人黑色素瘤抗原MAGE-A10的基因克隆及原核表达

目的:扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A10(melanoma antigen A10)cDNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达. 方法:从人黑色素瘤细胞系LiBr中提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出MAGE-A10 cDNA,插入载体pMD18-T中. 测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达载体pGEX-4T-3-MAGE-A10,转化大肠杆菌BL21株进行表达. 经IPTG诱导表达,谷胱甘肽亲和层析获得重组目的蛋白. 结果:成功获得MAGE-A10编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致. 可以获得部分可溶性的原核重组蛋白,经亲和层析和分析,证实融合蛋白占总量的58.9%. SDS-PAGE分析其相对分子质量(Mr)为67 000,Western blot证实为目的蛋白. 结论:成功获得MAGE-A10 cDNA,构建得原核表达载体并获得高效表达. 本研究为制备MAGE-A10 mAb及研究MAGE-A10可能参与肿瘤发生发展的机制奠定了基础.     

结核分枝杆菌候选抗原基因克隆与表达质粒构建

目的 克隆并构建编码结核分枝杆菌(MTB)ESAT6，Ag85B和MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中分别扩增出ESAT6，Ag85B和MPT64基因(288bp，978bp and 687bp)，并克隆到T载体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转化大肠杆菌E．coli Dh5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与献报道一致，证实符合表达框架。结论 成功地克隆并构建了ESAT6，Ag85B和MPT64基因的重组表达质粒pGEX-ESAT6,pGEX-Ag85B和pGEX-MPT64。     

人自身抗原Jo-1的基因克隆和原核表达

Jo-1抗原是组氨酰-tRNA合成酶（HARS）基因的表达产物。与多发性肌炎／皮肌炎（PM／DM）的发病机理有关。应用RT—PCR技术，我们在国内首次克隆表达成功人自身抗原Jo-1，为下一步建立以多种基因重组自身抗原为配体的自身抗体金标快速检测方法奠定了基础。[第一段]     

RT-PCR检测胃癌NY-ESO-1抗原的表达及其基因克隆

目的:研究NY-ESO-1基因在胃癌中的表达,以便了解为胃癌患者是否可以使用NY-ESO-1抗原为基础的疫苗治疗。方法:采用RT-PCR方法检测了NY-ESO-1基因在60例胃癌组织和相应的癌旁正常组织中的表达,采用分子克隆的方法从胃癌组织中克隆了NY-ESO-1cDNA。结果:NY-ESO-1基因在胃癌组织中的表达率为55%(33/60),在相应的癌旁正常组织中的未见表达,克隆的NY-ESO-1cDNA序列与GenBank报道一致。结论:NY-ESO-1基因在胃癌中的高表达率,NY-ESO-1抗原可以被具有HLA-1类分子限制性CTL识别。     

乙型肝炎病毒重组e抗原在大肠杆菌中的高效表达及初步应用

为了获得重组表达乙型肝炎病毒ｅ抗原。利用聚合酶反应扩增和重组技术。在大肠杆 菌中的高表达非融合型重组ＨＢｅＡｇ。结果：为模拟天然ＨＢｅＡｇ的结构。除第一个氨基酸为起始密码子ＡＴＧ所编码的甲硫氨酸外，共包括Ｐｒｅ－Ｃ区羧基端的９个氨基酸和ＨＢｃＡｇＮ－末端的１４９个氨基酸残基。     

黑色素瘤抗原—1基因在胃癌组织中的表达

目的：检测黑色素瘤抗原－1（MAGE－1）基因在胃癌组织中的表达，为应用MAGE－1基因产物对胃癌病人进行特异性抗肿瘤免疫治疗提供理论依据。方法：用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测30例胃癌组织及相应癌旁组织中MAGE－1基因的表达，并对1例RT－PCR阳性扩增产物进行DNA序列测定。结果：30例胃癌组织标本中有14例（46．7％）表达MAGE－1基因，而相应的癌旁组织均不表达MAGE－1，两组比较差异有显著性（P＝0．001）；DNA序列测定证实1例RT－PCR扩增产物中的目的基因片段为MAGE－1cDNA序列。结论：MAGE－1基因在胃癌组织中有较高表达，这使得以该基因编码蛋白作为疫苗用于胃癌的免疫治疗成为可能。     

白血病患者WT1基因的表达及临床意义

目的：检测白血病患者WT1基因的表达水平，并探讨其与临床的关系。方法：应用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）技术，检测58例初治急性白血病（AL）、20例慢性粒细胞白血病（CM）和10例非血液病患者WT1基因的表达。结果：10例非血液病患者WT1基因的表达均呈阴性。58例AL患者44例检测有WT1基因的表达，阳性率为75．9％，其中急性髓性白血病（AML）阳性率为86．4％，急性淋巴细胞白血病（ALL）为42．9％，两者差异有显著性（P＜0．01）；AML治疗前WT1的表达水平与完全缓解（CR）率无相关（P＞0．05），但倾向于WT1基因低表达者有更高的CT率（低表达组CR率为75．0％，高表达组率为34．8％）。CML慢性期WT1的表达水平极低，随临床分期进展水平增高，高表达者预示急变。结论：AL和CML急变期患者WT1基因过度表达，初治AML治疗前WT1的表达水平与疗效无相关，但低表达组CR为75％，高表达组CR为34．8％。     

乙型肝炎病毒重组e抗原在大肠杆菌中的高效表达及初步应用

为了获得重组表达乙型肝炎病毒 ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）。利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增和重组技术，在大肠杆菌中的高表达非融合型重组ＨＢｅＡｇ。结果：为模拟天然ＨＢｅＡｇ的结构，除第一个氨基酸为起始密码子ＡＴＧ所编码的甲硫氨酸外，共包括Ｐｒｃｅ－Ｃ区羧基端的９个氨基酸和ＨＢｃＡｇ Ｎ－末端的１４９个氨基酸残基、经诱导表达，其产物相对分子质量约为１７．５ × １０３，产量占细菌总蛋白的１１％。结论：用Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法分析，本表达产物可与特异性的ＨＢｅＡｇ抗体反应。用斑点酶免疫法可以检测患者血清的抗ＨＢｅ。     

人微小病毒B19VP1基因原核表达克隆的构建

目的：构建人微小病毒B19 VP1基因的原核高效表达系统。方法：通过PCR扩增B19病毒主要抗原决定簇VP1区段基因，将目的基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上，IPTG诱导表达融合蛋白，产物经亲和层析初步纯化，以Western-Blot进行鉴定，并包被ELISA板，对临床血清进行检测。结果：pGEX-4T-2-VP1可在大肠杆菌中高效表达，表达产物经纯化后可得单一目的蛋白条带。ELISA结果表明，其灵敏度、特异度等指标与德国Virion试剂盒有较好的符合率。结论：该重组蛋白具有良好的抗原性，为研制和开发具有我国独立知识产权的B19病毒基因工程抗原ELISA诊断试剂盒提供了有价值的资料。     

人自身抗原SSA/Ro60的基因克隆和原核表达

目的:克隆并表达人自身抗原SSA/Ro60。方法:应用RT-PCR技术,从HL-60细胞株中克隆人自身抗原SSA/Ro60全长基因,将PCR产物直接TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21,阳性克隆鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行SDS-PAGE和Western blot。结果:PCR产物约为1.6 kb,与预期1614 bp接近,测序结果与Genebank报道的完全一致。pGEX-5T-SSA/Ro60重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示融合蛋白分子量为86 KD,具有天然人自身抗原SSA/Ro60的免疫原性。结论:成功克隆表达人自身抗原SSA/Ro60,为下一步工作奠定了基础。     

人可溶性gp 130(sgp 130)分子的克隆与表达

在成功克隆表达人膜型gp130分子的基础上，构建人可溶性gp130的重组表达质粒pKCR5／sgp130，并在CHO细胞中进行表达．经纯化鉴定和生物学检测，证实所表达的sgp130具有生物学活性．     

胺碘酮对家兔在体心脏心室复极及复极离散度影响的研究

为探讨胶碘酮抗心律失常的细胞电生理机制，采用同步记录心室外股不同部位单相动作电位的方法，观察健康家兔静注胶碘酮前后心室复极及复极离散度的变化。结果显示：胺碘酮对正常心肌可延长心室复极，但对其复极离散度则无显著影响。结论：胺碘酮能同步均一地延长心室复极，可以提高心电稳定性。     

细粒棘球蚴AgB亚单位抗原基因的克隆和表达系统的优化

目的从我国细粒棘球绦虫分离株（新疆源和甘肃源）中克隆AgB1和AgB2两个亚单位基因,并试用不同的表达载体对两个AgB亚单位基因的表达情况进行比较观察。方法设计特异性引物,扩增AgB1和AgB2亚单位抗原基因,分别用pET28a（＋）、pET32a（＋）和pGEX4T-13种表达载体构建重组质粒,对AgB亚单位基因在不同载体中的表达情况进行比较。结果从我国细粒棘球绦虫分离株中克隆的AgB1和AgB2抗原基因与GenBank中的序列比对,AgB1与德国人源、巴西羊源、意大利牛源均有一定的核苷酸和氨基酸差异;AgB2与乌拉圭羊源序列完全一致。在3种载体中表达重组蛋白的结果显示,不同载体和表达系统对重组表达蛋白的生物活性和可溶性有较大的影响。结论成功地克隆了细粒棘球蚴AgB亚单位基因,AgB1和AgB2基因在3种不同表达载体中的表达情况及对融合标签蛋白的血清基础反应性的比较分析表明,两个重组抗原在pET32a载体中的表达优于pET28a和pGEX4T-1载体。     

人脑源性神经营养因子成熟肽基因克隆及表达

目的构建表达人脑源性神经营养因子hBDNF的基因工程菌。方法人工合成1对含EcoRI和BamHI限制性酶切位点的特异引物，以人血白细胞基因组DNA为模板。应用PCR技术扩增hBDNF成熟肽基因。用A-T克隆法与pUCm-T载体连接后，再定向插入原核表达载体pBV220，将重组体pBV220．hBDNF转化大肠杆菌DH5a，经42℃热诱导表达。结果经限制性酶切和DNA测序证明重组入载体中的DNA片段确为hBDNF，并成功表达出hBDNF蛋白。结论该研究成功地克隆出hBDNF基因编码序列并在大肠杆菌中获得稳定表达，表达效率达25％，为今后生物学活性的研究和神经系统疾病的基因治疗奠定了基础。     

人B7-1/Sart3融合基因的克隆和表达

目的：构建人共刺激分子CD80(B7-1)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(Sart3)融合基因真核表达载体，并分别在原核和人成纤维细胞中表达。方法：采用RT-PCR技术，从人胎盘组织抽提的总RNA中克隆Sart3基因的部分cDNA序列(第1～1281bp)．此段序列包括已报道的能诱导HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞的抗原表位。然后将不含终止密码子的B7-1 cDNA和Sart3 cDNA共克隆入真核表达载体pEGFP-N1，测定核苷酸序列确定重组成功后，分别转染大肠杆菌和人成纤维细胞，利用流式细胞仪和Western blot检测B7和Sart3的表达。结果：构建人B7、Sart3融合基因真核表达载体B7sart3／pEGFPN。测序结果与GenBank的B7、Sart3相应序列(NM_005191、NM_014706)一致．阅读框无改变。流式细胞仪测定发现在转染的人成纤维细胞表面有明显的荧光增强．免疫印迹发现融合蛋白可以与抗B7抗体反应，融合蛋白分子量与B7-Sart3-EGFP的预测分子量相当。结论：成功构建真核表达载体B7Sart3／pEGFPN，并在人成纤维细胞中表达。为下一步研究将SART3蛋白作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的生物治疗打下基础。     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用ＰＣＲ方法以分泌纳豆激酶的纳豆杆菌染色体ＤＮＡ为模板扩增纳豆激酶基因,将该基因克隆到质粒载体ＰＵＣ１９上,筛选重组子,通过限制性内切酶和ＰＣＲ技术分析初步确定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因。利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达,凝块溶解时间法（ＣＬＴ）测出表达产物具有溶解血栓性。在确定了最佳培养时间与诱导时间后,ＳＤＳＰＡＧＥ分析结果表明基因表达产物为分泌     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫微线体蛋白MIC3基因。方法 从弓形虫RH株分离总的RNA,反转成cDNA.根据MIC3基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫cDNA中扩增MIC3基因片段,插入pGEM-T载体,并转化大肠杆菌Top10,经PCR、双酶切、测序验证后,将MIC3基因片段定向亚克隆到载体pET-28a中构建原核表达重组质粒pET-28a-MIC3,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果 从弓形虫RH株cDNA中扩增出792bp大小的MIC3基因片段并诱导表达27 300 Mr的重组MIC3蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pET-28a-MIC3重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究莫定了基础。     

HIV-1 Tat真核表达载体的构建及在内皮细胞的表达

目的:构建HIV-1 Tat真核表达质粒,为研究Tat在HIV-1致病机制中的作用奠定实验基础。方法:以pCV1(tat and rev)质粒为模板,用PCR方法扩增HIV-1 Tat基因,克隆至p cDNA3.1( )表达载体,酶切及测序鉴定重组体。重组质粒转染ECV304细胞,用RT-PCR、转染HIV-1 LTR荧光报告基因的方法检测tat基因的表达及活性。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建pcDNA3.1( )-Tat重组质粒。重组体转染ECV304细胞,建立稳定表达细胞株,应用RT-PCR可检测到Tat基因mRNA的表达;荧光仪检测Tat蛋白可明显促进荧光素酶在ECV304细胞内的表达。结论:成功构建HIV-1Tat真核表达载体,并建立了HIV-1 Tat内皮细胞稳定表达细胞株。     

大肠杆菌caiE基因的克隆与高效表达

用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因cai E,将其克隆到克隆载体pBluescripy SK中，测序表明：该基因有612bp，与文献报道相比，有10个核苷酸不同，相应的翻译氨基酸有6个相异，将该基因重组到ColE1为复制子，T7为启动子控制下的分泌型表达载体pET-22b( )中，构建表达质粒pETCaiE，重组到载体pACYC184中构建以p15A为复制子，Lac为启动子的表达质粒pACYC-CaiE；重组到载体pWSK129中，构建以pSC101为复制子，T7为启动子的表达质粒pSC-CaiE。上述表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）诱导后，均可表达，SDS－PAGE分析表明表达蛋白分子质量约26ku，表达量占菌体总蛋白质的比例分别为pETCaiE30%,pACYC-CaiE8%,pSC-CaiE5%。