文摘

西班牙巴伦西亚大学医学院Moret—Tatay等用脂质体DOTAP将粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）基因修饰的pcDNA3和空pcDNA3质粒转染鼠源黑素瘤细胞B16,收获的转染细胞经放射线照射后-150℃冻存。冻存细胞融化后用分子探针Calcein-AM检测B16转染细胞的活性;ELISA检测转染细胞GM—CSF分泌。用转染的B16一GM—CSF细胞、B16-pcDNA3细胞、B16细胞和空白对照免疫小鼠。免疫小鼠尾静脉采血检测血清特异性抗鼠肿瘤膜蛋白（TMP）IgG和亚类。     

内皮抑素基因逆病毒载体的构建及其在白血病细胞中的表达

目的 探究内皮抑素基因转移在白血病抗血管新生治疗中的价值。方法 构建分泌型内皮抑素的表达载体,联合脂质体转染与交互感染建立逆病毒介导的内皮抑素基因转移系统,并用内皮抑素病毒分别感染白血病细胞WEHI-3B和K562;用聚合酶链反应(PCR)检测靶细胞中内皮抑素基因的整合与表达。结果 脂质体转染与交互感染策略分别获得单嗜型(GP+E-86/ES)和双嗜型(Am12/ES)病毒生产细胞,后者上清的病毒滴度约为7.8×105CFU/ml;内皮抑素病毒感染、G418选择得到内皮抑素基因修饰的WEHI-3B细胞和K562细胞,PCR分析显示两者均有内皮抑素基因整合并持续表达。结论 逆病毒载体有效介导白血病细胞表达内皮抑素,可用于血液肿瘤的血管抑制基因疗法研究。     

巴西蘑菇多糖对小鼠脑组织表达粒-巨噬细胞集落刺激因子的影响

目的 :研究巴西蘑菇多糖 (ABPS)对小鼠脑组织表达粒 巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)的影响。方法 :应用组织培养技术、克隆形成法、逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)等方法检测小鼠脑组织在ABPS作用下表达GM CSF的变化。结果 :不同浓度的ABPS对小鼠脑组织表达GM CSF有明显的促进作用 ,浓度范围为 2～ 6mg·ml-1之间 ,最佳浓度为4mg·ml-1。经LightFramesoftware分析 ,小鼠GM CSF在 96 0bp处出现一高峰。结论 :ABPS有促进小鼠脑组织表达GM CSF的作用 ,证实了ABPS促进粒单祖细胞生成的机理     

siRNA介导的hPOT1基因表达抑制对HeLa细胞凋亡的影响

目的　应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,特异地抑制端粒保护蛋白hPOT1基因在HeLa细胞中的表达,并观察其对细胞凋亡的影响。方法利用先前构建的含hPOT1基因特异性序列(hsRNA)的3种重组siRNA表达质粒,由脂质体介导转染HeLa细胞,以RT PCR和电泳迁移率变化分析法检测转染细胞中的hPOT1基因的表达抑制效果,并通过流式细胞术、Hoechst荧光染色和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果　不同hPOT1特异性序列的3种的重组质粒转染HeLa细胞4 8h后,细胞中hPOT1基因mRNA和蛋白质表达水平降低,细胞凋亡水平明显增加。结论　siRNA表达载体介导的RNAi能有效地抑制HeLa细胞中hPOT1基因表达,hPOT1基因表达下调导致HeLa细胞凋亡     

转染内皮祖细胞的脂质体与腺病毒载体的比较

目的:比较脂质体和腺病毒作为肝细胞生长因子(HGF)基因转染内皮祖细胞载体的效力.方法:分离培养大鼠骨髓血管内皮祖细胞,并通过摄取DiL-acLDL、结合FITC-UEA-1及流式细胞术检测表面抗原CD133+进行鉴定.脂质体介导细胞转染,将细胞分为HGF质粒转染组(转染pIRES2-EGFP-HGF质粒)、空载质粒转染组(转染plRES2-EGFP质粒)和空白对照组.病毒介导细胞转染,细胞分HGF病毒转染组(pAdxsi-GFP-HGF重组腺病毒转染)、空载病毒转染组(导入pAdxsi-GFP腺病毒)和空白对照组.荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,ELISA法检测HGF的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞增殖能力.结果:脂质体和腺病毒载体均可成功将绿色荧光蛋白标记的HGF基因转入内皮祖细胞,其中腺病毒转染效率更高,最高可达80％以上,其表达HGF水平以及细胞增殖能力都明显强于脂质体转染.空载病毒转染组细胞增殖与空白对照组差异无统计学意义(P＞0.05),而空载质粒转染组细胞增殖明显少于空白对照组(P＜0.05).结论:腺病毒作为HGF基因转染内皮祖细胞的载体相对于脂质体载体具有更高效、低毒、高表达目的基因的优点.     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及在真核细胞的表达

目的 构建人胰岛素样生长因子—1(IGF1)真核表达载体，并在成纤维细胞NIH3T3细胞内进行表达。方法 用RT-PCR法从人肝细胞中克隆人IGF1的基因，将其连入真核表达载体pSec-Tag／FRT／V5一His，PCR法及测序鉴定阳性克隆；用脂质体法将阳性克隆转染NIH3T3细胞；收集转染后的细胞上清，用Western blot进行检测。结果 琼脂糖电泳显示RT-PCR扩增出315bp的条带；与载体连接后的克隆进行测序得到一个阳性克隆；Western blot检测显示转染后细胞上清出现与预计值相符的特异性条带。结论 成功克隆并构建人IGF1基因的真核表达载体，转染后NIH3T3细胞成功表达IGF1重组蛋白。     

慢病毒介导抗菌肽PR-39基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达及抗菌活性检测

目的 构建脯氨酸精氨酸抗菌肽(proline-arginine rich 39-amino acid peptide, PR-39)慢病毒载体,并转染兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSC),检测其在BMSC中的表达及抗菌活性。方法 PCR扩增目的克隆,并连接入慢病毒载体质粒pGC-FU中,与包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0在脂质体2000介导下共转染293T细胞生产慢病毒颗粒,Real-Time PCR法检测其滴度;分离培养BMSC,BMSC转染PR-39慢病毒,荧光显微镜观察及流式细胞仪检测其转染效率,RT-PCR检测PR-39基因表达,并检测PR-39抗菌活性。结果 成功包装出滴度为2×109 TU/mL的PR-39慢病毒载体,并转染BMSC,转染72 h后可观察到细胞呈现绿色荧光,转染效率为74.09%,同时RT-PCR检测BMSC表达PR-39基因,其上清液对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,抑菌率为98.43% (P<0.05)。结论     

脂质体介导乙型肝炎病毒核心抗原基因转染人树突状细胞的效率

目的 观察脂质体介导HBcAg基因转染来源于人外周血单个核细胞(PBMC)树突状细胞(DC)的转染效率.方法 用HES离心沉淀法分离人外周血PBMC,经粒-巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)诱导培养DC,培养第5天以阳离子脂质体为载体将报告基因GFP(DNA:脂质体比例为1:3、1:4、1:5、1:6)及HBcAg基因(DNA:脂质体1:5)导入DC,于72h经流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达率,于48、72、96、120h流式细胞仪检测HBcAg的表达率.将基因转染后的DC 与自体淋巴细胞混合培养,检测其细胞内γ干扰素(IFN-γ)、IL-4表达水平.结果 倒置显微镜下观察脂质体转染后DC的的形态无明显变化.报告基因GFP与脂质体比例不同,其转染效率有差异,72h的表达率为37.12%(1:3)、48.55%(1:4)、52.13%(1:5)、50.75%(1:6).HBcAg基因转染DC后48、72、96、120h的HBcAg表达率分别为31.58%、55.80%、54.18%、56.99%.转染后DC与自体淋巴细胞混合培养后,淋巴细胞高表达IFN-γ,较少表达IL-4,呈现Th1为优势的免疫应答.结论 应用阳离子脂质体能有效的将HBcAg基因转染到人PBMC来源的DC,转染72h后抗原表达稳定;转染HBcAg基因的DC仍以诱导Th1免疫应答反应为主.     

腺病毒介导血管内皮生长因子转染脐带间充质干细胞的实验研究

目的探讨腺病毒载体介导血管内皮生长因子(VEGF)转染脐带间充质干细胞(UCMSCs)的可行性,以及VEGF转染对UCMSCs功能的影响。方法构建VEGF165-EGFP基因重组腺病毒载体,分离和培养UCMSCs,携增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的腺病毒载体转染UCMSCs,倒置荧光显微镜下观察细胞转染效果,流式细胞仪检测细胞转染率,确定最佳病毒感染复数(MOI)。将细胞分为VEGF-EGFP转染组、EGFP空载组及对照组3组,依据最佳MOI值转染并收集细胞,采用蛋白印迹法(Western blotting)检测VEGF及Akt表达变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测VEGF蛋白表达情况。采用CCK-8法评价转染对UCMSCs增殖的影响。结果腺病毒介导的VEGF165-EGFP基因能够成功转染UCMSCs,且VEGF基因在细胞内能够转录和表达,并能分泌到细胞外。转染后48 h VEGF-EGFP转染组VEGF、Akt水平显著高于EGFP空载组和对照组(P<0.05);转染后48 h采用ELISA法在VEGF-EGFP转染组细胞培养上清中即检测到VEGF的表达和分泌,在转染后第4天达到高峰,且VEGF表达显著高于EGFP空载组及对照组(P<0.01),以后逐渐下降,并稳定表达一定时间。CCK-8法检测结果显示,介导VEGF基因转染的腺病毒对UCMSCs增殖无明显影响。结论腺病毒介导VEGF基因能够成功转染UCMSCs,保持其原有生物学特性,并能持续高效表达VEGF,为通过VEGF基因联合UCMSCs治疗获得糖尿病下肢血液循环重建的可行性提供理论依据。     

重组人GM-CSF临床应用研究近况

主要的集落刺激因子有粒细胞——巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)、粒细胞集落刺激因子(G—CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M—CSF)和多能集落刺激因子(Multi—CSF又称IL—3),它们效果多样,能刺激各种前体细胞分化成熟(见图1)。     

人白细胞介素24真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的 构建人白细胞介素24(human interleukin-24,hIL-24)真核表达载体,并在HepG2细胞中稳定表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),从植物血凝素活化的人外周血单个核细胞中克隆得到hIL-24基因目的 片段.应用DNA重组技术将IL-24PCR产物双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DHSα获得重组载体,进行PCR、酶切及测序鉴定.应用脂质体将鉴定正确的重组质粒转染至HepG2细胞,用G418筛选稳定转染细胞株.采用RT-PCR检测稳定转染细胞HepG2中IL-24 mRNA的表达.结果 通过RT-PCR获得与预期大小一致约600 bp的IL-24基因片段;重组载体pcDNA3.1(+)-IL-24经PCR、双酶切及测序证实,IL-24 eDNA片段已正确插入真核表达载体中;在稳定转染的HepG2细胞株中可见到IL-24 mRNA表达.结论 成功构建了hIL-24真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24,并获得了稳定转染该重组质粒的HepG2细胞株.     

携带人内皮一氧化氮合酶基因的AAV重组表达载体的构建

目的：构建一个新型的携带有人内皮一氧化氮合酶(eNOS)cDNA的质粒载体并研究其体外表达,以用于基因治疗．方法：eNOS cDNA插入到腺相关病毒质粒pSNAV-1的EcoR I位点．该质粒的启动子为CMV启动子,并携带有腺相关病毒的末端重复序列．构建好的质粒转染到两种哺乳动物细胞BHK和C2C12细胞中,通过PCR和RT—PCR分别检测eNOS cDNA和mRNA．结果：限制性内切酶分析证明,eNOS cDNA以正确的方向插入到pSNAV-1质粒中．PCR检测表明pSNAV—eNOS被转入BHK和C2C12细胞中．RT—PCR检测表明转染有pSNAV—eNOS的细胞可表达eNOS mRNA．结论：成功构建的pSNAV—eNOS可在体外培养的哺乳动物细胞中表达人eNOS mRNA．     

VEGF165在恒河猴骨髓间充质干细胞中的表达及鉴定

目的 探讨血管内皮生长因子（VEGF165）转染恒河猴间充质干细胞（MSCs）后的表达情况, 以及转染后对 MSCs 功能的影响。 方法 通过 Ficoll 法分离并培养恒河猴骨髓 MSCs, 进行细胞表型鉴定。 转染 pcDNA-eGFPVEGF165至 MSCs, 荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达情况, 同时流式细胞技术对转染成功的细胞进行细胞表型及 eGFP 表达鉴定, RT-PCR 法检测转染后 VEGF165表达情况。 结果 成功分离到纯度较高的 MSCs, 转染后的 MSCs 及子代细胞均有 eGFP 和 VEGF165 的表达, 且保留了 MSCs 的特性。 结论 VEGF165 基因转染 MSCs 后可以稳定表达外源基因, 且可以维持 MSCs 的特性。     

携带人PPARα基因高效真核表达载体的构建及其意义

目的构建可以高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体(αhPPARα)的真核细胞表达载体,为筛选作用于PPARα受体的药物提供分子平台。方法将HepG2细胞总RNA经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆hPPARα全长基因,用BamHⅠ、SalⅠ双酶切后,与相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建phPPARα-IRES2-EGFP重组质粒,用酶切及基因测序鉴定重组质粒中hPPARα基因的完整性和可靠性;重组质粒转染293细胞,荧光显微镜观察EGFP报告基因表达强度,并对转染细胞的hPPARα表达进行荧光定量PCR及免疫细胞化学检测。结果经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPARα的高效表达。结论成功构建重组质粒phPPARα-IRES2-EG-FP,为基于hPPARα受体靶点的药物筛选平台的建立提供了高效表达hPPARα的重组载体。     

携带小鼠 KLF4 基因重组慢病毒的构建及对 RAW264.7 细胞增殖的影响

目的 构建小鼠 Krüppel 样因子 4（KLF4）慢病毒表达载体,并建立 KLF4 过表达小鼠腹腔巨噬细胞 RAW264.7 细胞株。方法 采用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增目的基因 KLF4 后,构建重组质粒 pLVX-KLF4,并 通过 PCR、双酶切和测序方法对其进行鉴定。重组质粒与 pSPAX2、pMD2.G 辅助质粒通过 Lipofectamine® 3000 共转 染 293T 细胞,包装病毒并测定病毒滴度。将获得的慢病毒感染 RAW264.7 细胞,实时定量 PCR 法检测 KLF4 mRNA 的表达。分选流式细胞仪分选 GFP 阳性 RAW264.7 细胞。流式细胞术检测 KLF4 对 RAW264.7 细胞周期的影响。 EdU 法检测 KLF4 对 RAW264.7 细胞增殖的影响。结果 经 PCR、双酶切鉴定和测序证实,成功构建了包含小鼠 KLF4 基因的慢病毒穿梭质粒,RT-PCR 证实 Lenti-KLF4 感染的 RAW264.7 细胞中 KLF4 mRNA 表达高于未感染的 对照组 RAW264.7 细胞（P＜0.05）。初次浓缩后测定小鼠 KLF4 基因重组慢病毒的滴度为 2.05×108 TU/mL。分选出 KLF4 过表达的 RAW264.7 细胞。KLF4 过表达的 RAW264.7 细胞周期变化显示为 S 期延长,G0/G1 期缩短。EdU 检 测显示 KLF4 过表达的 RAW264.7 细胞增殖活性增高。结论 成功构建了 KLF4 的慢病毒表达载体,并建立 KLF4 过表达的 RAW264.7 细胞株,KLF4 过表达促进了 RAW264.7 细胞的增殖。     

造血干／祖细胞遗传学修饰对4—氢过氧化环磷酰胺、长春新碱和柔红霉素的联合抗体

目的：探讨经醛脱氢酶基因（ALDH－3）和多药耐药基因（MDR1）遗传学修饰的人外周血造血干／祖细胞能否同时增强活性环磷酰胺（4－HC）和MDR1基因靶药的抗性。方法：构建同时含ALDH－3和MDR1双耐药基因的逆转录病毒表达质粒G1Na-ALDH3-IRES-MDR1,经电穿孔导入PA317包装细胞,将免疫磁珠分离系统（MACS）分离纯化后的人外周血CD34^ 细胞用含有ALDH－3和MDR1双耐药基因重组病毒的上清感染,用PCR、RT－PCR、Southern blot、Northern blot、ACS和MTT等方法检测外源ALDH－3与MDR1基因在CD34^ 细胞中的转移和表达。结果：用PCR与酶切分析法鉴定了双顺反子逆转录病毒载体构建的正确性,双耐药基因已整合入转染靶细胞中基因组,并获得有效表达,应用集落计数测定基因转导效率为18％。巢式PCR及补救分析均未检测到辅助病毒存在。经双耐药基因修饰的CD34^ 造血干／祖细胞对4－HC的IC50较对照组提高4．5倍,对多药耐药基因靶药（长春新碱和柔红霉素）的IC50较未转染细胞分别高6．6和7．8倍。结论：逆转录病毒载体介导双耐药基因转导外周血造血干／祖细胞高效共表达可降低联合化疗骨髓毒性。     

Ad5-IFN-γ-GFP重组腺病毒转染的骨髓间充质干细胞对小鼠喉旁组织IFN-γ蛋白表达的实验研究

目的探讨干扰素-γ（IFN-γ）转染骨髓间充质干细胞（BMSCs）对喉部疾病的治疗效果。方法采用Ad5-IFN-γ-GFP重组腺病毒,将转染IFN-γ的BMSCs注射到小鼠喉旁组织,第1、3、7、14、28天取骨髓和喉旁组织用Western blot检测IFN-γ蛋白表达水平。结果当MOI=100和转染时间72h时,细胞上清液IFN-γ表达水平分别达到峰值。注射空白培养液和空白mBMSC的骨髓和喉旁组织IFN-γ基本不表达。注射病毒转染的mBMSC后,骨髓和喉旁组织中都开始大量表达IFN-γ,且表达量随注射时间延长而增加。结论IFN-γ导入BMSCs并通过小鼠喉旁局部注射,可以在组织获得持久表达。为临床IFN-γ基因治疗喉部肿瘤提供了动物实验依据。     

FAM3B基因cDNA克隆及其在胃癌细胞系BGC-823的表达

目的克隆FAM3B cDNA,构建FAM3B重组表达载体并在胃癌细胞系BGC-823中表达,观察其对细胞系的影响,探索新的肿瘤治疗途径。方法构建pEGFP-N2-FAM3B真核表达质粒,将pEGFP-N2-FAM3B转染人胃癌细胞系BGC-823,研究其对胃癌细胞产生的作用。结果重组pEGFP-N2-FAM3B真核表达质粒构建成功,经pEGFP-N2-FAM3B转染后,荧光显微镜下可见转染的BGC-823细胞有绿色荧光蛋白的表达,转染后的BGC-823细胞生长减慢。结论构建完成真核表达载体pEGFP-N2-FAM3B,重组pEGFP-N2-FAM3B质粒在胃癌细胞系BGC-823细胞内成功表达。     

脂质体介导的肝细胞生长因子基因在脐静脉内皮细胞中的表达与鉴定

目的构建含肝细胞生长因子(HGF)基因真核表达载体pEGFP-N1-HGF,观察HGF基因在人脐静脉内皮细胞中的表达。方法由重组质粒pRc/CMV-HGF中扩增出HGF基因,将其克隆到含增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1中,应用脂质体将重组质粒pEGFP-N1-HGF转染到人脐静脉细胞株ECV304中,G418筛选获得稳定表达克隆,采用荧光显微镜观察、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学方法鉴定。结果经G418筛选后可形成抗性细胞克隆;荧光显微镜下观察到有绿色荧光;RT-PCR能扩增出HGFmRNA预期的699bp片段;免疫细胞化学证实转染HGF基因的细胞有HGF蛋白的表达。结论重组质粒pEGFP-N1-HGF能够在细胞株ECV304转录、表达。     

BIS监测下全身麻醉在宫颈癌患者手术中应用

目的构建VEGFA基因重组真核表达载体pEGFP-VEGFA,并检测其在人胚胎肾细胞（HEK293T）中的表达。方法以人脐血单核细胞的RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增VEGFA基因,并将其定向插入真核表达载体pEGFP-Nl中,构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA。经限制性核酸内切酶BglII和SalI酶切和DNA测序鉴定后,用脂质体法将pEGFP-VEGFA转染HEK293T细胞,转染后24 h和48 h采用荧光显微镜观察pEGFP-VEGFA的表达。结果 pEGFP-VEGFA被双酶切为4 697 bp和1 251 bp两条条带,测序结果证实VEGFA序列与GenBank公布的VEGFA mRNA序列完全一致。在经转染的HEK293T细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pEGFP-VEGFA成功转染HEK293T细胞,并在其中得到了表达。结论成功构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA,为进一步研究VEGFA基因的生物学功能奠定了基础。