荧光定量RT-PCR方法检测感染小鼠不同组织中的H5N1禽流感病毒

目的测定H5N1禽流感病毒感染小鼠各脏器组织中的病毒核酸含量,了解病毒复制与疾病进程的关系,为H5N1禽流感病毒致病机理与防治研究提供技术支持。方法利用建立的荧光定量RT-PCR法对H5N1禽流感病毒感染BALB/c小鼠的不同脏器组织中病毒核酸进行定量检测,观察H5N1禽流感病毒在不同组织中的复制情况。结果利用荧光定量RT-PCR法可从H5N1禽流感病毒感染小鼠后第3d的肺脏、脑、脾脏、肾脏和肝脏组织中检测到不同含量的病毒核酸;而在感染后4d的肺脏、脑和脾脏等组织中的病毒核酸含量开始下降;在感染后第6d,H5N1禽流感病毒核酸在肺脏和脑组织中大量存在外,其余组织中均有少量病毒核酸。结论H5N1流感病毒感染小鼠肺脏和脑组织中病毒核酸含量较高,说明病毒主要在小鼠的肺脏和脑组织中复制。由于荧光定量RT-PCR法可对感染小鼠不同脏器组织中的病毒核酸进行准确定量,可为H5N1禽流感病毒所致疾病的早期诊断、流行病学和致病机理研究提供技术支持。     

H5N1禽流感病毒感染孕鼠的研究

目的用H5N1禽流感病毒感染昆明孕鼠,检测病毒在感染孕鼠各组织脏器中的复制及分布情况,并证明病毒能否通过孕鼠的胎盘垂直传染给胎鼠。方法用虎源H5N1亚型禽流感病毒滴鼻感染妊娠10-12 d的昆明孕鼠,观察孕鼠感染后的临床症状。接种病毒后第3、4、5、6和7 d分别处死3只孕鼠,取孕鼠的肺、脑、脾、肾、子宫、胎盘及胎鼠,利用RT-PCR、Real-time PCR和病毒分离方法检测各组织中的病毒核酸和病毒滴度,并进行病理组织学与免疫组织化学检测。结果昆明孕鼠接种病毒后第3 d,即可在肺、脑、脾、肾、子宫及胎盘组织中检测出H5N1禽流感病毒核酸,并从子宫、胎盘分离出H5N1禽流感病毒;感染后第6 d,从胎鼠体内检测到病毒核酸并分离出H5N1禽流感病毒。结论H5N1亚型禽流感病毒可以感染孕鼠,在孕鼠子宫和胎盘复制,感染后期可通过胎盘屏障传给胎鼠。     

禽流感病毒感染小鼠模型病理损伤及抗原定位研究

目的通过建立高致病性禽流感H5N1病毒感染小鼠模型,研究病毒感染致小鼠组织病理损伤、病毒抗原在体内分布及复制特点,为禽流感病毒传播途径及致病机理研究提供实验依据。方法采用A/vietnam/1194/2004(H5N1)病毒株,滴鼻感染BALB/c小鼠,5 d后取小鼠肺、脑、脾、肠、心、肝、肾等组织,制备石蜡切片并进行组织病理损伤和抗原定位研究。结果小鼠肺组织表现为弥漫性肺损伤,脑组织出现轻度炎症反应,脾组织结构完整但脾小体可见凋亡细胞,其它脏器组织结构未查见组织病理损伤;利用M2、NS1单抗,采用免疫组织化学方法检测发现小鼠肺、脑、肠等均有M2、NS1抗原分布。结论高致病性H5N1病毒感染可在小鼠肺、脑、肠等多种组织中复制,引起严重的肺组织病理损伤及轻度的脑组织及脾组织病理损伤。     

实时RT-PCR法检测感染小鼠不同组织标本中的委内瑞拉马脑炎病毒

目的为委内瑞拉马脑炎病毒所致疾病的早期诊断和流行病学研究提供技术支持。方法建立了委内瑞拉马脑炎病毒特异、敏感和快速的实时RT-PCR法,并对委内瑞拉马脑炎病毒感染昆明小鼠的不同组织标本中的病毒载量进行了定量检测。结果本研究建立的实时RT-PCR法敏感(10TCID50/ml)、特异(对其它甲病毒成员,如东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒检测为阴性)。该方法可从委内瑞拉马脑炎病毒感染小鼠后第1d的血液、脾脏、脑组织中检测到不同含量的病毒核酸,而在感染后第3d仅从脾脏和脑组织中检测到病毒核酸。结论实时RT-PCR法不仅是一种敏感、准确的检测方法,可用来了解病毒感染量与疾病严重程度的关系和评价病毒病疫苗的免疫效果,而且也为VEEV疾病的临床诊断和流行病学监测提供工具。     

人禽流感死亡病例不同组织器官中H5N1病毒的检测分析

目的了解H5N1病毒在人禽流感死亡病例组织器官中的分布和含量。方法在BSL-3实验室，测定H5N1禽流感病毒分离株的TCID50，并采用荧光定量PCR制作标准曲线；将人禽流感死亡病例的尸解标本，包括心、肝、脾、肺、肾、脑等组织标本研磨处理后，进行荧光定量PCR检测，并根据标准曲线推算H5N1禽流感病毒的病毒载量。结果心、肝、肾、脑组织标本中H5N1禽流感病毒检测为阴性，在肺、脾组织标本中检测到H5N1病毒，病毒载量分别为10^6.3TCID50／ml和10^4.55TCID50／ml。结论除呼吸系统外，在脾组织中也存在H5N1禽流感病毒。     

河南省濮阳市一起人感染H5N6禽流感流行病学及病原学特征分析

目的 分析2022年3月河南省濮阳市首例人感染H5N6禽流感流行病学特征，探索感染来源，为防控人感染禽流感提供科学依据。方法 对人感染H5N6禽流感病例、密切接触者和涉禽外环境开展流行病学调查，采集病例和密切接触者的呼吸道标本、环境标本、禽类生物样本和禽类产品，运用实时荧光定量PCR方法检测禽流感病毒核酸。结果该病例肺泡灌洗液、咽拭子和鼻拭子样本均检出H5N6亚型禽流感病毒核酸，病例有宰杀禽类职业暴露史。1份屠宰厂的案板涂抹拭子检出H5N6亚型禽流感病毒核酸，9份鸭头类产品的口咽拭子检出H5亚型禽流感病毒核酸，确诊为人感染H5N6禽流感，为单个散发病例。结论 濮阳市首例人感染H5N6禽流感病例为单个散发病例，病原甲型H5N6亚型禽流感病毒可能来自宰杀的鸭子；应加强禽流感日常监测及健康科普。     

含H5N1禽流感病毒核酸序列的病毒样颗粒的制备及应用

目的构建耐RNase酶的内含禽流感病毒H5N1亚型部分核酸序列的病毒样颗粒。方法构建中间载体pET32a-MS2,将禽流感病毒H5N1亚型的HA、NA和M基因片断连接到中间载体上,构建原核表达载体pET32a-MS2-HA,pET32a-MS2-NA和pET32a-MS2-M,分别转化宿主菌,诱导表达制备病毒样颗粒。结果表达载体经PCR、酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。电镜观察到了病毒样颗粒,荧光定量RT-PCR试验表明颗粒稳定性良好。结论成功构建了含禽流感病毒H5N1部分核酸序列的病毒样颗粒且稳定性良好,可作为禽流感H5N1亚型RNA检测的标准品和质控品。     

鹅源H5N1禽流感病毒在感染雏鸡肾脏的分布及所致病理变化

目的研究鹅源H5N1亚型禽流感毒株人工感染雏鸡后,禽流感病毒在感染雏鸡肾脏内的分布及其所致的病理损伤变化。方法120只1d龄SPF雏鸡随机分为:对照组(C组)、7d龄和21d龄禽流感病毒感染组(Ⅰ、Ⅱ组)。I组和Ⅱ组雏鸡分别于7和21d龄时,分别经鼻、眼、口感染鹅源H5N1亚型禽流感病毒稀释液,3组雏鸡感染后1、3、4、5、7、14、21d,随机抽取5只,心脏采血处死,取肾脏,应用免疫酶组织化学和图像分析技术等手段检测禽流感病毒,并观察肾脏的病理变化。结果雏鸡感染鹅源H5N1亚型禽流感病毒后1～14d,其肾脏血管内皮细胞、肾小管上皮细胞内均可检测到病毒抗原,并呈现不同程度的病理形态损伤。结论鹅源H5N1亚型禽流感病毒对雏鸡肾脏具有较强的嗜组织特性,可造成雏鸡肾脏严重损伤。     

成人重症肺炎患者EB病毒和人鼻病毒混合感染的病原学分子鉴定

目的对1例有禽类接触史的成人重症肺炎患者进行病原学研究,确定其病原体。方法采集患者的下呼吸道标本,应用荧光PCR方法检测禽流感H5N1和SARS病毒及甲型H1N1和季节性流感病毒;应用多重PCR方法检测12种常见呼吸道病毒;应用普通PCR方法检测EB病毒和巨细胞病毒,扩增阳性的病毒基因片段测序后,与GenBank数据库参考序列进行同源性分析。结果荧光PCR法检测禽流感病毒H5N1病毒和SARS病毒核酸阴性,甲型H1N1和季节性流感病毒核酸阴性;多重PCR检测人鼻病毒、EB病毒均阳性;普通PCR检测EB病毒核酸阳性。基因序列比对显示,EB病毒核苷酸序列与GenBank数据库中参考序列同源性为99.5%～100%;人鼻病毒的核苷酸序列与GenBank数据库中A组鼻病毒(73血清型)同源性最高,为94.7%。结论该例重症肺炎患者为EB病毒和A组(73血清型)人鼻病毒混合感染,排除禽流感H5N1和SARS感染。     

甘肃省武威市职业暴露人群血清学和环境高致病性禽流感监测分析

目的动态掌握甘肃省武威市职业暴露人群人感染H5N1禽流感病毒和环境标本中禽流感病毒的分布,从而了解职业暴露人群和环境标本中H5、H7和H9高致病性禽流感亚型病毒感染情况,为今后武威市人感染高致病性禽流感的防控提供科学依据。方法根据职业暴露人群血清学和环境高致病性禽流感监测方案要求,对从事家禽养殖、屠宰等职业暴露人群,采集血清标本进行马血球血凝抑制实验(HI)检测人感染H5N1高致病性禽流感病毒抗体,对家禽粪便和环境标本采用实时荧光定量法(PCR)进行禽流感病毒A型核酸检测,禽流感病毒A型核酸阳性标本进一步进行H5、H7和H9亚型检测。结果不同场所共采集职业暴露人群血清标本228份,结果均为阴性;不同养殖场所均未监测出禽流感病毒,不同活禽交易市场均检测出禽流感病毒;活禽交易市场普遍存在禽流感病毒,阳性检出率差异有统计学意义(χ2=24.59,P0.05);110份禽流感病毒核酸阳性标本中,H5型占3.64%,H7型未检出,H9型占96.36%,H9亚型是武威市禽流感病毒的主要病原体,差异有统计学意义(χ2=37.60,P0.05);清洗禽类的污水标本禽流感阳性检出率明显高于其他环境标本检出率,差异有统计学意义(χ2=23.85,P0.05);第四季度禽流感阳性检出率明显高于其他季度,差异有统计学意义(χ2=17.38,P0.05)。结论人感染高致病性禽流感病毒在武威市职业暴露人群中未发现隐性感染,活禽市场环境普遍存在禽流感病毒污染,应加强主动监测防止高致病性禽流感暴发流行。     

H6亚型流感病毒在小鼠肺内的适应性传代研究

目的为了进一步探讨H6亚型禽流感病毒(AIV)对哺乳动物的感染与致病能力,建立H6亚型AIV哺乳动物感染模型。方法用H6N1亚型AIV感染BALB/c小鼠,并在小鼠肺组织中连续传代,测定病毒的EID50。观察感染鼠临床症状和体征,评价病毒的致病性。结果经8～9代的适应后,该病毒即对小鼠产生明显的致病性,小鼠表现出精神萎靡、食欲减退、竖毛、弓背等临床症状。测定鼠肺适应株病毒H6N1-P8-M1、H6N1-P9-M2、H6N1-P8-M3的EID50分别为108.5、106.75和108.25/ml,三毒株感染鼠在发作期全部死亡。H6N1-P0组小鼠感染后14d仍全部存活。结论 H6N1亚型AIV与其他亚型相似,同样具有经适应后对哺乳动物呈现高致病性的能力,提示应关注H6亚型AIV对人类的潜在风险,得到的毒力增强鼠肺适应株为H6N1流感病毒疫苗和药物研究以及致病分子机制研究提供了动物模型。     

实时荧光定量PCR在登革热病毒快速检测中的应用

目的应用实时荧光定量PCR快速检测登革热病毒感染。方法采集疑似登革热患者血清,采用实时荧光定量PCR检测登革热病毒,同时采用ELISA检测血清登革热IgM抗体。结果患者发病第7d血清登革热IgM血清抗体A值为0.236和0.237(临界值0.250),高度疑似阳性,第13d血清IgM抗体阳性。患者发病第2d,通用型核酸检测显示血清登革热病毒核酸含量较多,经过治疗,于第7d病毒拷贝下降。发病第2d,核酸检测确定感染病毒为登革热Ⅲ型;发病第13d血清登革Ⅲ型病毒核酸检测阴性。结论实时荧光定量PCR法具有准确性好、灵敏度高等优点,可用于登革热病毒感染的快速检测。     

不同引物检测甲型H1N1流感病毒的比较研究

目的筛选灵敏、特异的甲型H1N1流感病毒核酸检测方法。方法采用国家流感中心推荐的甲型流感病毒(H1N1)核酸引物和1对自行设计的引物,同时选择市售荧光定量PCR试剂盒,分别对不同浓度的流感病毒进行RT-PCR或荧光定量PCR扩增,比较其检测的灵敏度和特异性。结果荧光定量PCR检测H1N1病毒核酸的灵敏度为10-5(病毒稀释度),高于普通RT-PCR的灵敏度10-3~10-4;RT-PCR扩增甲型流感病毒(H1N1)核酸时,自行设计引物的灵敏度为10-4,高于中国CDC推荐引物的灵敏度10-3。2种引物的特异性一致。结论对于甲型(H1N1)流感病毒疑似样品的检测,荧光定量PCR是较灵敏的方法,但从成本和灵敏度两方面考虑,自行设计的引物更适合基层疾控机构采用。     

上海市黄浦区1例人感染高致病性禽流感病例现场流行病学分析

人感染高致病性禽流感是由H5N1血清型引起的禽流感,其发病率和死亡率都很高,危害巨大。1997年中国香港首次证实禽流感病毒（H5N1）感染人类以后,世界各地相继报道了多例禽流感病毒感染人并导致死亡事件,禽流感病毒已对人类健康构成严重威胁,引起了全世界的关注。     

恒河猴H5N1禽流感病毒性肺炎模型建立及其发病机制

目的 探讨H5N1病毒(AF148678/ACGoose/Guangdong/11961H5N1)感染恒河猴诱发自初期至恢复期过程肺炎的机制。方法 以H5N1 病毒液经鼻滴入恒河猴,染毒后第0 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、10 d、12 d和14 d采血作血液学和流感特异抗体检测。染毒后第1、3、6、14 d分别剖杀1 只恒河猴,取气管支气管淋巴结、肺、心、肝、肾、大脑及小脑进行病毒分离、滴定、病理及免疫组化检测并观察感染后临床表现。结果 猴感染后出现发热、呼吸困难,食欲下降等。病毒仅在肺组织复制,主要侵犯下呼吸道的肺泡上皮细胞和肺巨噬细胞。感染后第1~3 d引起暂时性的严重肺炎,主要为中性粒细胞浸润;第6 d后逐渐恢复,以巨噬细胞浸润为主;第14 d后以T淋巴细胞浸润为主,肺组织呈恢复期状态。结论 下呼吸道是H5N1病毒感染主要攻击的对象,这可能是H5N1病毒在人与人之间传递的障碍之一,其发病可能经过病毒侵入、复制阶段及免疫损伤阶段。     

再测序芯片在北京首例人禽流感病例病原学检测中的应用

目的利用再测序芯片对北京市首例人禽流感病例进行病原筛查和验证。方法采集病例咽拭子和气管抽吸物标本,利用real-ti me RT-PCR进行禽流感病毒H5N1亚型核酸检测;应用病原体再测序芯片对其进行复核,并对其它呼吸道病原体和流感病毒其它亚型进行筛查。结果气管抽吸物标本经real-ti me RT-PCR检测为禽流感病毒H5N1核酸阳性;再测序芯片检测的结果是获得了H5N1的非结构蛋白基因(NS)特异序列,通过与GenBank进行序列比对,确定为禽流感病毒H5N1核酸,并排除了30种流感病毒亚型和其它33种呼吸道病原体的感染。结论病原体再测序芯片具有高灵敏性和特异性,在北京市首例人禽流感病例的病原学筛查和验证中发挥了重要作用。     

山东省首例人禽流感病例的诊断过程分析

目的对2009年1月15日山东省济南市发生的1例人禽流感病例进行实验室诊断过程分析,探讨实验检测过程中遇到的问题。方法采集病人咽拭子和呼吸道吸取物标本,利用RT-PCR和real-time RT-PCR检测病毒核酸。结果第2次采集的咽拭子标本采用H5HA引物的RT-PCR扩增呈阳性;呼吸道吸取物分别用H5NA等3对引物进行RT-PCR均阳性,real-time RT-PCR阳性。结论该患者为人感染高致病性禽流感病毒（H5N1）实验室确诊病例。呼吸道吸取物是禽流感病毒核酸检测的合适标本。     

禽流感病毒H1、H3、H5、N2亚型多重RT-PCR检测方法的初步研究

目的根据禽流感病毒H1、H3、H5亚型的HA基因和N2型NA基因的保守序列,设计出四对RT-PCR引物,建立一步法多重RT-PCR对禽流感H1、H3、H5、N2四亚型进行快速检测。方法利用所设计的四对引物,通过对该方法扩增条件的优化,成功建立快速检测禽流感病毒H1、H3、H5、N2四亚型的一步法多重RT-PCR。利用禽流感H1、H3、H5、N2四亚型毒株和其它相关标准毒株进行敏感性和特异性试验。结果与结论所建立的一步法多重RT-PCR具有较高的特异性和敏感性,与禽流感其它亚型和NDV、IBV、ARV?IBDV的核酸均无交叉反应。用该方法检测现场样品395份(4省20多个地区),结果与经典检测方法一致。     

H5N1禽流感病毒抗原基因的体外转录及RNA标准品构建

目的 通过基因克隆和体外转录,获得H5N1禽流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白M(M)基因的RNA片段,为病原学检测提供阳性定量标准品.方法　设计H5N1禽流感病毒的HA、NA及M基因全长开放阅读框的克隆引物,提取H5N1禽流感病毒总RNA,用RT-PCR获得相应片段,分别连接至Pgem-T easy...     

H6N1亚型禽流感病毒跨种属传播研究进展

禽流感病毒H6N1亚型广泛存在于水禽和陆禽,是最常分离到的甲型流感病毒亚型,遗传分析表明该病毒可能是高致病禽流感病毒H5N1的前体。随着病毒基因的持续进化,H6N1可跨种间屏障传播至哺乳动物,其对于哺乳动物小鼠、猪和雪貂已经具有较强感染能力。血清流行病学调查结果显示少数人H6禽流感病毒抗体阳性,2013年5月,我国台湾出现全球首例人类感染H6N1亚型流感病毒。因此,H6N1病毒宿主范围不断扩大,在这些宿主内可发生病毒基因突变、基因重配,进而演变为具有感染人类潜能的新变异株的可能。本文从病原学、流行病学、病毒感染哺乳动物和人类等方面对H6N1亚型禽流感病毒的研究进展进行综述,以期为H6N1禽流感病毒的防控提供参考。