302例新疆梅毒患者人类疱疹病毒8型感染状况

卡波西肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi sarcoma associated herpesvirus,KSHV）,即人类疱疹病毒8型（Human herpes virus type-8,HHV-8）,是卡波西肉瘤（Kaposi sarcoma,KS）最关键的致瘤因素。目前HHV-8确切的传播方式尚不明确,异性间是否存在HHV-8性传播有广泛争议。选择不安全性行为或性乱人群中感染梅毒这类主要性传播疾病患者,进行HHV-8感染流行病学调查及危险因素分析。     

开放读码框架50基因介导HIV-1感染相关的肝细胞生长因子诱导人类疱疹病毒8型复制

目的　研究人类疱疹病毒 8型 (HHV 8)开放读码框架 (ORF) 5 0基因启动子在HIV 1感染相关细胞因子肝细胞生长因子 /驱散因子 (HGF/SF)诱导原发性渗出性淋巴瘤 (PEL)BC 3中潜伏感染的HHV 8复制过程中的作用。方法　将HGF/SF连续加入到体外培养的BC 3中 ,分别于培养第 3天和第 7天收集刺激细胞 ,电子显微镜观察成熟HHV 8病毒的形成 ;提取细胞总RNA ,North ernblot和定量聚合酶链反应 (PCR)法检查HHV 8次要衣壳蛋白ORF2 6mRNA转录。同时 ,将已构建的HHV 8ORF5 0启动子 虫荧光素酶报告基因重组质粒和含HIV 1Tat基因重组表达质粒分别共转染BC 3和人脐静脉血管内皮细胞 (HUVECs) ,转染后 2 4h加入HGF/SF和 /或重组HIV 1gp12 0刺激 ,刺激后 2 4h收集细胞 ,进行虫荧光素酶活性检测。试验同时以佛波酯 (TPA)刺激为阳性对照。结果　HGF/SF可以上调HHV 8ORF2 6mRNA表达 ,且于刺激的第 7天 ,ORF2 6mRNA表达上升了 4 .1倍 ,BC 3细胞中同时可观察到成熟的HHV 8病毒粒子 ;HGF/SF能够诱导ORF5 0启动子活性 ,但HIV 1Tat和 gp12 0蛋白与HGF/SF协同上调ORF5 0启动子活性的能力较弱。 结论　HIV 1感染相关细胞因子HGF/SF诱导HHV 8复制的过程至少有部分由ORF5 0启动子介导。     

人类疱疹病毒6型感染研究进展

人类疱疹病毒6型,是从患艾滋病(AIDS)合并淋巴细胞增生性疾病患者的外周血单个核细胞中分离出的一种病毒.是至今发现的惟一一种可以将其DNA整合至宿主细胞染色体上的疱疹病毒.感染恢复后,病毒可长期潜伏在体内,一旦机体免疫功能降低,病毒即可激活致病,故为"机会"致病微生物.可引起幼儿急疹,并与器官移植后并发症、AIDS以及人类某些肿瘤等多种疾病有一定关联,现已引起世界各国政府和社会的广泛关注.     

HHV-8 ORF73C基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术获得人疱疹病毒8型（HHV-8）ORF73C基因,克隆至pGEMT—easy载体,进-步克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,构建含HHV-8 ORF73C基因的重组表达质粒pGEXORF73;重组表达质粒pGEXORF73在大肠杆菌中得到有效表达。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测人类8型疱疹病毒载量方法的建立及其诊断应用

目的 建立一种检测人类8型疱疹病毒(HHV-8)载量的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,并进行初步诊断应用.方法 分别构建HHV-8开放阅读框(ORF)26和内参照基因β-actin重组T载体,制备质粒标准品.确定最佳实验条件,建立高灵敏度的RT-qPCR方法.并检测30份经病理学确诊的卡波西肉瘤(KS)石蜡组织中HHV-8载量,初步评价其应用的有效性.结果 明确了建立该法的最关键因素为退火温度和延伸环节.标准曲线参数良好,ORF26和β-actin标准品Ct值与其相应梯度稀释标准品浓度呈良好线性关系(γ2＞0.990),扩增效率分别为88.3%和90.3%.经熔解曲线和电泳分析,产物特异.30份KS样本中HH V-8 ORF26的检出率为100%.经典型KS中HHV-8载量显著高于AIDS相关型KS(均数分别为69.18和8.63,x2=7.950,P=0.005).结论 成功建立了灵敏度高的HHV-8实时荧光定量PCR检测方法,为临床诊断可疑或感染病例提供了技术平台.     

人类疱疹病毒8型实时荧光定量PCR外标准品的构建

目的构建人类疱疹病毒8型(HHV-8)基因质粒标准品,以便快速、灵敏、可靠地检测与HHV-8相关疾病患者的病毒载量。方法提取HHV-8基因组DNA,以HHV-8 ORF26为目的基因设计引物,进行PCR扩增;纯化目的片段与pMD19-T Vector连接并转化到大肠杆菌中;提取重组质粒DNA,并行PCR、测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,实时荧光定量PCR(Real-time FQ-PCR)构建标准曲线。结果 HHV-8ORF26目的片段制备成功,获得稳定的重组质粒,保证了目的片段的特异性和序列完整性,标准曲线参数良好,外标准品阈值循环数(Ct)与其相应梯度稀释浓度呈良好的线性关系,扩增效率高。结论成功构建了HHV-8的Real-time FQ-PCR外标准品,可以快速检测样品中的HHV-8载量。     

三种人类8型疱疹病毒特异性抗原表达及复合抗原血清学检测方法的建立

目的建立人类8型疱疹病毒（HHV-8）血清学检测方法。方法利用E．coli系统合成HHV-8三个抗原性较强的融合蛋白：K8．1，ORF65和ORF73C，作为检测抗原，阳性血清为本地12份卡波西肉瘤患者血清和32份AIDS相关型卡波西肉瘤患者血清；阴性血清为20份皮肤肿瘤患者血清和77份15岁以下儿童血清。以Western印迹及EI．ISA法确定各重组蛋白免疫原性和该混合抗原ELISA法的敏感度和特异度。结果获得高纯度的3种8型疱疹病毒特异重组蛋白，均具备较强的抗原特性。应用上述复合抗原ELISA法与传统免疫荧光法共同筛查同批次阳性和阴性血清，发现前者敏感度远高于后者，分别为81．8％和34．4％，特异度则为97．9％。结论K8．1、ORF65、ORF73C是建立HHV-8血清学检测方法较佳的候选抗原，有更高的敏感度和特异度。     

武汉地区戊型肝炎病毒开放读码框3的基因序列分析

目的 对武汉地区戊型肝炎病毒(HEV)开放读码框(ORF)3基因序列进行分析,并确定病毒基因型. 方法 收集103份抗-HEV IgM阳性血清,采用逆转录-巢式聚合酶链反应扩增HEV RNA两个基因片段(5020 ～ 5392nt和5347 ～ 5956 nt,EF570133);对PCR产物进行测序,并用ContigExpress将测序结果拼接(含有ORF3基因),对ORF3基因序列进行分析.结果 103份抗-HEV IgM阳性血清中HEV RNA两个基因片段均扩增出来的样本为18份,18株HEV ORF3基因全长均为345 bp,编码114个氨基酸.各毒株间的核苷酸同源性为92.5％ ～ 99.4％,与基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型HEV的核苷酸同源性分别为83.5％ ～ 86.7％、83.2％ ～ 85.2％、84.6％ ～ 87.2％、92.0％ ～ 96.5％;系统进化分析表明该18株HEV均为基因Ⅳ型. 结论 武汉地区HEV主要为基因Ⅳ型,ORF3基因序列可用于同源进化分析.     

HHV-8型感染的研究进展

人疱疹病毒8型(Human herpesvirus 8,HHV-8)是一种被发现、分离相对较晚的疱疹病毒,与卡波济肉瘤的发生有密切的联系.目前虽已对其开展了大量的研究和调查,但相比其他几种疱疹病毒,HHV-8仍有不少尚需论证之处,如在流行病学和致病机制等方面,部分不同研究的结论出入较大甚至完全相反,而在临床诊断和治疗上亦众说纷纭.鉴于HHV-8潜在的致病性以及人群中普遍易感,目前,指导性的诊断标准和治疗方案亟需展开探讨.该文即围绕关于HHV-8感染方面的最新进展做一综述.     

人单纯疱疹病毒Ⅱ型gD抗原的原核表达及免疫效果测定

目的制备预防人单纯疱疹病毒感染的疫苗。方法扩增人单纯疱疹病毒Ⅱ型的gD基因，克隆人载体，导人大肠埃希菌表达系统，表达、分离、纯化抗原蛋白，然后进行小鼠动物免疫实验，测定小鼠的抗体水平；最后攻毒实验，观察小鼠的病理变化和死亡率。结果免疫后，gD抗原和IFN-γ联合免疫组小鼠体内产生抗体最高，其次gD抗原免疫组。生理盐水组小鼠病理变化出现最早也最重，且死亡最多；gD抗原免疫组小鼠病理变化出现较晚，症状也轻，死亡也少；gD抗原和IFN-γ联合免疫组小鼠无死亡。结论制备小鼠抗人单纯疱疹病毒的疫苗是可行的。此疫苗是否能刺激人体产生抗单纯疱疹病毒的抗体，是否对人有免疫效果，还有待于进一步研究。     

人TSH受体胞外段高效表达质粒的构建、表达及蛋白纯化

利用基因重组方法 ,构建hTSHRecd基因片段原核表达系统 (E .coliM15 )。hTSHRecd蛋白表达量大 ,纯化得到毫克级高纯度的hTSHRecd蛋白 ,可与TSHR自身抗体及TSH特异性结合 ,具有免疫活性及一定生物活性     

PQE-ARL-1重组表达质粒的构建及ARL-1蛋白的制备与纯化

目的：进一步了解人醛糖还原酶相似基因（aldose reductase like-1,ARL-1）的功能及其生物学活性,为制备特异性的ARL-1抗体作准备。方法：用基因重组技术构建PQE-ARL-1原核表达载体,在M15大肠杆菌中进行表达,然后利用Ni -NTA琼脂柱纯化ARL-1蛋白。 结果：经酶切鉴定,PQE-30表达载体上已插入了ARL-1基因,PQE-ARL-1在大肠杆菌中表达产物人重组ARL-1 蛋白经纯化后进行SDS-PAGE电泳,成一条蛋白带,分子量为37.7×103,表达产物约占全菌蛋白的25%,定量测得ARL-1蛋白的浓度为100mg/L。 结论： PQE-ARL-1重组质粒的构建及ARL-1蛋白的制备,为深入研究ARL-1的功能及制备特异性的ARL－1抗体奠定了坚实的基础。     

人脂联素基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人脂联素（APM1）基因真核表达载体，并检测其在HEK293细胞中的表达水平。方法用PCR法从测序正确的pGEM-T-APM1质粒上，扩增出两端带有Sfi Ⅰ酶切位点的人脂联素基因，再将扩增出的片段亚克隆到T载体上，用sfi Ⅰ酶切T载体和pCDEF空载体，将酶切后的片段进行连接、转化、筛选、鉴定、测序。将成功构建的pCDEF—APM1质粒转染HEK293细胞，ELISA检测培养上清中脂联素的水平。结果构建的pCDEF-APM1质粒能有效转染HEK293细胞，并在培养上清中检测到较高水平的脂联素蛋白。结论成功地构建了人脂联素基因的真核表达载体，并在HEK293细胞中获得高效表达。     

急性淋巴细胞白血病p73基因甲基化临床意义的研究

目的探讨p73基因甲基化在急性淋巴细胞白血病(ALL)发病机制中的作用。方法对吉林大学第二医院2001~2004年42例ALL患者采用限制性内切酶结合多聚酶链反应方法(REP)检测p73基因第一外显子甲基化情况。结果42例ALL患者甲基化检测结果28.6%(12/42),存在p73甲基化患者化疗前周围血白细胞数及骨髓原始细胞数均高于无p73甲基化患者,而且首次化疗即获完全缓解及平均缓解时间较无甲基化者差异有显著性。结论p73基因甲基化在ALL发病机制中有一定的作用。其检测对估计预后具有临床意义。     

结核分枝杆菌Rv0867c基因的克隆表达及其纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv0867c基因的原核表达质粒，获得结核分枝杆菌Rv0867c基因的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA，采用聚合酶链反应（PCR）技术扩增目的基因片段；通过克隆载体pUC19构建质粒载体pUC19-Rv0867c，经序列测定证实正确，双酶切后连接于表达载体pPRO-EXHT，转化入大肠杆菌DH5α中，再经IPTG诱导表达带His标签的Rv0867c融合蛋白；用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式。结果成功扩增出了结核分枝杆菌Rv0867c基因，构建了具有正确基因序列的表达载体pPRO-EXHT-Rv0867c，转化入大肠杆菌DH5α中，经诱导产生高水平的表达产物。经SDS分析，在80kD处出现新生蛋白带，凝胶薄层扫描检测表达量约占菌体蛋白的23．7％。该融合蛋白以包涵体的形式存在，用Ni^2＋-NTA纯化柱在变性条件下进行纯化。结论成功克隆了结核分枝杆菌Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物，为进一步研究Rv0867c基因蛋白的活性及其功能，以及结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

EB病毒潜伏膜蛋白2的B细胞表位免疫原性研究

目的 分析EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)B淋巴细胞表位的免疫原性.方法 利用生物信息学技术筛选出EBV LMP2可能的优势B淋巴细胞表位LMP2199-209、LMP2318-322和LMP2381-391,将其相应基因片段分别克隆至pET32a(+)载体并转化至大肠埃希菌BL21(DE3)菌株诱导表达,表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹分析鉴定,通过Ni-NTA离子螯合亲和层析柱纯化.分别以纯化的表位蛋白作为免疫原,皮下多点注射BALB/c小鼠,设pET32a(+)蛋白和PBS为对照.分别以3个表位蛋白作包被抗原,ELISA法检测第0、3、6周小鼠血清中相应表位特异性抗体IgG,并于免疫后第6周检测各免疫组小鼠血清抗体识别天然EBV抗原的能力.结果 在原核表达体系中分别获得了表位LMP2199-209、LMP2318-322和LMP2381 391融合表达产物.纯化的表位蛋白免疫小鼠,血清中分别能检测到相应的表位特异性抗体IgG,其抗体水平随着免疫次数的增加而呈现逐渐升高的趋势,表位LMP2318-322免疫组第3、6周小鼠血清抗体显著高于pET32a(+)蛋白对照组(F=493.85、773.99,均P＜0.05),LMP2381 391免疫组第3、6周抗体水平亦显著高于pET32a(+)蛋白对照组(F=926.33、309.14,均P＜0.05),而表位LMP2199 209免疫组至第6周特异性抗体高于pET32a(+)蛋白对照组(F=87.27,P＜0.05).3个表位蛋白免疫小鼠血清抗体IgG均能识别EBV天然抗原,以表位LMP2199-209和LMP2381-391免疫组抗EBV-IgG生成水平尤为显著.结论 筛选的EBV LMP2可能的优势B淋巴细胞表位LMP2199-209、LMP2318-322和LMP2381-391通过原核表达体系中制备的表位蛋白,具有较好的免疫原性,可进一步用于EBV感染及其相关肿瘤表位疫苗的研究.     

细粒棘球蚴2HSP70重组质粒的构建、原核表达、纯化和初步鉴定

目的构建细粒棘球蚴（Echinococcus granulosus，EG）2热休克蛋白70（heat shock protein，2HSPT0）表达重组质粒，原核表达及纯化重组蛋白，并对重组蛋白进行免疫学特性的初步鉴定。方法从EG2HSP70／pGEM-T／JM109质粒中分离EG2HSP70目的基因，将此片段重组入表达载体pGEX-6P-1后转化入大肠杆菌BL21，鉴定后以IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE检测其表达水平，用亲和层析纯化并分离重组蛋白，利用Western blot来鉴定重组蛋白的免疫学特性。结果酶切鉴定及测序分析表明，成功构建细粒棘球蚴pGEX-6P-1／EG2HSP70重组质粒；IPTG诱导表达后，融合蛋白占菌体总蛋白的39％，占裂解物上清总蛋白的70．4%，表明重组的EG2HSP70基因能在BL21中高效表达，表达的蛋白大部分以可溶性状态存在。亲和层析法纯化重组蛋白EG2HSP70，通过Western blot证实该重组蛋白能被细粒棘球蚴囊壁免疫兔血清识别。结论成功构建细粒棘球蚴中国大陆株pGEX-6P-1／EG2HSP70重组质粒，重组的EG2HSP70能够高效表达，表达的EG2HSP70具有免疫学活性。     

结核杆菌Mtb8.4抗原在大肠杆菌中表达的初步研究

目的构建结核杆菌低分子质量抗原Mtb8.4的原核表达质粒,并检测其在大肠杆菌中的表达。方法PCR扩增目的基因,克隆到质粒pETHisT7启动子的下游;酶切和PCR法鉴定重组子;阳性重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导后,SDSPAGE电泳分析。结果重组质粒pETHisMtb8.4成功构建,含阳性重组子的菌体蛋白经SDSPAGE电泳出现一新的蛋白带,与预计相符。结论初步证明构建的大肠杆菌重组体能够表达目的蛋白,为进一步对其免疫效应的研究奠定了基础。     

3种截短的泡球蚴Eml8基因原核表达质粒的构建、表达及鉴定

目的 构建3种截短的泡球蚴18（Eml8）基因的原核表达质粒，获得高效表达、有生物活性的3种重组蛋白，并对其进行初步鉴定。方法 DNAman软件设计引物，PCR法扩增并构建3种截短的pET41a-Eml8．1、Eml8．2和Eml8．3原核表达质粒，测序鉴定插入序列正确性；IPTG诱导、表达和纯化rEml8．1-GST、rEml8．2-GST和rEml8．3一GST重组蛋白，SDS-PAGE电泳及Westernblot进行初步鉴定。结果 成功构建了3种截短的pET41a—Eml8．1、Eml8．2和Eml8．3重组表达质粒；SDS-PAGE检测表明rEml8．1-GST、rEinl8．2-GST、rEml8．3-GST重组蛋白得到成功表达，在分子质量单位为41、45．5和45．5ku处有表达条带；Westernblot显示3种重组蛋白均能被AE病人血清识别。结论 成功构建了截短的pET41a-Eml8．1、pET41a-Eml8．2和pET41a—Eml8．3原核表达质粒，表达的3种重组蛋白均具有良好的抗原性，为Eml8抗原表位分析奠定了基础。