flow cytometric measurement of NK cell cytotoxicity.

A simple and fast method to measure the natural killer (NK) cell cytotoxicity has been established. In our novel assay, following the incubation of K562 target and effector cells, the cells were stained with FITC-conjugated anti-transferrin receptor (CD71) mAb. The K562 targets alone were labeled with anti-CD71 mAb, since CD71 is highly expressed on K562 cells but not on mononuclear cells. The fluorescence intensity of CD71 on K562 cells were analyzed using flow cytometry, and the cytotoxicity was evaluated. In our assay, designated as a "CD71 assay", no spontaneous release of anti-CD71 mAb was observed from labeled K562 cells and living K562 cells were able to be divided from dead K562 cells. The data obtained by this assay was well correlated with that by the standard 51Cr-release assay as well as the C-FDA assay. In addition, the CD71 assay is a safe and simple analytic procedure since no isotope is required.     

肝细胞癌NKG2D表达及对NK细胞细胞毒的影响

【目的】分析肝细胞癌NKG2D表达及对NK细胞细胞毒的影响。【方法】应用免疫荧光技术和流式细胞术 (FCM )分选 2 5例肝细胞癌 (HCC)、10例健康对照的外周血NK细胞 ,定量分析NKG2D蛋白表达。用MTT比色法检测抗NKG2DpAb加入前后NK细胞的细胞毒效应。【结果】HCC患者NK细胞的NKG2D蛋白表达量均低于正常对照 ,差异有显著性 (P <0 .0 1)。抗NKG2DpAb能显著抑制NK细胞对K5 6 2、HepG2细胞的细胞毒效应 ,使NK细胞对两种靶细胞的细胞毒效应分别下降了 6 .7和 4 .1倍。【结论】NK细胞NKG2D表达异常与肝细胞癌的发生发展可能相关。     

In vitro enhancement of peripheral blood mononuclear cell natural killer activity following short term incubation with fetal calf serum

This study demonstrates that short term incubation of blood mononuclear cells (MC) in heterologous sera enhances their natural killer (NK) but not their antibody dependent killer (K) activity, and confirms that NK stimulation is not related to blastogenesis. MC were obtained from healthy donors and incubated with RPMI 1640 supplemented with various serum sources. NK and K activity of incubated vs. fresh MC against SK-N-SH, Chang or Raji cell line targets were compared in a 4-hr 51Cr release assay. A significant (p less 0.01) increase in NK cytotoxicity was detected when MC were incubated with fetal calf serum (FCS) or human AB serum (ABS) at 37 degrees C. When a more sensitive NK target cell (K-562) was used only the cells incubated in FCS demonstrated increased NK cytotoxicity. Augmentation of NK cell activity by FCS was not related to blastogenesis, mitosis, natural antibodies against lymphocytes or target cells, immunoglobulin complexes or alterations in MC OKT4 and OKT8 subpopulations. In contrast to NK activity, K cytotoxicity was not increased after incubation at 37 degrees C in FCS or ABS, and it was depressed in IPT (p less than 0.05). Thus FCS is capable of stimulating NK cell activity against human tumor cell lines in less in less than 24 hr.     

K562细胞RNA负载人树突状细胞后体外诱导特异性CTL的研究

目的探讨人的树突状细胞(dendriticcell,DC)体外经K562细胞株总RNA转染后,能否诱导出p210蛋白表达,并诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。方法自健康人浓缩白细胞制品(白膜)分离有粘附特性的单核细胞(PBMC),经GMCSF、IL4培养5d后,获得未成熟的DC(imatureDC,imDC);体外以脂质体DOTAP或直接电穿孔转染K562细胞总RNA。抽提转染前后以及转染24h后的DC内RNA进行RTPCR检测,Westernblot分析p210蛋白表达,以及诱导CTL杀伤K562细胞功能检测等。PBMC以每组5×106/ml,分别在不同组分的培养液中培养DC,通过细胞计数、流式细胞仪测定CD1a表达、细胞纯度来估计制备效果。结果RTPCR检测表明DC经K562总RNA转染后,细胞内出现BcrAbl的cDNA条带,24h后消失。Westernblot试验表明转染24h后,开始表达p210特征性蛋白;并且明显促进T细胞对K562的杀伤活性。1%自体血浆体积分数RPMI1640培养的DC的CD1a表达量最高,并且细胞获得数量也仅屈居第二,为总体评价较高的一组。结论应用肿瘤总RNA负载DC来制备DC疫苗具有可行性,预示改良的DC疫苗抗肿瘤的广泛应用前景。     

NKG2D在NK细胞杀伤血液肿瘤细胞中的作用

本研究旨在探讨NKG2D在NK细胞杀伤血液肿瘤细胞时是否发挥作用。将多种血液肿瘤细胞株作为靶细胞,并在靶细胞中检测NKG2D相应配体的表达,而后进行杀伤实验。将靶细胞与羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)共孵育,同时将NK细胞系NK92MI分别与NKG2D特异性封闭抗体或同型对照抗体共孵育。之后将NK92MI分别与多种血液肿瘤细胞共同培养,2 h后用流式细胞分析方法检测靶细胞的凋亡率。结果显示:加入NKG2D特异性封闭抗体后,NK细胞对于急性髓系白血病细胞Kasumi-1的杀伤作用减弱约30%,而在其他血液肿瘤细胞株中封闭NKG2D并未明显影响NK细胞对于靶细胞的杀伤。结论:在NK细胞作用于某些靶细胞时,NKG2D促进NK细胞的杀伤作用。     

Effect of calcitriol on peripheral blood lymphocyte cytotoxicity.

To clarify the biochemical mechanism responsible for the inhibition by calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) of cytotoxicity in peripheral blood lymphocytes (PBL), the human NK sensitive K562 cell line and the human tumor necrosis factor-sensitive murine L929 cell line were used as targets and subsequently compared. The cytotoxicity of PBLs for K562 cells was not changed by preincubation for 4 h with 10 ng/ml phorbol myristate acetate (PMA), but was reduced after an overnight preincubation with 10(-9) or 10(-8) M calcitriol. Using L929 cells, preincubation of PBLs with 10 ng/ml PMA for 4 h increased their cytotoxicity. Overnight incubation with calcitriol significantly reduced PBL cytotoxicity for L929 cells in a dose related manner and suppressed the enhancement of this cytotoxicity by PMA. Pretreatment of PBLs with cycloheximide reduced their cytolysis for L929 cells but did not change their cytotoxicity towards K562 cells. Consequently, the natural cytotoxicity of PBLs for K562 cells does not involve the same mechanism as their cytotoxicity for L929 cells and is therefore subject to different forms of regulation. However, calcitriol reduced PBL cytotoxicity towards both target cells.     

Interferon-induced resistance of tumor target cells against lysis by interleukin-2-activated killer cells

IFN-gamma has been shown to decrease the susceptibility of target cells to NK cell-mediated cytotoxicity. In this report, the effect of IFN-gamma on the sensitivity of target cells to killing by various human lymphocyte cytotoxic activities such as NK/K, IL-2-augmented NK/K cell activity, and IL-2-activated killer activity were studied. Although NK-sensitive K562 cells showed marked resistance to NK cell activity as previously reported, the resistance was overwhelmed by augmentation of NK activity with IL-2. IL-2-activated killer cell activity, which can lyse NK-resistant tumor cell lines upon culture in IL-2, showed decreased cytotoxicity against most of the IFN-gamma-treated target cells tested. By contrast, no decrease of target cell sensitivity to K cells was observed, even though K cells were treated with IL-2. These findings suggest that as far as NK-resistant tumor cells are concerned, an IFN-dependent mechanism inhibits the Fc receptor-independent mediators of tumor surveillance, but not Fc receptor-dependent ones. This should be considered when planning adoptive immunotherapy of IL-2-activated killer cells for human malignancy.     

白细胞介素12单独或联合白细胞介素2对人脐血单个核细胞抗肿？…

目的 探讨白细胞介素１２（ＩＬ－１２）单独或联合白细胞介素２（ＩＬ－２）对人脐血单个核细胞（ＣＲＭＣ）抗肿瘤作用的影响。方法 采用＾３Ｈ－ＴｄＲ释放法测定经ＩＬ－１２和（或）ＩＬ－２刺激的ＣＢＭＣ和人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）的抗肿瘤活性,及在电镜下观察激活的ＣＢＭＣ所杀伤的Ｋ５６２细胞的形态特征。结果 ①ＩＵ／ｍｌＩＬ－１２激活的ＧＢＭＣ即产生较强的杀伤活性,对Ｋ５６２及Ｒａｊｉ细胞的杀伤率分