短发卡RNA介导的表皮生长因子受体基因沉默对舌鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的影响

目的 研究短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)介导的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因沉默对舌鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响,为治疗舌鳞状细胞癌提供依据.方法 构建靶向人EGFR的shRNA真核表达载体并瞬时转染人舌鳞状细胞癌细胞株Tca8113细胞,用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法检测转染前后EGFR的mRNA和蛋白的变化,用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞增殖活性,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 转染后Tca8113细胞的EGFR mRNA和蛋白的表达(0.217±0.047)和(0.324±0.059)均明显下调(P＜0.05),细胞增殖活性(0.340±0.009)明显降低(P＜0.05),细胞凋亡率(39.4±7.7)%显著增高(P＜0.05).结论 shRNA介导的EGFR基因沉默可抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖并诱导其凋亡.     

Fas基因转染对舌鳞癌细胞系Tca8113凋亡的影响

目的探讨外源性Fas基因介导舌鳞癌细胞凋亡的可行性及其可能的分子机制。方法脂质体法将重组人Fas真核表达载体转染人舌鳞癌细胞系Tca8113，抗Fas单克隆抗体诱导其凋亡，Western blotting检测转染前后Tca8113细胞Fas蛋白表达水平，TUNEL法检测转染前后细胞凋亡水平。结果转染后Tca8113细胞Fas蛋白表达上调；抗Fas单克隆抗体可诱导Tca8113细胞凋亡，凋亡指数升高。结论上调Fas基因表达及应用抗Fas单克隆抗体可诱导肿瘤细胞凋亡，有可能作为肿瘤基因治疗的新途径。     

Survivin基因在顺铂诱导Tca8113舌鳞癌细胞凋亡中的作用

目的体外观察顺铂（DDP）诱导Tca8113舌鳞癌细胞株凋亡的作用, 同时检测在此过程中凋亡蛋白抑制因子Survivin mRNA表达和蛋白表达的变化。方法将人Tca8113舌鳞癌细胞株进行传代培养,MTT法检测顺铂不同浓度和不同时间对Tca8113舌鳞癌细胞生长的抑制作用,通过RT- PCR检测凋亡过程中Survivin基因mRNA的表达,免疫细胞化学观察Survivin基因的蛋白表达,以及流式细胞术观察顺铂诱导各组Tca8113细胞的凋亡率。结果顺铂可明显抑制Tca8113舌鳞癌细胞的增殖, 其增殖抑制率呈浓度和时间依赖性,细胞凋亡率也呈同样的趋势,最高可达34.1%。1.0 μg/mL DDP处理Tca8113舌鳞癌细胞,Survivin mRNA和蛋白表达水平随时间的增加而降低,在24h达到最低,随后又升高。结论抗凋亡蛋白Survivin在Tca8113舌鳞癌细胞高表达,顺铂可有效诱导Tca8113舌鳞癌细胞凋亡, Survivin mRNA表达在化疗早期随作用时间的延长而降低,Survivin基因的抑制在顺铂诱导的Tca8113舌鳞癌细胞的细胞凋亡中起着重要的作用。     

EGFR 抑制剂对舌鳞癌多药耐药细胞 Tca8113／CBP耐药蛋白的影响

目的：探讨表皮生长因子受体（ EGFR）抑制剂在舌鳞癌多药耐药中的作用。方法：免疫细胞化学技术和Western blot方法检测舌癌细胞系Tca8113及多药耐药细胞系Tca8113／CBP EGFR的表达,Western blot检测EGFR受到抑制后舌癌多药耐药细胞Tca8113／CBP耐药蛋白MRP,GTS-π的表达。结果：细胞系Tca8113和Tca8113／CBP均有EGFR的表达（P＞0．05）,EGFR受到抑制后细胞Tca8113／CBP的多药耐药蛋白MRP,GST-π的表达均下降（P＜0．05）。结论：抑制EGFR可下调舌癌多药耐药细胞耐药蛋白的表达。     

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目的    探讨姜黄素对人口腔鳞癌细胞的增殖抑制作用及作用机制。方法    2009年3—12月于青岛大学医学院选用人舌鳞癌细胞系Tca8113及其脑转移亚系Tb为研究对象,分别用6.25、12.5、25、50 μmol／L姜黄素处理,阴性对照仅加入RPMI1640培养液,用MTT法测定细胞增殖抑制率;以免疫细胞化学方法检测25 μmol／L姜黄素处理后细胞内β-连环蛋白和Notch1的表达。结果    姜黄素对口腔鳞癌细胞Tca8113及Tb增殖有明显抑制作用,并呈剂量依赖性。免疫细胞化学检测结果表明,25 μmol／L姜黄素作用口腔鳞癌细胞系Tca8113及Tb 24 h后即可明显下调β-连环蛋白的表达水平（P < 0.05）,上调Notch1表达水平（P < 0.05）。结论    姜黄素对人口腔鳞癌细胞系Tca8113及Tb的增殖具有抑制作用,其作用机制可能与细胞内β-连环蛋白表达水平下调和Notch1表达水平上调有关。     

SPHK1在舌鳞癌中的表达及其表达下调对Tca8113细胞迁移能力的影响

目的:研究鞘氨醇激酶1(SPHK1)在舌鳞癌组织中的表达及其表达下调对Tca8113细胞迁移的影响。方法:采用免疫组织化学检测45例舌鳞癌组织、36例癌旁异常增生组织和45例正常舌上皮组织中SPHK1蛋白的表达。利用脂质体2000将SPHK1 siRNA和对照siRNA分别转染Tca8113细胞,Western blotting检测细胞中SPHK1蛋白的表达;分别采用CCK-8和Boyden小室检测细胞增殖和细胞迁移能力的变化;用Western blotting检测细胞迁移相关蛋白MMP-2和MMP-9表达的变化。结果:舌鳞癌组织中SPHK1蛋白的表达显著高于癌旁异常增生组织和正常舌上皮组织(χ2=55.608,P=0.000)。SPHK1 siR-NA能显著下调Tca8113细胞中SPHK1蛋白的表达,其表达下调能明显抑制舌鳞癌细胞的增殖和降低细胞的迁移能力。SPHK1表达的下调能明显降低舌鳞癌细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达。结论:SPHK1的过表达可能在舌鳞癌的发生发展过程中发挥重要作用,其表达下调介导的舌鳞癌细胞迁移能力的降低可能与MMP-2和MMP-9的下调密切相关。     

Tea8113舌癌细胞转染骨形成蛋白-Ⅱ型突变受体前后细胞周期相关因子表达的定量分析

目的 明确转染骨形成蛋白（BMP）-Ⅱ型突变受体对Tca8113舌癌细胞的作用，以进一步探讨BMPs对口腔上皮恶变的作用机制。方法 检测转染BMP-Ⅱ型突变受体的Tca8113舌癌细胞（Tca8113ZR细胞）和Tca8113细胞的细胞周期相关因子Cyclind1、CDK-4、p27和p57的表达。结果 转染了BMP-Ⅱ型突变受体后，肿瘤细胞的增殖能力显著减弱。结论 BMPs信号在口腔舌癌细胞的恶性变化中起着重要的调控作用，BMPs信号的改变可能导致细胞恶性程度的改变。     

LncRNA FOXCUT在口腔鳞状细胞癌中的表达及功能研究

目的：分析LncRNA( long non-coding RNA,LncRNA) FOXCUT基因在口腔鳞状细胞癌中的表达及功能,探讨口腔鳞癌分子标志物及靶基因。方法采用实时定量荧光聚合酶链反应检测23例鳞状细胞组织及口腔鳞癌细胞Tca8113和SCC-9中FOXCUT的表达,然后采用MTS(细胞增殖实验)单细胞克隆及细胞划痕等细胞功能实验检测FOXCUT基因下调以后在口腔鳞癌细胞Tca8113中的功能。结果 LncRNA FOXCUT在23例口腔鳞癌有21例高表达,在Tca8113和SCC-9细胞中表达均高于人正常黏膜HOK细胞中的表达。当Tca8113细胞转染FOXCUT siRNAs后,FOXCUT的表达降低了,在体外口腔鳞癌Tca8113细胞功能实验中,FOXCUT表达下调后抑制细胞增殖和细胞迁移能力。结论 LncRNAFOXCUT可能与口腔鳞癌的发生发展相关,可能成为口腔鳞癌潜在的新型生物标志物及治疗靶标。     

β-catenin表达下调对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞周期、细胞凋亡和细胞迁移的影响

目的：探讨β-catenin表达下调对Tca8113细胞增殖、周期、凋亡和迁移的影响。方法：用脂质体2000将β-catenin siRNA转染舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,Western blotting技术检测转染后Tca8113细胞中β-catenin蛋白的表达,CCK-8试剂分析转染后对细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测下调β-catenin表达对Tca8113细胞周期及细胞凋亡的影响;Boyden chamber实验分析β-catenin表达下调对Tca8113细胞迁移能力的影响。结果：β-catenin siRNA能明显下调Tca8113细胞中β-catenin蛋白的表达,显著抑制Tca8113细胞的增殖。β-catenin siRNA组中的G0/G1期的细胞百分比明显高于未处理组和对照siRNA组。此外,β-catenin siRNA组中细胞凋亡的比率明显高于未处理组和对照siRNA组,其凋亡变化与caspase-3和bax蛋白表达的上调和bcl-2表达的下降密切相关。与未处理组和对照siRNA组相比,β-catenin siRNA组中Tca8113细胞的迁移能力显著下降,组间具有统计学意义。结论：β-catenin在舌鳞状细胞癌的发生发展中可能具有重要的作用。     

EGFR抑制剂西妥昔对舌鳞癌多药耐药细胞Tca8113/CBP细胞内阿霉素浓度的影响

目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂西妥昔在舌鳞癌多药耐药中的作用.方法 Westernblot方法检测舌癌细胞系Tca8113及多药耐药细胞系Tca8113/CBP EGFR的表达,流式细胞术检测EGFR受到抑制后舌癌多药耐药细胞Tca8113/CBP细胞内阿霉素浓度的影响.结果 细胞系Tca8113和Tca8113/CBP均有EGFR的表达(P＞0.05).EGFR受到抑制后,Tca8113/CBP细胞内阿霉素浓度升高(P＜0.05).结论 EGFR抑制剂西妥昔可使舌癌多药耐药细胞细胞内药物浓度升高.     

p27kip1基因转染及其对人舌癌细胞增殖的影响

目的:探讨人p27kip1基因对人舌鳞状细胞癌细胞增殖的影响。方法:从正常组织中克隆人p27kip1基因连接至pcDNA3真核表达载体上,应用脂质体将重组质粒转染舌癌Tca8113细胞,观察外源目的基因在靶细胞中的整合及表达、细胞的生长情况及细胞周期的变化。结果:成功克隆p27kip1cDNA并构建真核表达载体,将其导入Tca8113细胞中,经G418筛选得到稳定表达p27kip1基因的细胞株,其细胞的生长受到抑制,增殖下降。G0/G1期细胞百分数由34.973%增至66.064%,细胞出现了凋亡。结论:克隆并在体外转染Tca8113细胞获得了p27kip1的高表达,抑制舌癌细胞由G1期向S期过渡从而抑制了细胞增殖。     

Downregulation of Notch1 and its potential correlation with epidermal growth factor receptor signalling in tongue squamous cell carcinoma

We investigated the expression of Notch1 in human oral squamous cell carcinoma (SCC) and explored its potential correlation with epidermal growth factor receptor (EGFR) signalling in oral SCC. Paraffin sections of primary SCC of the tongue and normal mucosa were screened immunohistochemically for Notch1 and EGFR proteins. Human SCC of the tongue Tca8113 cells were treated with AG1478 to block EGFR signalling, and were transfected with the vector that encodes the specific short hairpin RNA (shRNA) that targets EGFR. In SCC of the tongue expression of Notch1 was cancelled except in sites of squamous metaplasia where it was raised, while expression of EGFR was found in the peripheral cells of carcinomas, but not in sites of squamous metaplasia. In normal tongue mucosa, Notch1 was expressed mainly in the stratum corneum, but not in the stratum basale, while EGFR was expressed mainly in the stratum basale, but not in the stratum granulosum or stratum corneum. The blocking of EGFR signalling or the silencing of the EGFR gene resulted in upregulation of Notch1 at mRNA and protein levels in Tca8113 cells. These observations suggest that downregulation of Notch1 in oral SCC may be associated with upregulation of EGFR signalling.     

乳铁蛋白抑制舌癌细胞血管内皮生长因子表达的研究

目的探讨乳铁蛋白(lactoferrin)对舌癌细胞株Tca8113细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达调控的情况。方法采用四甲基氮唑蓝实验(MTT)、RT-PCR法检测乳铁蛋白对Tca8113细胞的增殖作用及VEGFmRNA表达改变的情况。结果乳铁蛋白显著抑制Tca8113细胞的增殖,呈剂量依赖性,乳铁蛋白对Tca8113细胞VEGF的RT-PCR产物试验组(2和3)与对照组之间比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论乳铁蛋白对Tca8113细胞的增殖有抑制作用,可以降低细胞中VEGFmRNA的表达水平,为乳铁蛋白用于肿瘤的预防及治疗提供实验基础。     

乏氧对人舌鳞癌细胞系Tca8113体外黏附和侵袭能力的影响

目的:研究乏氧及人乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因表达对舌鳞癌Tca8113细胞系黏附和侵袭能力的影响.方法:将化学合成的siRNA_(HIF-1α)转染入Tca8113细胞后进行常氧或乏氧(1% O_2)培养.实验设以下对照组:空白对照组、脂质体组及非特异性siRNA(siRNA_(Irr))组.采用real time-PCR和Western blot法测定细胞中HIF-1α mRNA表达和蛋白含量,并分别检测HIF-1α基因干扰前后细胞对细胞外基质(ECM)的黏附与侵袭力.结果: 乏氧能够诱导Tca8113细胞的黏附与侵袭力增加.乏氧培养条件下,HIF-1α的表达上调主要发生在蛋白水平.siRNA_(HIF-1α)转染后常氧或乏氧培养24 h, HIF-1α mRNA表达显著下调,与各对照组相比有统计学意义(P<0.01),Tca8113细胞内HIF-1α蛋白含量亦显著降低.无论在常氧还是乏氧培养条件下,siRNA_(HIF-1α)转染的Tca8113细胞黏附力与各对照组相比均显著降低(P<0.05或P<0.01);侵袭力也显著降低(P<0.01).乏氧条件下siRNAHIF-1α转染的Tca8113细胞黏附力和侵袭力下降程度高于常氧培养[(36.4±2.7)% vs (26±2.35);(44.2±2.2)% vs (35±1.75), P<0.01)].结论: 化学合成的靶向HIF-1α的siRNA能够下调Tca8113细胞中HIF-1α基因的表达,降低细胞对ECM的黏附和侵袭力,可能成为抑制肿瘤转移的基因治疗的新途径或新靶点.     

载体携带小干扰RNA抑制Tca8113细胞血管内皮生长因子的表达

目的了解小干扰RNA（siRNA）对人舌癌细胞株Tca8113血管内皮生长因子（VEGF）表达的抑制作用。方法构建2对针对血管内皮生长因子的siRNA真核表达载体（Pu-VEGF-siRNA1,Pu-VEGF-siRNA2）,经脂质体Lipofectamine2000转染Tca8113细胞,以空载体组作实验对照组,未转染组作空白对照组。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫组化、酶联免疫吸附（ELISA）方法分别检测转染后的Tca8113细胞VEGF mRNA及蛋白表达。结果与实验对照组和空白对照相比较,转染Pu-VEGF-siRNA1和Pu-VEGF-siRNA2后Tca8113细胞的VEGF mRNA 和蛋白表达明显下降。结论通过RNA干扰技术能有效抑制舌癌Tca8113细胞VEGF mRNA和蛋白的表达。     

神经钙黏素表达下调对舌鳞状细胞癌细胞生物学能力的影响

目的 研究神经钙黏素(N-cadherin)表达下调对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖、细胞周期、凋亡以及迁移的影响,并探讨其可能的分子机制.方法 利用LipofectamineTM2000将神经钙黏素siRNA转染舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,将细胞分为3组:①未处理组;②对照siRNA组;③神经钙黏素siRNA组.分别收集转染后48 h的细胞,采用新型的细胞计数试剂盒(cell counting kit,CCK)8试剂分析转染神经钙黏素siRNA后对细胞增殖能力的影响;运用流式细胞术检测下调神经钙黏素表达对Tca8113细胞周期及细胞凋亡的影响;采用Boyden 小室实验分析下调神经钙黏素对舌鳞状细胞癌细胞Tca8113细胞迁移能力的影响;进一步采用蛋白质印迹法检测神经钙黏素表达下调对细胞增殖、细胞周期以及细胞迁移相关基因表达的影响.结果 神经钙黏素siRNA能明显下调舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中神经钙黏素蛋白的表达,并显著抑制Tca8113细胞的增殖(P<0.05).细胞周期结果显示,神经钙黏素siRNA组中在G0/G1的细胞比率[(65.41±0.92)%]明显高于未处理组[(41.59±1.43)%]和对照siRNA组[(43.70±2.08)%],差异有统计学意义(F=216.839,P＝0.000).神经钙黏素siRNA组中细胞凋亡的比率[(25.66±1.36)%]明显高于未处理组[(2.38±0.14)%]和对照siRNA组[(2.81±0.12)%],差异有统计学意义(F=850.364,P=0.000).Boyden 小室体外侵袭实验结果表明,与未处理组和对照siRNA组相比,神经钙黏素siRNA组中Tca8113细胞的迁移能力显著下降,差异有统计学意义(F=140.858,P=0.000).蛋白质印迹法结果表明,与未处理组和对照siRNA组相比,神经钙黏素siRNA组中的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)2和MMP-9明显下调,而p21明显上调,且差异有统计学意义(P<0.05).结论 神经钙黏素在舌鳞状细胞癌的发生发展中可能具有重要的作用.

Abstract：

Objective To investigate the effect of downregulation of N-cadherin expression on cell proliferation, cell cycle, cell apoptosis and cell migration in tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113 cells. Methods N-cadherin siRNA was transfected into tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113 cells and Tca8113 cells were divided into three groups: untreated group, control siRNA group and N-cadherin siRNA group. The cells were harvested 48 h after transfection with N-cadherin siRNA. Cell proliferation of Tca8113 cells was examined by cell counting kit(CCK)-8 after transfection with N-cadherin, and the effects of downregulation of N-cadherin on cell cycle and cell apoptosis of Tca8113 cells were investigated by flow cytometry.The effect of downregulation of N-cadherin expression on cell migration of Tca8113 cells was observed by Boyden chamber experiment, and further expression changes of gene-related cell proliferation, cell cycle and cell migration were detected by Western blotting. Results N-cadherin siRNA downregulated the N-cadherin expression and significantly inhibited cell proliferation of Tca8113 cells (P<0.05). The results of cell cycle revealed that the percentage of G0/G1 phase in N-cadherin group [(65.41±0.92) %] was significantly higher than that in untreated group [(41.59±1.43)%] or control siRNA group [(43.70±2.08)%], and there was significant difference among the three groups (F=216.839,P＝0.000).The percentage of cell apoptosis in N-cadherin group [(25.66±1.36)%] was significantly higher than that in untreated group [(2.38±0.14)%] or control siRNA group [(2.81±0.12)%], and there was significant difference among the three groups (F=850.364,P=0.000). The cell number migrated into memebrane in N-cadherin group was significantly lower than that in untreated group and control siRNA group, and there was significant difference among the three groups (F=140.858,P=0.000). Further, compared with untreated group and control siRNA group, the expressions of matrix metalloproteinase(MMP)-2 and MMP-9 proteins were significantly downregulated and expression of p21 protein was significantly upregulated (P<0.05). Conclusions N-cadherin may play a role in occurrence and development of tongue squamous cell carcinoma.     

转人4-1-BBL口腔鳞状细胞癌体外诱导特异性抗肿瘤免疫的研究

目的 构建转染人口腔鳞状细胞癌细胞株4-1-BBL基因,探讨其体外诱导抗肿瘤免疫的能力.方法 通过脂质体法将重组载体pEGFP-4-1-BBL转染人口腔鳞状细胞癌细胞Tca8113,经G-418筛选及有限稀释后获得稳定高表达克隆,分别用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法检测转染细胞中人4-1-BBL mRNA和蛋白的表达.制备肿瘤细胞疫苗.用淋巴细胞分离液分离纯化人外周血T淋巴细胞,用抗CD-3单抗预处理T细胞后,与转染及未转染人4-1-BBL的Tca8113疫苗混合培养.用CCK-8比色法检测细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)的杀伤活性;锥虫蓝计数法检测T细胞增殖,酶联免疫吸附实验检测培养上清液中自细胞介素(IL)-2、干扰素γ分泌水平.结果 转基因Tca8113细胞能够稳定高表达人4-1-BBL.与野生型的Tca8113细胞相比较,转染人4-1-BBL的Tca8113细胞PCR扩增产物的大小约271 bp,能够显著增强T细胞增殖,促进IL-2、干扰素γ分泌,并能有效地诱导CTL产生对Tca8113细胞的特异性杀伤作用.结论 转染4-1-BBL基因既能增强野生型Tca8113细胞的免疫原性,也能诱导T细胞产生有效的抗肿瘤免疫应答.