shRNA靶向干扰NHERF1对PC-3M前列腺癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨shRNA靶向干扰钠氢交换调节因子(NHERF)1后对前列腺癌细胞PC-3M生物学行为的影响.方法 将pSuper.puro NHERF1 shRNA质粒和阴性对照质粒pSuper.puro luciferase shRNA分别转染人PC-3M前列腺癌细胞,经嘌呤霉素筛选,建立稳定低表达NHERF1的PC-3M细胞株.经Western印迹验证后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测肿瘤细胞增殖活性,采用划痕实验检测NHERF1-shRNA对前列腺癌PC-3M细胞迁移能力的影响,采用流式细胞仪检测NHERF1-shRNA对PC-3M细胞凋亡的影响,采用Western印迹检测NHERF1-shRNA对凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2表达的影响.结果 转染NHERF1-shRNA组比未转染及空载组细胞的增殖能力明显降低(F=62.63,P=0.004);转染NHERF1-shRNA组比未转染及空载组细胞的迁移率明显降低.相比于未转染PC-3M细胞和转染阴性对照质粒细胞,转染NHERF1-shRNA组细胞的凋亡百分比明显增加[(2.55±0.92)％和(11.98±3.28)％],达4倍以上(t=-2.392,P=0.001);Bcl-2蛋白的表达降低,Bax蛋白的表达升高.结论 靶向NHERF1的序列特异性shRNA可抑制PC-3M细胞的增殖和迁移,并促进细胞凋亡.     

WWOX基因对卵巢癌PEO1细胞黏附能力的影响

目的 观察WWOX基因转染细胞对卵巢癌PEO1细胞黏附能力的影响,并探讨其作用机制.方法 利用已构建的WWOX转染细胞、质粒转染细胞及PEO1母细胞进行黏附实验,观察不同细胞对纤粘连蛋白(Fn)介导的细胞黏附性.利用整合素α和β介导的细胞黏附实验,筛选出与卵巢癌细胞黏附有关的整合素.利用筛选出的整合素,进行封闭卵巢癌细胞表面整合素的功能实验,流式细胞检测整合素的表达情况.结果 在Fn包被的培养孔中培养2 h后,WWOX转染细胞对Fn的细胞黏附性明显低于PEO1母细胞和质粒转染细胞(均P<0.01).在质粒转染细胞中,整合素α2和α3的表达明显高于WWOX转染细胞(均P<0.05),而整合素β1、β2的表达无明显变化(P>0.05);封闭整合素α3后,所有转染细胞对Fn的黏附性明显降低,与非特异性抗体IgG相比,差异有统计学意义(P<0.05),而封闭整合素α2后,与非特异性抗体IgC相比,差异无统计学意义(P>0.05).流式细胞检测结果显示,在WWOX转染细胞中,整合素α3的表达明显低于质粒转染细胞(P<0.05).结论 WWOX基因通过调节卵巢癌细胞与细胞外基质的相互作用,降低整合素α3活性,进而降低卵巢癌细胞对Fn介导的黏附性.     

RNA干扰hTERT基因治疗喉鳞状细胞癌的实验研究

目的:探讨RNA干扰hTERT(人端粒酶逆转录酶)基因对人喉鳞状细胞癌的治疗作用.方法:根据hTERT cDNA序列构建表达hTERT mRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1、pshRNA2.将shRNA质粒分别转染人喉癌Hep-2细胞株及荷瘤裸鼠瘤体内.以激光共聚焦显微镜观察质粒在Hep-2细胞及瘤体内的表达;以MTT法观察质粒对Hep-2细胞增殖的抑制作用;以蛋白印迹法(Western blot法)检测Hep-2细胞中hTERT蛋白的表达;以免疫组化SP法检测裸鼠瘤体内hTERT蛋白的表达.结果:pshRNA1、pshRNA2转染Hep-2细胞及pshRNA1转染瘤体后,共聚焦显微镜下见大量的癌细胞表达绿色荧光,hTERT蛋白表达明显下降.细胞受pshRNA1、pshRNA2转染后,其生长活性受到明显抑制.体内抑瘤实验表明,与空质粒载体组(pshRNA4)和生理盐水组相比,pshRNA1组移植瘤生长明显受到抑制.结论:表达shRNA的、hTERT基因特异的真核表达质粒能有效转染体内、外喉鳞癌细胞,并可有效抑制人喉鳞癌细胞的生长,为今后应用RNA干扰基因治疗喉癌提供重要的实验参考.     

LRIG1基因特异性RNA干扰表达载体的构建、鉴定和稳定株的筛选

目的构建针对LRIG1（leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1,LRIG1）基因的特异性RNA干扰质粒,稳定转染人胶质瘤GL15细胞系,观察其对目的基因LRIG1表达的影响,为探讨LRIG1基因沉默对人脑胶质瘤细胞的生物学行为调控奠定基础。方法根据GenBank提供的LRIG1基因序列设计2条RNA干扰序列,命名为LRIG1-shRNA1、LRIG1-shRNA2,并设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为pGenesil2-negative shRNA。合成各自的寡核苷酸链,退火后与pGenesil2质粒载体连接,转化扩增后测定序列。用不同浓度的G418作用于GL15细胞确定G418对GL15的筛选浓度。将3种重组表达载体转染GL15细胞,G418筛选后挑单克隆并扩增获得稳定株。Western印迹法在蛋白水平上检测LRIG1的表达。结果重组pGenesil2-LRIG1-shRNA质粒经限制性酶切及DNA测序分析证明序列插入正确。G418对GL15细胞的筛选浓度为600mg/L,筛选出稳定转染三种质粒的GL15细胞,转染pGenesil2-LRIG1-shRNA1组细胞LRIG1蛋白表达明显低于转染pGenesil2-negative shRNA组。结论成功构建了针对LRIG1基因的特异性shRNA表达载体（pGenesil2-LRIG1-shRNA1）,转染细胞后可抑制LRIG1基因表达,为下一步研究其功能奠定基础。     

Bmi-1 shRNA对膀胱癌5637细胞的侵袭和转移抑制及其机制

目的:探讨特异性抑制Bmi-1基因表达对膀胱癌5637细胞侵袭和转移的影响.方法:将Bmi-1短发夹RNA(shRNA)真核表达载体、脂质体转染膀胱癌5637细胞.Transwell侵袭实验和细胞划痕实验观察Bmi-1 shRNA对膀胱癌5637细胞侵袭和转移的影响.RT-PCR方法检测Bmi-1shRNA对基质金属蛋白酶-2(MMP-2)mRNA表达的影响.蛋白质印迹法检测Bmi-1 shRNA对E-cadherin和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响.结果:Transwell侵袭实验结果显示,实验组细胞的穿膜细胞数为78.0±5.8,空质粒组为158.0±6.7,未转染组为153.0±4.6.细胞划痕实验结果显示,实验组细胞迁移能力明显降低,P＜0.05.RT-PCR结果显示,与不加转化生长因子-β(TGF-β1)组相比,TGF-β1作用后,未转染组和空质粒组中MMP-2表达明显升高,P＜0.05.蛋白质印迹结果显示,与不加TGF-β1组相比,TGF-β1作用后,未转染组和空质粒组中E-cadherin表达明显降低,α-SMA表达明显升高,P＜0.05.结论:Bmi-1 shRNA可以抑制膀胱癌5637细胞侵袭和转移,其机制是通过阻断TGF-β1促进肿瘤细胞侵袭和转移作用完成的.     

靶向RhoA shRNA对卵巢癌HO8910细胞体外侵袭能力影响的研究

目的:观察RNA干扰(RNAi)技术对卵巢上皮癌HO8910细胞株RhoA基因表达的抑制作用,探讨其对HO8910细胞侵袭、迁移的影响。方法:构建RhoA基因特异性短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,以脂质体介导转染卵巢癌细胞HO8910,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测RNAi后HO8910中RhoA的mRNA及蛋白表达水平变化,Transwell小室体外侵袭和划痕试验检测细胞侵袭和迁移能力。结果:转染RhoA shRNA(质粒1、2和3)组的RhoA mRNA的表达明显弱于未转染任何质粒的空白组和对照组,P<0.05,且质粒2组表达最低(27.9%),抑制效率最高(72.1%),具有序列特异性。转染序列特异性RhoA shRNA的细胞(实验组)与对照组比较,RhoA蛋白的表达分别为(6.08±2.24)%和(59.25±17.96)%,P<0.05;细胞平均侵袭能力测值为18.82±2.61和35.25±5.12,P<0.05;愈合百分比为(43.80±6.21)%和(69.35±4.42)%,P<0.05。结论:靶向RhoA的shRNA可抑制卵巢癌HO8910细胞RhoA基因的表达,能降低细胞体外侵袭和迁移能力。     

KiSS-1抑制骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移

摘 要　目的：探讨人肿瘤转移抑制基因KiSS-1对人骨肉瘤MG63细胞侵袭、迁移能力的影响。方法:构建KiSS-1表达质粒pSNAV2.0-KiSS-1。pSNAV2.0-KiSS-1质粒转染骨肉瘤MG63细胞,经G418筛选稳定表达KiSS-1基因的MG63细胞。应用real-time PCR、Western blotting检测KiSS-1 mRNA和蛋白的表达。Transwell小室法检测MG63细胞的侵袭力,millicell小室、细胞划痕愈合实验检测KiSS-1基因对MG63细胞迁移能力的影响。结果:成功建立pSNAV2.0-KiSS-1质粒并稳定转染MG63细胞（MG63-KiSS-1细胞）,MG63-KiSS-1细胞高表达KiSS-1 mRNA和蛋白。转染KiSS-1质粒后的MG63细胞侵袭力显著降低（P<0.05）;millicell法、细胞划痕愈合实验证实转染KiSS-1质粒后的MG63细胞迁移力也明显降低（P<0.05）。结论:KiSS-1基因能显著抑制人骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移能力,在骨肉瘤的转移中起重要作用。     

转铁蛋白受体介导的Bcl-2 shRNA对U251细胞生长的抑制

目的：构建Bcl-2短发夹状RNA（short hairpin RNA,shRNA）序列的表达载体并研究其对神经肢质瘤细胞U251生长的抑制作用。方法：针对Bcl-2基因编码shRNA的序列,克隆到携带绿色荧光蛋白基因的载体,经酶切电泳和DNA测序鉴定。采用转铁蛋白一多聚乙烯亚胺介导的转染方法将重组的shRNA质粒转入U251细胞后,通过倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察绿色荧光蛋白的表达,用免疫细胞化学的方法检测Bcl-2蛋白表达水平;采用MTT法测定细胞增殖情况。结果：编码短发夹状的RNA序列被成功地插入到预期位点。转柒Bcl-2shRNA1、shRNA2载体分别入U251细胞后,其Bcl-2蛋白表达水平均显著降低,P〈0．05。U251细胞在48、72和96h细胞生长明显受到抑制,分别与转染阴性shRNA组比,差异有统计学意义,P〈0．05。结论：构建的两个Bcl-2shRNA均可特异性地抑制U251细胞生长．     

shRNA沉默RAGE基因表达对前列腺癌细胞增殖的抑制作用

目的:构建针对人晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products , RAGE)基因的特异性短发夹RNA(small hairpin RNA, shRNA)表达载体,探讨其对前列腺癌细胞DU145增殖的抑制作用.方法:设计并合成4种针对RAGE基因的特异性短链寡核苷酸,构建含shRNA RAGE的表达载体,转染高表达RAGE的亚克隆细胞株sub DU145-2C1.荧光显微镜下观察细胞转染后的情况,实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative -PCR, RFQ-PCR)检测转染shRNA后对RAGE mRNA表达的影响,Western印迹法检测对RAGE蛋白表达的影响,CCK-8法检测对细胞增殖的影响,划痕实验观察对细胞迁移能力的影响.结果:构建获得的shRNA RAGE表达载体能够有效抑制RAGE基因的表达(P<0.05),其中以shRNA RAGE -1(R1)的抑制作用最强,其对RAGE mRNA表达的抑制率为84%,对蛋白表达的抑制率为27%.细胞增殖结果显示,转染shRNA RAGE后细胞增殖能力明显降低;而细胞迁移能力则无明显变化.结论:shRNA RAGE能有效下调RAGE基因的表达水平,抑制细胞增殖.     

沉默高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ表达对人胃癌BGC-823细胞侵袭和迁移能力的影响

目的:探讨RNA干扰沉默高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgi a-mannosidase Ⅱ,GM Ⅱ)基因表达对人胃癌BGC-823细胞侵袭和迁移的影响.方法:为沉默GM Ⅱ基因,构建了4个分别针对不同靶位点的短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)质粒表达载体,同时合成阴性对照质粒表达载体.应用LipofectAMINE2000将质粒转染入BGC-823细胞.分别采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测转染后GM Ⅱ mRNA和蛋白表达的变化,选出沉默效果最佳的质粒.应用Transwell侵袭实验和划痕损伤实验分别检测GM Ⅱ基因沉默对人胃癌细胞BGC-823侵袭和迁移能力的影响.结果:质粒载体pGPU6/GFP/Nco-1303沉默GM Ⅱ基因的效果最好.转染pGPU6/GFP/Neo-1303组穿透小室基质的细胞数明显少于空白对照组和转染阴性对照组(P＜0.05).无血清培养液培养24 h后,转染pGPU6/GFP/Neo-1303组细胞的迁移能力较空白对照组和转染阴性对照组明显降低(P＜0.05).结论:RNA干扰技术可沉默人胃癌BGC-823细胞中GMⅡmRNA和蛋白的表达,从而抑制BGC-823细胞的侵袭和迁移能力.GM Ⅱ可能成为胃癌治疗的新靶点之一.     

shRNA表达载体介导的细胞周期蛋白E1基因沉默对肾癌ACHN细胞生长的抑制作用

背景与目的: 肾细胞癌中细胞周期蛋白E1(eyclinE1)的过表达与预后密切相关.为进一步验证其作为肿瘤基因治疗新靶点的可行性,本研究探讨shRNA表达载体介导的cycl inE1基因沉默对肾癌ACHN细胞生长的抑制作用.方法:针对cyclinE1基因设计并合成特定的RNA干扰模板片段,连接到pGenesil-1-U6载体上构建shRNA真核表达载体;将上述重组载体经脂质体转入ACHN肾癌细胞株.RT-PCR、Western印迹分析cyclinE1基因mRNA及蛋白表达抑制率;MTT比色法绘制细胞生长曲线;流式细胞术测细胞周期和凋亡细胞比率;Transwell小室体外侵袭实验和细胞划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力.结果: shRNA重组载体介导肾癌ACHNcyclihE1抑制效果显著(0.09±0.05),显著低于空载体对照组(0.884±0,04)及未转染组(0.904±0.03)(P<0.05).经流式细胞术测得转染重组质粒组细胞生长停滞于G1期且凋亡比率显著升高(11.154±4.00)%(P<0.05).生长曲线结果显示重组载体转染组细胞生长明显缓慢(P<0.05).Transwell及迁移实验结果提示,转染重组质粒组细胞侵袭和迁移能力显著下降(P<0.05). 结论: 肾癌cycl inE1的表达可被载体介导诱发的RNA干扰所成功抑制,进而导致细胞生长、增殖以及侵袭能力受抑并诱导凋亡;本研究为探讨肾癌的RNAi治疗提供了初步实验依据.     

HOXB7基因敲除对人肝癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力的影响

目的 研究同源异型盒基因HOXB7（Homebox7）对人肝癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响及部分机制。方法 采用荧光定量PCR法选取HOXB7 mRNA高表达的人肝癌SMMC-7721细胞和HepG2细胞;设计靶向HOXB7的shRNA,瞬时转染肝癌SMMC-7721细胞,荧光定量PCR和Westernblot法检测shRNA靶向沉默的效果,CCK8、Transwell和划痕实验分别用于检测细胞增殖、侵袭和迁移能力;Western blot法测量肝癌SMMC-7721细胞中Smad3、p-Smad3表达水平。结果 HOXB7 shRNA转染的肝癌SMMC-7721细胞中HOXB7基因mRNA和蛋白表达水平均显著降低,同时细胞增殖、侵袭和迁移能力随之下降,且TGF-β通路中p-Smad3蛋白表达水平下调。结论 HOXB7可促进肝癌细胞增殖、侵袭以及迁移能力,其机制可能与调节Smad3磷酸化水平有关。     

Bcl-2短发夹状RNA对NB4细胞株生长的抑制作用

目的：构建Bcl-2短发夹状RNA（short hairpin RNA，shRNA）序列的表达载体并研究其对早幼粒白血病细胞株NB4生长的抑制作用。方法：针对Bcl-2基因构建编码shRNA序列的重组表达载体．经酶切电泳和DNA测序鉴定。采用脂质体介导的转染方法将重组的RNAi质粒转入NB4细胞后．通过荧光显微镜和流式细胞仪观察转染效率，采用Western Blot检测Bcl-2蛋白表达水平；采用MTT法测定细胞增殖情况。结果：编码Bcl-2 shRNA的RNA序列被正确地插入到预期位点。将两个Bcl-2 shRNA载体分别转入NB4细胞后，Bcl-2蛋白表达水平均降低．与转染阴性shRNA及未转染组比较，均有显著性差异（P〈0．05）。转染Bcl-2 shRNA1、shRNA2载体入NB4细胞在72、96h细胞生长明显受到抑制，分别与转染阴性shRNA、单纯载体组及未转染组比较，差异有显著性（P〈0．05）。结论：构建的两个Bcl-2 shRNA均可特异性地抑制NB4细胞生长。     

抑癌基因OVCA1体外对卵巢癌细胞A2780迁移和侵袭的抑制作用

目的:探讨卵巢癌基因1[ovarian cancer gene 1,OVCA1;也称为DPH2L( diphthamide synthesis protein 2-like)基因]体外对卵巢癌细胞系A2780迁移和侵袭能力的抑制作用.方法:采用脂质体法将GFP标记的携带OVCA1的重组质粒pEGFP-OVCA1或GFP空白质粒分别转染A2780细胞后,G418筛选稳定转染细胞,有限稀释法筛选稳定转染细胞的单克隆细胞株,荧光显微镜检查绿色荧光蛋白的表达及RT-PCR方法检测A2780细胞OVCA1基因mRNA的表达.A2780-OVCA1细胞为实验组, A2780-GFP细胞和A2780细胞为对照组,采用划痕实验、Transwell体外迁移实验和Matrigel体外侵袭实验检测OVCA1对A2780细胞迁移和侵袭能力的影响.结果:重组质粒pEGFP-OVCA1转染后获得了稳定表达GFP标记OVCA1蛋白的A2780细胞株.A2780-OVCA1组划痕后的细胞迁移速度明显小于两对照组(P<0.05);A2780-OVCA1组穿过Transwell滤膜的迁移细胞数明显少于两对照组(P<0.05);A2780-OVCA1组穿过Matrigel滤膜的侵袭细胞数明显少于两对照组(P<0.05).结论:OVCA1在体外具有显著抑制卵巢癌A2780细胞迁移和侵袭的作用.     

PTEN磷酸酶活性对乳腺癌细胞ZR-75-1迁移能力的影响

目的:探求PTEN蛋白的磷酸酶活性对乳腺癌细胞ZR-75-1转移能力的影响。方法:采用脂质体介导法分别将野生型PTEN质粒(wt-PTEN)、磷酸酶失活的PTEN质粒(G129R-PTEN)和只具有蛋白磷酸酶活性的PTEN质粒(G129E-PTEN)转染PTEN基因缺失的人乳腺癌细胞株ZR-75-1,Western印迹法检测PTEN蛋白及P397-FAK的表达水平,体外细胞划痕实验观察PTEN磷酸酶活性对ZR-75-1细胞迁移能力的影响,细胞基质黏附试验和人工重组基底膜侵袭试验测定PTEN质粒转染和未转染的ZR-75-1细胞的黏附抑制率和侵袭抑制率,免疫组化法检测MMP-2的水平。结果:wt-PTEN、G129R-PTEN及G129E-PTEN3种质粒均成功转染ZR-75-1细胞并有PTEN蛋白的表达,其中wt-PTEN、G129E-PTEN均能抑制ZR-75-1细胞迁移;wt-PTEN和G129E-PTEN转染细胞之间的黏附抑制率和侵袭抑制率或侵袭细胞相对数均无显著性差异,但与G129R-PTEN转染的和未经转染的ZR-75-1细胞相比有显著性差异(P<0.01)。wt-PTEN和G129E-PTEN质粒转染的ZR-75-1细胞其P397-FAK水平均显著低于G129R-PTEN质粒转染的ZR-75-1细胞;wt-PTEN与G129E-PTEN质粒转染的ZR-75-1细胞MMP-2水平对比于G129R-PTEN质粒转染的和未经质粒转染的ZR-75-1细胞有显著性差异(P<0.01)。结论:具有双特异磷酸酶活性的野生型PTEN基因和只具蛋白磷酸酶活性的PTEN基因均能抑制乳腺癌细胞ZR-75-1的迁移,而磷酸酶失活的PTEN基因则无此作用。     

RNA干扰CXCR4表达抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、黏附和迁移

目的：构建CXC趋化因子受体4（CXC chemokine receptor 4, CXCR4）RNA干扰真核表达载体,研究其对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、黏附及迁移能力的抑制作用。方法：构建针对CXCR4的带发夹结构的小RNA干扰序列,并连接到pGCsi-U6-Neo-GFP载体中,转染293T细胞,筛选出干扰效率最高的表达载体。脂质体法转染MDA-MB-231细胞。利用CCK8法、细胞-基质黏附实验和划痕修复实验检测shRNA干扰CXCR4表达对MDA-MB-231细胞增殖、黏附和迁移能力的影响。结果：成功构建CXCR4-shRNA重组质粒,并转染293T细胞,利用RT-PCR及Western blotting检测发现CXCR4沉默效率最高可达81.3%。CXCR4-shRNA转染能显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖(P<0.05)以及细胞与细胞外基质的黏附(P<005)。CXCR4-shRNA转染组MDA-MB-231细胞的迁移距离明显低于对照质粒组和空白对照组(P<0.01)。结论：CXCR4-shRNA干扰载体能特异性抑制CXCR4的表达,从而抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、黏附及迁移。     

HOXA9基因抑制肝癌细胞HepG2迁移与侵袭能力的实验研究

目的：探讨同源盒基因HOXA9对肝细胞肝癌细胞株HepG2迁移与侵袭能力的影响。方法：采用EndoFectinTM -Max转染试剂将HOXA9基因真核表达载体及其空载体转染至HepG2细胞,并应用脂质体法转染HOXA9 siRNA序列及阴性对照序列,采用实时荧光定量PCR（ Real-time PCR）及Western blot方法检测转染后HOXA9的mRNA和蛋白表达水平。以划痕实验和Transwell方法检测转染后细胞的迁移和侵袭能力。结果：在肝癌细胞HepG2中瞬时转染HOXA9真核表达载体后,其mRNA和蛋白表达明显增加,划痕实验检测发现48h细胞愈合率明显抑制,Transwell实验发现迁移和侵袭至下室的细胞数目明显减少;而转染HOXA9 siRNA序列后,HepG2细胞中HOXA9 mRNA及蛋白表达明显下调,划痕实验显示48h划痕愈合率增加,Tran-swell实验显示迁移和侵袭至下室的细胞数目明显增多。结论：HOXA9基因对肝癌细胞HepG2的迁移和侵袭能力有明显抑制作用,为进一步研究HOXA9在肝细胞肝癌发生和进展中的作用奠定了基础。     

短发夹RNA沉默S100A4基因表达对乳腺癌MCF-7细胞生长和侵袭能力的影响

目的:观察靶向S100A4基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对乳腺癌MCF-7细胞生长和侵袭的抑制作用.方法:构建S100A4基因特异性shRNA表达载体,经过脂质体介导将S100A4-shRNA表达载体转染入MCF-7细胞.应用实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)和Western印迹法检测转染后MCF-7细胞中S100A4的表达水平,运用MTT法和FCM法检测转染后MCF-7细胞的增殖水平和凋亡率变化.转染细胞经G418筛选及克隆化培养后获得稳定转染株, 运用Transwell小室法和划痕实验检测其侵袭力和迁移力的变化,裸鼠体内成瘤实验检测体内细胞增殖情况.结果: 经测序鉴定证实成功构建了S100A4-shRNA表达载体.所构建的S100A4-shRNA表达载体转染MCF-7细胞48 h后,能有效抑制S100A4的表达,并且显著降低MCF-7细胞增殖水平,以及诱导细胞进入晚期凋亡.稳定转染S100A4-shRNA表达载体的MCF-7细胞形态无显著变化,但其侵袭力和迁移力明显下降;裸鼠体内成瘤实验也显示实验组裸鼠移植瘤的体积和质量明显小于空白对照组和阴性对照组. 结论:S100A4-shRNA表达载体能有效地抑制乳腺癌MCF-7细胞中S100A4的表达,从而降低细胞增殖水平以及细胞侵袭力和迁移力.     

丹参酮ⅡA 磺酸钠通过降低整合素β3的表达抑制宫颈癌HeLa细胞迁移

目的：探讨丹参酮IIA 磺酸钠（sodium tanshinone IIA sulfonate,STS）对宫颈癌HeLa 细胞迁移的影响及其机制。方法：Transwell 迁移实验检测不同浓度STS、整合素β3 特异性抗体LM609 和转染过表达整合素β3 质粒对宫颈癌HeLa细胞迁移的影响,Western blotting 法检测不同浓度STS 和STS 刺激不同时间对HeLa 细胞整合素β3 表达的影响,CCK-8 法检测STS 对HeLa细胞活力的影响。结果：STS 以浓度依赖的方式降低HeLa 细胞的迁移（P<0.01）,LM609 显著降低HeLa 细胞迁移率（P<0.01）,STS刺激转染过表达整合素β3 质粒HeLa细胞的迁移率较单一STS刺激和STS刺激转染空质粒HeLa细胞的迁移率显著增加（P<0.01）;STS以浓度和时间依赖的方式降低HeLa细胞整合素β3 的表达（P<0.05）;不同浓度STS刺激的HeLa细胞存活数和空白对照组相比无显著差异（P>0.05)。结论：STS可减少宫颈癌HeLa细胞整合素β3 的表达,STS可显著减少HeLa细胞的迁移,整合素β3 特异性抗体LM609 也可显著降低HeLa细胞的迁移,转染过表达整合素β3 质粒则可减少STS对HeLa细胞迁移的抑制,STS可能通过减少整合素β3 的表达抑制HeLa细胞迁移,这为进一步阐明STS抗肿瘤的分子机制和STS临床应用提供实验依据。