人泛素偶联酶UBE2C/UbcH10基因的克隆、原核表达载体的构建及表达

目的 获取泛素偶联酶家族成员之一的UBE2C/UbcH10的基因,构建具有His标签的原核表达载体,在大肠杆菌中表达UBE2C/UbcH10蛋白.方法 利用RT-PCR的方法 从肝癌细胞HepG2中获得UbcH10的基因,克隆到pMD-19T载体中并测序鉴定,酶切回收后插入原核表达载体pET32a(+)中,构建重组表达载体pET32a-UbcH10,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达.结果 重组表达载体pET32a-UbcH10在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导4h获得稳定高效的融合表达.重组蛋白以可溶形式存在,大小在29.0 kD左右.结论 UbcH10重组表达载体的成功构建以及重组蛋白的表达,为进一步其结构和功能的研究奠定了基础,有望揭示该蛋白在癌症发生发展过程中的作用.     

泛素偶联酶UBE2C/UbcH10荧光蛋白表达载体的构建及肝癌细胞中的表达

目的构建人泛素偶联酶UBE2C/UbcH10荧光蛋白真核表达载体,并转染肝癌细胞,筛选建立稳定转染细胞株。方法从构建好的pMD19-T/UbcH10载体中PCR扩增UbcH10基因,PCR产物双酶切后克隆入pEGFP-N1真核表达载体中,构建真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10,进行双酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10和空载体pEGFP-N1利用脂质体Lip2000TM分别转染进入肝癌细胞SMMC7721中,建立肝癌细胞SMMC7721的G418细胞死亡曲线,选择G418的筛选浓度,经G418结合荧光显微镜观察筛选稳定转染细胞。将筛选获得的肝癌细胞进行有限稀释法单克隆化,收集单个细胞克隆扩大培养备用。结果经双酶切和测序鉴定,带有荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10构建成功,经脂质体介导真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10和空载体pEGFP-N1成功转入肝癌细胞SMMC7721中,经800μg/mL G418筛选并进行单克隆化获得稳定转染的细胞株SMMC7721-pEGFP-N1和SMMC7721-pEGFP-N1/UbcH10,阳性转化率达到9...     

人resistin基因原核表达载体构建和表达

【目的】构建人resistin基因原核表达载体并观察其表达，为开展对resistin的研究打下实验基础。【方法】酚氯仿一步法从一位2型糖尿病合并胆管癌患腹壁皮下脂肪组织抽取总RNA，RT-PCR法扩增出resistin基因cDNA，经测序后，PCR产物亚克隆入 T载体，用EcoR I和Kpn I分别酶切重组T质粒和原核表达载体pGENKS，然后resistin基因片段和表达载体通过T4DNA连接酶进行定向连接，用核酸内切酶EcoR I、KpnI酶切和测序方法鉴定出重组表达质粒。重组表达质粒转化大肠杆菌JM109，经1mmol／LIPTG在32℃诱导表达2h，裂解细菌，进行PAGE凝胶电泳鉴定融合蛋白的表达。【结果】RT-PCR扩增产物分子大小为327bp，序列分析表明为人resistin基因完整编码区。PCR产物与T载体连接、转化大肠杆菌后，从细菌质粒中酶切回收了目的片段。重组表达质粒经EcoR I和Kpn I双酶切后能产生出327bp、4980bp大小的两个片段，序列分析表明重组表达质粒包含人resistin基因完整编码区，基因编码无移位，PAGE凝胶电泳表明在细菌裂解上清有分子质量为39．5kD的融合蛋白。【结论】成功构建了人resistin基因原核表达载体，且构建的载体能表达出含目的蛋白的融合蛋白，为下一步研究打下了实验基础。     

家蚕蚕蛹过敏原几丁质酶基因的克隆和原核表达载体的构建

目的 克隆、表达家蚕蚕蛹过敏原几丁质酶基因,并构建其原核表达载体.方法 提取家蚕的总RNA,RT-PCR克隆家蚕过敏原几丁质酶的全长基因,设计简并引物,扩增家蚕几丁质酶基因的完整开放阅读框,与pET-28a载体连接,构建原核表达载体.结果 成功克隆家蚕主要变应原几丁质酶基因并构建其原核表达载体.该基因含有长度为1 668 bp的开放阅读框,编码555个氨基酸.该蛋白质的相对分子质量为61 500,电点为5.78,编码序列与数据库中已知的家蚕几丁质酶基因的同源性为99%.结论 成功克隆家蚕蚕蛹主要过敏原几丁质酶基因并构建了原核表达载体,为家蚕蚕蛹过敏原几丁质酶的重组表达和免疫活性鉴定等奠定了基础.     

人胃蛋白酶原A基因原核表达载体构建及鉴定

目的构建人胃蛋白酶原A(Pepsinogen A)原核表达载体,用于下一步人胃蛋白酶的表达。方法以Pepsinogen A CDNA为模板,利用PCR技术扩增Pepsinogen A基因,与pMD18-T载体相连构建载体pMD18-T/Pepsinogen A,提取质粒进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切并测序鉴定,插入原核表达载体pET30a的相应位点,构建原核表达载体pET30a-Pepsinogen A,经菌落PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切分析鉴定重组质粒。结果 PCR扩增出约1 000bp的Pepsinogen A基因片段,经酶切和测序验证Pepsinogen A基因正确;克隆至表达载体后,菌落PCR及双酶切证明pET30a-Pepsinogen A原核表达载体构建成功。结论成功构建了pET30a-Pepsinogen A原核表达载体,为进一步分析研究人胃蛋白酶提供了实验基础。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因原核表达载体的构建与鉴定

目的构建人心肌肌钙蛋白I（cTnI）基因的原核表达重组体并鉴定。方法利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人cTnI的cDNA片段，设计引物将其第二和第四个密码子突变后插入原核表达载体形成重组体，并导入宿主菌BL21（DE3）中，采用双酶切及PCR方法鉴定后测序。结果经PCR扩增成功获得699bp的cTnI基因，重组体酶切分析及PCR显示结果与预想一致，测序正确。结论成功克隆了cTnI基因并构建了原核表达重组体。     

IL-32原核表达载体的构建及表达

目的 构建人IL-32原核表达载体,并进行初步诱导表达.方法 PCR扩增IL-32基因并将其与原核表达质粒pET32a(+)连接,重组pET32a- IL-32经PCR、酶切及测序鉴定后转入表达菌株BL21(DE3)进行融合蛋白的少量诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测目的蛋白表达及水平.结果 含有重组质粒的表达菌株经IPTG诱导后获得高效表达,融合蛋白主要存在于包涵体中,重组蛋白表达水平占总蛋白的27.5%;Western Blotting分析表明该蛋白可与特异性抗体发生结合.结论 构建了人IL-32基因的原核表达载体,获得IL-32融合蛋白.     

人β细胞素基因原核表达载体的构建

目的构建人BTC基因的原核表达载体。方法以人胰岛细胞瘤CDNA为模板，采用聚合酶链式反应（PCK）扩增BTC基因成熟蛋白编码区的全部序列，克隆入原核细胞表达载体PET32a（＋）中，经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果PCK扩增的特异性片段长度为240bp，以此构建的重组质粒PET32a（＋）-BTC，经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后显示5．9kb和250bp左右的两条片段，测序结果与Genbank中的人BTC基因eDNA（Genbank序列号NM_001729）序列一致。证明人BTC基因已成功克隆到了原核细胞表达载体PET32a（＋）中。结论成功构建了PET32a（＋）-BTC重组原核表达载体。     

人SMRT基因真核和原核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人SMRT基因真核和原核表达载体。方法：体外人工合成SMRT-C645bp对应的基因片段,克隆至pUC57载体,酶切,测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至pCMV-myc载体和pGEX-6p-1载体,并酶切和测序鉴定。结果：成功构建了人pCMV-myc-SMRT真核表达载体和pGEX-6p-1-SMRT原核表达载体。结论：成功构建了人SMRT真核和原核表达载体,为下一步蛋白间相互作用的证实提供了基础。     

人心肌肌钙蛋白I基因原核表达载体的构建与鉴定

目的构建人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因的原核表达重组体并鉴定。方法利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人cTnⅠ的cDNA片段,设计引物将其第二和第四个密码子突变后插入原核表达载体形成重组体,并导入宿主菌BL21(DE3)中,采用双酶切及PCR方法鉴定后测序。结果经PCR扩增成功获得699bp的cTnI基因,重组体酶切分析及PCR显示结果与预想一致,测序正确。结论成功克隆了cTnI基因并构建了原核表达重组体。     

抑癌基因BCSC-1原核表达载体的构建及诱导表达

目的 构建BCSC-1基因原核表达载体并进行诱导表达、纯化.方法 PCR方法从腺病毒穿梭载体pDC316-BCSC-1扩增BCSC-1基因,构建原核表达载体ET30a-BCSC-1,转化感受态E.coli BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测目的 蛋白的表达,并用超声洗涤方法进行目的 蛋白洗涤纯化.结果 成功构建原核表达载体pET30a-BCSC-1;在IPTG诱导下在E.coli BL21(DE3)中高效表达相对分子质量(Mr)为86 000的重组BCSC-1蛋白,目的 蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中,经超声洗涤纯化后,重组蛋白纯度可达85%以上.结论 利用构建的原核表达载体成功表达出BCSC-1蛋白,为进一步制备抗BCSC-1的单克隆抗体及在临床中的应用打下良好基础.     

小鼠OX40原核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体并进行诱导表达。方法PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a（＋），重组pET32a—OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21（DE3）进行融合蛋白的小量诱导表达。结果出现新增蛋白条带，融合蛋白主要存在于包涵体中；Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合。结论构建了小鼠OX40基因的原核表达载体，获得OX40胞外段融合蛋白。     

小鼠IL-35基因的克隆及原核表达

目的 克隆小鼠mIL-35两亚基mEBI3,mIL-12p35 cDNA,并构建mIL-35基因的原核表达载体并进行诱导表达.方法 RT-PCR方法从RAW246.7细胞中扩增mEBI3基因及脂多糖体外刺激BALB/c小鼠的脾细胞中扩增mIL-12p35基因,通过重叠PCR方法扩增出mEBI3-Linker-mIL-12p35基因,并构建原核表达载体pET-30a-mIL-35,转化感受态E.coli BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测目的蛋白的表达.结果 成功克隆了mEBI3、mIL-12p35 cDNA,通过重叠PCR方法扩增出mEBI3-Linker-mIL-12p35片段,并构建出原核表达载体pET-30a-mIL-35;在IPTG诱导下在E.coli BL21(DE3)中高效表达相对分子质量(Mr)为50 000的重组mIL-35蛋白,目的蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中.结论 利用构建的原核表达载体pET-30a-mIL-35成功表达出mIL-35蛋白,为进一步探讨mIL-35的生物学功能奠定了基础.     

甲状腺球蛋白抗原决定簇基因的克隆及原核表达载体的构建

目的：扩增甲状腺球蛋白抗原决定簇基因，构建可转化人大肠杆菌的重组表达载体。方法：用TRIzol一步法从甲状腺组织中提取总RNA，RT—PCR逆转录出cDNA，PCR扩增出目的基因，与pET102／D—TOPO载体进行拓扑克隆．对重组质粒进行PCR、酶切及测序鉴定。结果：甲状腺球蛋白抗原决定簇基因及其重组表达载体经鉴定准确无误。结论：成功构建了带有目的基因的原核表达载体。     

Kringle5基因的克隆、原核表达载体构建和蛋白表达

目的寻求一条高效且快速获得kingle5蛋白的途径．方法从人膀胱癌组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增出kringle5基因,构建出原核表达载体pGEX-5X-1／kringle5,运用工程菌表达蛋白．结果测序表明kringle5基因与GenBank上报道的基因序列相同,并成功表达出kringle5融合蛋白．结论成功构建了人原核表达载体（pGEX-5X-1／kringle5）,为获得抗肿瘤药物kringle5提供了一种切实可行的途径,为实体瘤的抗血管生成治疗研究奠定了初步基础．     

血小板衍化内皮细胞生长因子原核表达载体的构建

目的 构建血小板衍化内皮细胞生长因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）的原核表达载体。方法 设计引物扩增ＰＤ－ＥＣＧＦ的ｃＤＮＡ,然后亚克隆入原核表达载体ｐＱＥ和ｐＱＥ－３２ａ,并转化入大肠杆菌ＪＭ１０９。结果 通过菌落原位杂交、ＰＣＲ和重组质粒酶切分析等方法,筛选出重组阳性克隆。结论 此重组质粒可用于原核表达等进一步研究。dir     

抑癌基因p16原核表达载体的构建及其表达的研究

为获取具有生物学活性的ｐ１６蛋白，采用定向克隆方法将双酶切克隆质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ｐ１６得到的ｐ１６ ｃＮＤＡ片段连接到双酶切的原核表达载体ｐＢＶ２２０上，转化大肠杆菌ＴＧ１得到含重组表达质粒ｐＢＶ２２０－ｐ１６的工程菌，温度诱导表达后，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ｐ１６蛋白。     

人肥胖基因的克隆与原核表达载体的构建

目的：克隆人肥胖基因瘦素蛋白（leptin）编码区cDNA序列，并构建其原核表达载体。 方法：在人体脂肪组织中提取mRNA，利用RT-PCR扩增人肥胖基因，将其插入pMD18-T载体，经双酶切、鉴定后将肥胖基因片段亚克隆入pET-28a表达载体，提取质粒。将阳性重组质粒转化表达受体菌E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导肥胖基因表达产物,以聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测产物蛋白。 结果：经测序证实获得的肥胖基因序列与相关文献报道一致，其表达产物的相对分子质量约为20 000。 结论：利用pMD18-T克隆载体和pET-28a表达载体可以有效地在原核生物中表达重组人类瘦素蛋白。     

Sjcb2基因原核表达载体的构建及表达

目的 探讨日本血吸虫（Schistosoma japonicum，Sj）中国大陆株（Chinese strain）组织蛋白酶B肽链内切酶基因（Cathepsin B endopeptidase）的原核表达载体pWR450-1的构建及表达情况。方法根据Genbank中Cathepsin B endopeptidase全序列（Genbank登录号为AY226984）设计特异性引物应用聚合酶链反应技术扩增基因全长，克隆入pUCm—T载体，酶切后亚克隆入原核表达载体pWR450-1并进行表达；利用SDS—PAGE及Western blotting观察日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶表达情况。结果成功构建了Sjcb2／pWR450-1原核表达重组质粒，该重组质粒在大肠杆菌中可经IPTG诱导表达分子量约为86kD的融合蛋白，Western blotting分析表明，该融合蛋白能被兔阳性血清所识别。结论 日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶可在原核表达载体pWR450-1中表达，为研究其功能打下了必要的基础。