载肝细胞生长因子的纳米粒子治疗急性肝衰竭大鼠

目的 观察载肝细胞生长因子(HGF)的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖(PLA-O-CMC)纳米粒子培养的大鼠肝细胞腹腔内移植对急性肝衰竭(ALF)大鼠的治疗效果.方法 分别将5 ml培养24 h的大鼠肝细胞(5.0×107个)(Ⅰ组)、PLA-O-CMC纳米粒子培养的大鼠肝细胞(Ⅱ组)、载HGF的PLA-O-CMC纳米粒子培养的大鼠肝细胞(Ⅲ组)移植到ALF大鼠腹腔内,以PLA-O-CMC纳米粒子培养的大鼠肝细胞腹腔移植加每天静脉注射HGF 10 μg/kg×7 d(Ⅳ组)和5 ml RPMI 1640培养基腹腔内注射(Ⅴ组)作为对照.观察受体大鼠存活率、肝功能、肝组织光镜和电镜变化.结果 移植后14d大鼠的存活率Ⅰ～Ⅴ组分别为50.00％、68.75％、81.25％、75.00％和18.75％,各移植组高于对照组,Ⅲ组最高.移植后24 h,Ⅱ～Ⅳ组各项肝功能指标开始好转,至移植后7d,各组间除谷丙转氨酶(ALT)外,差异无统计学意义(P＞0.05).Ⅲ组的肝功能和肝脏病理损害恢复最快,其次为Ⅳ、Ⅱ、Ⅰ组,Ⅴ组恢复最慢、最差.结论 应用载HGF的PLA-O-CMC纳米粒子培养的大鼠肝细胞腹腔内移植治疗ALF大鼠能逆转肝功能,提高生存率,较静脉途径给予HGF的治疗效果更好.     

骨髓间充质干细胞联合肝细胞生长因子基因治疗兔肢体缺血

目的探讨联合应用骨髓间充质干细胞(BMSC)和肝细胞生长因子(HGF)基因治疗兔肢体缺血的疗效。方法 32只新西兰兔切除右后肢股浅动脉并结扎股深动脉建立后肢缺血模型,成模后随机均分为空腺病毒对照组(对照组),BMSC细胞治疗组(BMSC组),HGF基因治疗组(HGF组)和联合治疗组(BMSC+HGF组),各组均采用术肢肌肉内原位注射。治疗28 d后通过动脉造影行侧枝血管计数,治疗30 d后用免疫组化和Western blot法检测注射点周围组织中CD31和HGF的表达。结果 BMSC组及HGF组的侧支血管计数与对照组间差异无统计学意义,而BMSC+HGF组侧支血管计数较其余各组明显增加(P<0.05或P<0.01);免疫组化显示,各处理组CD31表达量明显高于对照组(P<0.05或P<0.01),BMSC组和HGF组间CD31表达量无明显差异(P>0.05),但两者均明显低于BMSC+HGF组(均P<0.05);Western blot显示,各处理组HGF表达量均高于对照组(P<0.05或P<0.01),且HGF在BMSC组、HGF组和BMSC+HGF组中的表达量依次增高,差异均有统计学意义(均P<0.05)...     

人外周血单个核细胞分泌细胞因子对α-1，3-半乳糖基转移酶基因敲除猪肝细胞的作用

目的研究异种肝细胞或肝移植中，活化的人外周血单个核细胞(h-PBMC)分泌的细胞因子对α-1，3-半乳糖基转移酶基因敲除猪肝细胞(GalT-KO-hep)的作用。 方法利用永生化GalT-KO-hep，与经脂多糖＋聚肌胞苷酸激活的h-PBMC共培养。生化分析检测共培养上清中白蛋白、ALT、AST和尿素水平，采用流式细胞术检测GalT-KO-hep凋亡，采用蛋白质印迹法检测GalT-KO-hep中Caspase-3剪切体表达以及c-Jun氨基末端激酶(JNK)、核因子κB(NF-κB)、P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、信号传导与活化转录因子3(STAT3)和蛋白激酶B(AKT)通路相关分子的表达变化。采用方差分析比较不同刺激时间h-PBMC分泌的细胞因子mRNA相对表达量、共培养模型不同时间点上清液生化指标含量、GalT-KO-hep中Caspase 3剪切体表达量和细胞凋亡率，进一步两两比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。 结果GalT-KO-hep与活化h-PBMC共培养6 h组上清液中ALT含量高于共培养24 h和48 h组，差异均有统计学意义(P均<0.05)；共培养48 h组AST含量高于共培养6 h和24 h组(P均<0.05)；共培养24 h和48 h组尿素含量均高于共培养6 h组(P均<0.05)。GalT-KO-hep与活化h-PBMC共培养24 h和48 h后，细胞中Caspase 3剪切体表达增加，细胞凋亡程度逐渐增加。与活化h-PBMC共培养0.5、1、6和12 h后，GalT-KO-hep磷酸化蛋白p-STAT3、p-JNK、p-IκBα、p-P38 MAPK、p-AKT和p-ERK(1/2)均被不同程度激活。 结论h-PBMC释放的细胞因子可诱导GalT-KO-hep损伤和凋亡，并促进炎症相关分子通路的激活。     

肝细胞生长因子及其受体在常染色体显性多囊肾病囊肿衬里上皮细胞的表达研究

目的 研究常染色体显性多囊肾病(ADPKD)囊肿衬里上皮细胞中肝细胞生长因子(HGF)及其受体c-MET的分布。方法 采用酶联免疫(ELISA)法测定ADPKD患者囊肿液、血清和原代培养ADPKD囊肿衬里上皮细胞上清液中HGF浓度。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、原位杂交、Western印迹、免疫组织化学及计算机图像定量分析 HGF、c-MET mRNA和蛋白在囊肿衬里上皮细胞的表达。结果 ADPKD未透析患者囊液中HGF浓度为(8.61±0.07)ng/ml,显著高于血清HGF浓度(0.26±0.05)ng/ml(P<0.01)。原代培养的囊肿衬里上皮细胞上清液中也检测到HGF,浓度为(1.43±0.01)ng/ml。体外培养的ADPKD囊肿衬里上皮细胞中c-MET mRNA含量(75.69±12.36)与HGF mRNA含量(79.89±11.58)呈正相关(r=0.54,P<0.01)。ADPKD囊肿组织中囊肿衬里上皮细胞c-MET mRNA含量(114.75±36.24)与HGF mRNA含量(136.48±39.69)呈正相关(r=0.50,P<0.01)。ADPKD囊肿组织中囊肿衬里上皮细胞c-MET蛋白含量(101.68±21.06)与HGF蛋白含量(125.03±19.34)、培养的囊肿衬里上皮细胞c-MET蛋白含量(11.60±1.83)与HGF蛋白含量(18.46±1.71)均呈正相关(r=0.51,P<0.05;r=0.67,P<0.01)。结论 ADPKD囊肿衬里上皮细胞可合成和分泌HGF。HGF可调节囊肿衬里上皮细胞表达c-MET。     

黄芪甲苷对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用

目的:旨在探究黄芪甲苷(ASI)对高糖诱导的人肾小管上皮细胞损伤的抑制作用,并阐明其机制。方法:体外培养人肾小管上皮细胞,进行分组:正常对照组:低糖(葡萄糖浓度5.5mmol/L)环境下培养;高糖组:高糖(葡萄糖浓度25mmol/L)环境下培养;ASI各组:分别在高糖培养基内加入不同浓度ASI(包括25、50、100、200μg/ml),在处理后0、1、12、24、48、96h观察,采用TUNEL法和caspase3检测各组细胞凋亡情况,采用ELISA法检测TGF-β1和HGF蛋白含量,采用Western blot检测磷酸化p-38、磷酸化ERK和磷酸化JNK浓度。此外,另在同样高糖培养基内加入p38抑制剂SB202190,1、12、24h观察细胞凋亡情况。最后,取同样高糖环境培养细胞,依次加入HGF50、100、200μg/ml,24h后检测细胞内磷酸化p38蛋白水平。结果:ASI(25～200μg/ml)可抑制高糖诱导的人肾小管上皮细胞凋亡,其抑制作用呈现剂量依赖性与时间依赖性。ASI同样可抑制高糖诱导的TGF-β1蛋白表达和p38MAPK信号通路活性。此外ASI可提高肾小管上皮细胞内HGF浓度;HGF可对p38MAPK信号通路产生抑制作用。结论:ASI抑制高糖诱导的人肾小管上皮细胞凋亡,其机制可能与ASI促进HGF分泌,阻断p38MAPK信号通路,进而抑制细胞凋亡以及TGF-β1的表达有关。ASI可能有助于糖尿病肾病的治疗。     

炎性细胞因子对大鼠肝细胞胆汁酸分泌的影响

目的探讨炎性细胞因子对肝脏胆汁酸分泌机制的影响.方法利用体外原代培养大鼠肝细胞、枯否细胞(Kupffer cell,KC)的方法和反向高效液相色谱(RP-HPLC)技术,观察部分炎性细胞因子(IL-I、IL6、TNFa)以及被内毒素(LPS)活化的KC上清液对肝细胞胆汁酸分泌的影响.结果(1)炎性细胞因子和活化的KC上清液刺激后,肝细胞培养上清液中GCDCA、GCA和TGA三种结合胆汁酸含量均较对照组明显降低(P＜0.01);(2)实验组(GCA±GDCA)/TGA(G/T)的比值较对照组G/T的比值明显升高(P＜0.05).结论炎性细胞因子可以改变大鼠肝细胞胆汁酸的分泌机制,导致胆汁酸分泌含量的减低,并引起胆汁酸比例的变化.     

肝星状细胞对大鼠肝部分切除术后肝再生修复的影响

目的 探讨肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）在大鼠肝部分切除术后对肝损伤修复的影响.方法 体外实验部分：将大鼠肝星状细胞（HSCs）与大鼠肝细胞系（BRL-3A）共培养,CCK-8比色法检测细胞增殖情况;ELISA法检测培养肝星状细胞上清液中细胞因子,即肝细胞生长因子（hepatic growth factor,HGF）、胰岛素样生长因子（insulin growth factor,IGF）、表皮细胞生长因子（epidermal growth factor,EGF）、转化生长因子-α（transfactor growth factor-α,TGF-α）含量.体内实验部分;将45只260 ～330 g健康雄性SD大鼠随机分为三组：正常组（生理盐水组）、对照组（肝星状细胞培养液组）、实验组（肝星状细胞培养上清液组）.各组分别于肝大部切除术后第3、7、12天取血清检测肝功能情况并计算肝再生指数;HE染色切片显微镜下观察肝脏病理结构改变情况;免疫组织化学染色法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nucleus antigen,PCNA）、平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、甲胎蛋白（a1pha feta1 protein,AFP）及白蛋白（albumin,ALB）的表达情况.结果 ①CCK-8法检测肝星状细胞能促进肝细胞增殖（P＜0.05）;②上清液较培养液中细胞因子HGF、TGF-α含量多,差别有统计学意义（P＜ 0.05）;③实验组肝再生指数比对照组大,差别具有统计学意义（P＜0.05）;④实验组大鼠AST随着时间的推移,较对照组下降明显,差别有统计学意义（P＜0.05）;⑤实验组PCNA表达量较正常组、对照组增多,差别有统计学意义（P＜ 0.05）;⑥平滑肌肌动蛋白、白蛋白、甲胎蛋白三组间差别不显著（P＞ 0.05）.结论 ①体外肝星状细胞能促进肝细胞增殖;②肝星状细胞培养上清液能促进大鼠肝部分切除术后肝再生,其分泌的多种细胞因子在肝损伤再生修复中起了重要作用.     

人骨髓基质干细胞向肝细胞分化过程中白蛋白的表达研究

目的观察在体外诱导人骨髓基质干细胞向肝细胞分化过程中自蛋白的表达特征。方法从手术切除弃置的人肋骨骨髓中分离基质细胞,在含有肝细胞生长因子(HGF)、淋巴细胞抑制因子(UF)、纤维母细胞生长因子(FGF)等条件培养基中培养细胞。应用免疫荧光方法在共聚焦显微镜下观察肝细胞特异性白蛋白染色;同时,于诱导培养后多时间点测定培养细胞产生的白蛋白水平。结果人骨髓来源的基质干细胞在条件培养基中经诱导后,分化为成熟附壁细胞;细胞胞浆内肝细胞特异性标志物白蛋白呈阳性染色;已分化细胞合成并分泌白蛋白,其表达水平随细胞分化显示时间依赖性变化特征。结论人骨髓基质干细胞经诱导培养后可向成熟肝细胞分化并具有合成和分泌白蛋白功能,可以作为临床肝细胞移植及生物人工肝等治疗终末期肝病的重要肝细胞来源。     

肝细胞生长因子对人肾小管上皮细胞转分化抑制作用初步研究

目的：晚近研究提示肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF)具有减轻实验性肾间质纤维化的作用，但其机制尚不十分清楚；本研究目的在于探讨HGF对人肾小管上皮细胞（HKC）转分化的作用。方法：将体外培养的HKC细胞分为：（1）无血清培养对照组；（2）阳性对照组（MCP－1＋AAⅠ）；（3）HGF组（HGF浓度为0.01,0.1,1.0,10.0ng/ml);(4)MCP-1 AAⅠ HGF组（HGF浓度0.1,1.0,10.0ng/ml)。应用间接免疫荧光法检测HKC细胞内α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白、角蛋白表达的变化。应用流式细胞技术检测α-SMA（＋）的HKC细胞百分数。结果：不同浓度HGF分别作用于HKC细胞48h后，经间接免疫荧光法测定该组HKC细胞角蛋白、波形蛋白及α－SMA抗原表达,与无血清对照组均无显著差异；流式细胞术测得HGF组α-SMA表达阳性HKC细胞百分数，与无血清对照组（平均为3.1%)也无显著差异（P＞0.05)。MCP－1＋AAⅠ培养HKC48h后α－SMA（＋）的HKC细胞平均百分数为85.6%。MCP－1＋AAⅠ＋HGF（0.1,1.0,10.0ng/ml)培养HKC48h后，α－SMA（＋）的HKC细胞百分数分别为26.7%，2.0%,13.6%，比阳性对照组明显下降（P＜0.05)。结论：（1）HGF对正常HKC细胞分化无明显影响；（2）HGF对某些因素诱导下发生的增强的HKC细胞转化可能具有显著抑制作用。     

特异性阻断Shh信号通路对肝细胞癌细胞系Hep-3B增殖和凋亡的影响

目的 观察阻抑胚胎发育相关信号通路Sonic hedgehog(Shh)对人肝癌细胞系Hep-3B增殖和凋亡的影响.方法 将实验细胞分为转染组、隐性对照组和空白对照组.设计针对Shh信号通路中Smo基因的siRNA,通过Lipedectemin2000将其转染进Hep-3B细胞株,噻唑蓝(Mar)比色法检测沉默Smo基因后第0、8、16、24和48 h的细胞数和MTr的D(入)值;流式细胞术检测沉默Smo基因48 h细胞凋亡.结果 转染组与空白对照组比较,加入siRNA后,8 h时细胞增殖数无明显减少,16、24和48 h时细胞数明显减少(P<0.01),24和48 h时细胞存活率差异有统计学意义.阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);Hep-3B细胞经siRNA作用48 h后,可见亚二倍体核型峰-凋亡峰.其中,转染组凋亡率为30%,阴性对照组与空白对照组未见凋亡峰.结论 Shh信号分子对肝细胞癌的增殖起维持作用;通过特异性阻断该信号通路,可以抑制肝癌细胞增殖,并促进细胞凋亡.     

急性肝衰竭大鼠载肝细胞生长因子纳米粒子肝细胞移植后有丝分裂指数和Ki-67表达变化及意义

目的 探讨急性肝衰竭(ALF)大鼠载肝细胞生长因子(HGF)的聚乳酸-氧-羧甲基壳聚糖(PLA-O-CMC)纳米粒子肝细胞移植后有丝分裂指数和Ki-67抗原的表达变化及意义.方法 D-氨基半乳糖腹腔内注射制作大鼠ALF模型,48 h后分别将Ⅰ型胶原(Ⅰ组)、PLA-O-CMC纳米粒子(Ⅱ、Ⅳ组)、载HGF的PLA-O-CMC纳米粒子(Ⅲ组)培养的大鼠肝细胞(均为5×107个,5 ml)移植到ALF大鼠腹腔内.以每日静脉注射HGF 10μg/kg×7 d(Ⅳ组)、5 Ml RPMI 1640腹腔内注射(Ⅴ组)作为对照.观察其14 d存活率、血清及肝组织HGF浓度、肝组织病理及有丝分裂指数(MI)、Ki-67变化.结果移植后14 d Ⅰ～Ⅴ组ALF大鼠的存活率分别为50.00％、68.75％、81.25％、75.00％、18.75％.各纳米移植组高于V组.Ⅲ组3 d时肝组织HGF浓度最高,平均为5882.91 μG／L.Ⅲ组肝组织结构恢复更快,5 d时平均MI 10.20％0、7 d时平均MI 10.20‰、7 d时Ki-67平均标记指数16.8‰,均高于Ⅴ组.结论 应用载HGF的PLA-O-CMC纳米粒子培养的大鼠肝细胞腹腔内移植治疗ALF大鼠能促进肝再生相关抗原表达.

Abstract：

Objective To evaluate the change and significance of Ki-67 antigen expression follow ing hepatocyte transplantation using hepatocyte growth factor (HGF) loaded polylactic acid-O-carboxymethylchitosan (PLA-O-CMC) nanoparticles in rats with acute liver failure (ALF). Methods ALF models of rats were established by D-galactosamine intraperitoneal injection. Rat hepatocytes type Ⅰ collagen suspension (group Ⅰ ),rat hepatocytes co-cultured with PLA-O-CMC nanoparticles ( groups Ⅱ ,Ⅳ ) and rat hepatocytes co-cultured with HGF loaded PLA-O-CMC nanoparticles ( group Ⅱ ) (5 × 107 cells each group,5 ml) were transplanted into the abdominal cavity of SD rats at 48 h after D-Gal injection. Intravenous injection of HGF ( 10 μg/kg for 7 days) ( group Ⅳ ) and RPMI 1640 injection (group Ⅴ ) were used as the negative groups. The 14th-day survival rate of rats,pathological change and mitotic index of liver,Ki-67 antigen labeling index of ALF rat livers were observed. Results The 14th-day survival rate in groups Ⅰ -Ⅴ was 50.00％,68. 75％,81.25％,75.00％,18.75％,and that in nano-transplanted groups was higher than in group Ⅴ. At the 3rd day,the concentration of HGF in liver tissue of group Ⅲ,average 5882. 91 μg/L was the highest. The hepatic lobules structure in group Ⅲ recovered faster. The average mitotic index in group Ⅱ at the 5th day was 10. 20‰ and the average Ki-67 labeling index at the 7th day was 16. 8‰,which were all higher than in group Ⅴ. Conclusion Intraperitoneal transplantation of HGF loaded PLA-O-CMC nanoparticle-attached hepatocytes for treatment of ALF can promote the liver regenerationassociated antigen expression.     

红细胞携氧促进多层平板型生物反应器中肝细胞氧供

目的 生物人工肝作为肝功能衰竭的一种有效支持手段,近年来得到不断的改进,如何解决反应器中的氧供问题成为目前人们研究的焦点.本研究拟通过在循环培养液中加入红细胞为这一问题提供可能的解决方案.方法 将新鲜分离的原代猪肝细胞接种于笔者自主构建的新型生物反应器内.实验分为两组,对照组在反应器内仅加入RPMI1640培养液直接循环;实验组在培养液中同时加入猪红细胞(2.5×1011/L)进行循环,两组循环液均经过膜肺进行氧合.采用血气分析仪检测反应器中氧耗情况,同时检测反应器中葡萄糖消耗及肝细胞的功能表达.结果 实验组反应器中肝细胞氧耗率为对照组的1.5倍,葡萄糖消耗为对照组的2倍.同时,实验组肝细胞的白蛋白分泌及尿素合成各项功能均明显高于对照组.结论 在培养液中加入红细胞能显著改善反应器中肝细胞的氧供,从而提高反应器中细胞的葡萄糖代谢及各种肝特异功能的表达.该方法简便易行,效果明显,有望成为解决反应器中氧供的有效手段.     

Effect of CXCR4-overexpressing bone marrow-derived mesenchymal stem cells on the repair of the co-cultured hypoxia/re-oxygenation renal tubular epithelial cells and its possible mechanism

Objective CXCR4-overexpressing bone marrow-derived mesenchymal stem cells (CXCR4-BMSC) were constructed and co-cultured with hypoxia/re-oxygenation pretreated renal tubular epithelial cells (HR-RTEC). Repair of HR-RTEC was detected and the possible mechanism was also discussed. Methods CXCR4-BMSC (CXCR4-BMSC/eGFP, eGFP as the tracer gene) and null-BMSC (BMSC/eGFP) were obtained by gene transfection technique, and the level of CXCR4 in the transfected cells was detected. RTEC was cultured under hypoxia/re-oxygenation condition for 12 h, respectively, to obtain HR-RTEC, which was used to simulate AKI in vitro. BMSC and HR-RTEC were co-cultured for 12 h, and the proportion of apoptotic cells among the HR-RTEC was assayed by immunofluorescence technique. Western blot was used to test the protein levels of cleaved Caspase-3 and Bcl-2. The number of migrating BMSC was also assayed. After culturing with the HR-RTEC culture supernatant, the expression of cytokeratin 18 (CK18) in BMSC was tested by immunofluorescence staining. Cytokines including bone morphogenetic protein-7 (BMP-7), hepatic growth factor (HGF) and interleukin-10 (IL-10) in the BMSC culture supernatant were detected by ELISA method. Results Expression of CXCR4 was enhanced in CXCR4-BMSC. Proportions of the apoptotic cells among HR-RTEC after being co-cultured with BMSC, CXCR4-BMSC and null-BMSC were all decreased, especially in the C/H group. The decreased cleaved Caspase-3 and enhanced Bcl-2 were also observed in HR-RTEC. The number of migrating CXCR4-BMSC was the highest. Proportions of CK18+ cells in BMSC, CXCR4-BMSC and null-BMSC were all low and showed no difference. However, CXCR4 overexpression in BMSC stimulated secretions of BMP-7, HGF and IL-10. Conclusions CXCR4-overexpressing BMSC has more repair effect on the co-cultured HR-RTEC, the enhanced migration ability and secretion ability of CXCR4-BMSC are the possible mechanisms.     

微囊化猪肝细胞培养的研究

目的　微囊包裹猪原代肝细胞并进行普通培养 ,观察肝细胞形态变化。方法　在不含小牛血清的RPMI 164 0培养基中培养 ,光镜下观察培养过程中肝细胞形态变化 ,检测不同时期培养上清中白蛋白及尿素含量。结果　微囊肝细胞可较长期存活 ,微囊肝细胞组与游离肝细胞组上清蛋白分泌在前 3d差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,4d后差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ,而上清尿素合成在前 2d差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,3d后差异有显著性 (P <0 .0 5 )。结论　微囊材料可制备微囊化猪原代肝细胞 ,并进行体外培养 ,与游离肝细胞比较具有更好分泌合成功能。     

细胞因子诱导小鼠骨髓间充质干细胞跨越分化肝细胞的研究

目的 探索骨髓问充质干细胞(MSCs)体外跨越分化为肝细胞的诱导体系.方法 从单核细胞中分离间充质干细胞,用添加20 ng/ml HGF、10 ng/ml FGF-4、10 ng/ml OSM和10%NBS的IMDM培养液诱导间充质干细胞向肝细胞分化.结果 经细胞因子诱导的细胞出现肝细胞样变化,随诱导时间延长体积逐渐增大、形态往上皮样转变,胞浆丰富,出现双核或多核细胞.RT-PCR和免疫荧光检测结果显示,AFP在诱导初期表达,在诱导后期表达下降;CKl8、ALB和TAT的表达与诱导时间呈线性关系.第20天达到表达高峰;诱导20 d后免疫荧光检测,AFP、CKl8、ALB和TAT均为阳性;诱导20 d细胞的PAS糖原合成反应呈阳性,即具备糖原合成和储存的肝细胞特有功能.结论 HGF、FGF-4和OSM三种细胞因子组合,可诱导小鼠间充质干细胞向肝细胞分化,该结果为间充质干细胞跨越分化肝细胞的分子机制探讨和临床应用打下了基础.     

肝细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外是否可定向诱导分化为肝细胞及其方法。方法采用梯度离心法,分离纯化SD大鼠的MSCs,流式细胞仪检测和碱性磷酸酶染色鉴定细胞类型。根据培养基中肝细胞生长因子(HGF)浓度不同,将MSCs分为4组进行诱导分化：A组0 ng／ml,B组10ng／ml,C组20ng／ml,D组40ng／ml。倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化。于培养的1,3,7,14,21,28 d,分别以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和细胞免疫组化检测各组细胞甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白18(CK18)和白蛋白的基因和蛋白表达。结果分离纯化的SD大鼠MSCs的表面标志为CD29^ ,CD44^ ,CD34^-,CD45^-和CD90^ ,细胞的碱性磷酸酶染色阴性,细胞纯度达98％以上。C组与D组的MSCs,于培养第7天出现AFP基因表达,第14天表达增强,第28天表达减弱;第14天始出现白蛋白、CK18基因表达,而后持续。B组和A组在培养过程中,未出现AFP、CK18和白蛋白的表达。C组与D组MSCs的AFP细胞免疫组化染色培养第7天即出现阳性,第14天白蛋白和CK18免疫组化染色阳性。A组和B组的MSCs的AFP、白蛋白和CK18的免疫组化染色均阴性。结论成年大鼠MSCs在较高浓度的HGF的诱导下,可分化为肝细胞。     

人脐带间充质干细胞分泌物对肝细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC MSC)旁分泌物质在体外对肝细胞再生和凋亡的影响.方法 利用Ⅳ型胶原酶和胰酶消化法从脐带中分离间充质干细胞,制备含有HUCMSC旁分泌物质的条件培养基(mesenchymal stem cells-conditioned medium,MSC-CM),采用低浓度胶原酶原位循环灌流法分离肝细胞.试验分为对照组、2%MSC-CM组和8%MSC-CM组三组.采用MTT比色法观察不同浓度MSC-CM对正常肝细胞增殖的影响.测定上清中尿素、白蛋白的含量,观察不同浓度MSC-CM对肝细胞功能的影响.利用放线菌素D和肿瘤坏死因子α诱导肝细胞凋亡,采用细胞活性分析试剂盒检测不同浓度MSC-CM对肝细胞凋亡的影响.结果 与对照组比较,2%MSC-CM组吸光度(A)540nm值(P＜0.01)以及上清尿素和白蛋白含量显著升高(P＜0.01),肝细胞存活率增加(P＜0.05);8%MSC-CM组与对照组无显著差异.结论 低浓度的MSC-CM在体外可以刺激正常肝细胞再生,抑制受损肝细胞凋亡,改善肝细胞功能.