重组人α1-微球蛋白在毕赤酵母中的高效分泌性表达

目的 获得可溶、稳定、高纯度的α1-微球蛋白(α1-microglobulin,α1-MG),为临床检测标准品、质控品制备奠定基础.方法 制备构建重组人毕赤酵母真核分泌表达质粒,并对重组α1-MG进行诱导表达、纯化和鉴定.应用PCR方法扩增重组人α1-MG pET-15b质粒,得到N端带有6个组氨酸"标签"(6 × His-tag)的α1-MG融合基因,将该基因插入到真核酵母分泌表达质粒pPIC9中,筛选得到正确序列的重组分泌表达质粒pPIC9-MG、并转化毕赤酵母菌菌株GS115(Pichia pastoris GS115);用甲醇进行重组人α1-MG的诱导表达,摇瓶发酵,上清α1-MG含量测定;目的蛋白采用硫酸铵沉淀、一步亲和层析纯化并通过免疫学含量测定、PAGE电泳、Western blot以及生物质谱进行鉴定;初步进行稳定性观察.结果 成功构建了重组人α1-MG真核酵母表达载体,核酸测序与预测一致,并在毕赤酵母中实现了重组人α1-MG的分泌性表达,表达量可达73 mg/L,约占总蛋白的30%.经纯化及鉴定,得到了可溶性的、具有天然蛋白生物学活性的PAGE纯目的蛋白.结论 首次在毕赤酵母中实现重组人α1-MG的高效分泌性表达,表达目的蛋白具有良好的生物学活性、稳定性好、易纯化等优点.     

重组人胰腺α-淀粉酶在毕赤酵母菌中的分泌性表达

目的:构建人胰腺!-淀粉酶(HPA)真核表达载体并在毕赤酵母中进行表达。方法:从人胰腺组织中提取总RNA,逆转录为cDNA,RT-PCR法扩增HPA基因,将其插入到酵母分泌性表达质粒pPIC9中,筛选得到正确序列的重组质粒pPIC9-HPA,用该质粒转化毕赤酵母菌GS115,PCR方法筛选阳性克隆,摇瓶培养、0.5%甲醇诱导重组HPA分泌性表达,测定培养上清中的淀粉酶活力;重组HPA用冷乙醇-糖原亲和沉淀、疏水层析纯化并以SDS-PAGE电泳和Westernblot方法鉴定。结果:成功构建了重组HPA真核酵母表达载体,重组质粒酶切和核酸测序结果与预期一致,显示HPA基因正确插入质粒pPIC9中;以pPIC9-HPA转化毕赤酵母菌GS115,实现了重组HPA在毕赤酵母菌分泌性表达;重组HPA经纯化后鉴定具天然HPA相同的免疫原性,其对可溶性淀粉酶的水解产物和酶动力学分析与天然HPA相近。结论:成功实现了HPA在毕赤酵母真核表达系统中的分泌性表达,重组HPA与天然HPA具有相似的催化和酶动力学性质。本实验为下一步作为临床HPA测定标准品的研制准备了实验基础。     

趋化因子RANTES在毕赤酵母中的表达、纯化与鉴定

背景：RANTES是典型的趋化性细胞因子，参与很多炎症反应以及器官移植免疫排斥反应。从天然组织中分离RANTES数量有限，难以满足对其生物学功能研究和临床应用的需要：运用基因工程方法生产RANTES具有一定的应用价值。 目的：观察人体趋化因子RANTES基因在毕赤酵母体系中的分泌表达，获得重组RANTES蛋白。 设计、时间及地点：基因水平的实验观察，于2006—07／2007—10在重庆大学生物工程学院313实验室完成。 材料：新鲜人外周血取自志愿者，用以分析人体RANTES基因序列设计引物：质粒pPIC9K、毕赤酵母菌珠Pichia Pastoris GS115均由重庆大学生物工程学院313实验室保存。 方法：将人体趋化因子RANTES基因插入含AOXI启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中，用Sal I将重组质粒线性化，电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。 主要观察指标：趋化因子RANTES在毕赤酵母中的表达、纯化与鉴定结果。 结果：人体趋化因子RANTES在酵母培养基BMGY中实现了分泌表达，表达产物经SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳及Western blot鉴定为重组RANTES蛋白。 结论：在毕赤酵母真核系统中实现了人体趋化因子RANTES的分泌表达，为RANTES蛋白进一步的结构和功能研究打下了基础。     

重组人源甲胎蛋白在毕赤酵母中的高效表达及纯化

目的：从毕赤酵母GS115蛋白表达体系入手,实现人源甲胎蛋白（AFP）的重组克隆、异源高效表达、蛋白纯化并得到具有临床免疫原性的高纯度AFP。方法通过聚合酶链反应（PCR）从重组质粒pReceiver‐AFP扩增到目的基因片段,构建酵母重组表达质pPICZαA‐AFP,经测序比对与GenBank公开的AFP序列一致。将重组质粒pPICZαA‐AFP转入毕赤酵母GS115,通过甲醇诱导表达目的蛋白AFP。收集蛋白后用硫酸铵分级沉淀法对AFP进行纯化,高效液相色谱法（HPLC）检测纯度,在临床医院通过电化学发光法对其蛋白含量定值。结果研究发现AFP在酵母GS115中经甲醇诱导表达主要分泌到胞外培养基上清,免疫印迹试验能够检测到AFP蛋白条带,经硫酸铵分级沉淀,87％AFP目的蛋白存在于55％硫酸铵沉淀集份,HPLC检测其纯度为98．844％,电化学发光法检测其水平为3473ng／mL。最后与临床肝癌患者血清标本比对,蛋白的相对分子质量大小一致,表明其糖基化水平与临床标本相当。结论通过毕赤酵母甲醇诱导表达系统可以制备高纯度的、具有生物活性的、可用于肿瘤临床检测的AFP标准物质及其可以溯源的校准品、质控品和相关诊断试剂。     

pPICZαA-CDK2重组质粒的构建及表达

目的:构建含有细胞周期依赖性激酶2(CDK2)的胞外分泌型pPICZαA-CDK2重组质粒,利用毕赤酵母表达体系表达CDK2蛋白。方法:从人白细胞中提取总RNA,逆转录后采用聚合酶链反应扩增出CDK2基因,并将其插入pPICZαA质粒,构建重组质粒,化学法转化大肠杆菌JM109进行克隆。重组质粒pPICZαA-CDK2转化毕赤酵母菌株GS115,甲醇诱导酵母细胞进行蛋白表达,SDS-PAGE和Western-Blot鉴定蛋白表达情况及抗原性。结果:PCR电泳及DNA测序证实CDK2基因已正确克隆到表达载体中;重组质粒转入酵母菌GS115,酵母经甲醇诱导表达后经SDS-PAGE检测发现在34000左右有条带,Western-Blot检测发现有与CDK2单抗结合蛋白。结论:成功构建重组质粒,初步判断CDK2全长蛋白在毕赤酵母中表达成功且抗原性良好。     

人内皮抑素-白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达与鉴定

目的构建编码人内皮抑素-白蛋白的融合基因,并在毕赤酵母(pichia pastoris)中获得高效表达。方法通过重叠延伸PCR的方法 ,构建编码人内皮抑素-白蛋白的融合基因,并克隆至pGEM-T载体中,测序正确后,将其亚克隆至酵母表达载体pPIC9中,然后将鉴定正确的重组表达载体pPIC9/ES-HSA线性化后转化入GS115宿主菌。采用原位双膜法筛选高表达菌株,对高表达菌株进行扩大培养,将表达上清液盐析后分别经阳离子交换层析、阴离子交换层析和亲和层析纯化,获得了重组融合蛋白,采用MTT法测定融合蛋白中内皮抑素的活性。结果成功构建了人内皮抑素-白蛋白融合基因和重组表达质粒pPIC9/ES-HSA,并筛选到表达较为理想的重组菌株pPIC9/ES-HSA/GS115,经甲醇诱导表达后纯化,融合蛋白的纯度达到92%以上,并具有抑制人血管内皮细胞系ECV-304细胞的增殖活性。结论本方法可成功获得具有人内皮抑素生物活性的重组人内皮抑素-人血清白蛋白融合蛋白。     

人源多肽抗生素LL-37真核表达载体的构建

目的 构建抗菌肽LL-37的表达载体pPIC9-LL-37,转化毕赤酵母GS115以获得表达LL-37的工程菌.方法 通过重叠区扩增法人工合成抗菌肽LL-37的基因,定向克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9上,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,PCR鉴定及序列分析后转化毕赤酵母GS115.MM、MD平板筛选His^＋Mut^＋、His^＋Mut^-表型,PCR扩增鉴定基因的插入.结果 PCR鉴定及序列分析表明抗菌肽LL-37基因正确插入载体pPIC9,MM、MD平板筛选及PCR鉴定获得10个His^＋Mut^＋、9个His^＋Mut^-克隆.结论 获得含LL-37基因的工程菌.     

人干燥综合征抗原A毕赤酵母分泌型表达载体的构建

目的:构建表达人干燥综合征抗原A(SSA)的毕赤酵母分泌型表达载体.方法:以人白血病淋巴细胞HL-60株cDNA为模板,RCR扩增目的基因SSA,纯化,双酶切,DNA浓缩回收,插入酵母分泌型表达载体pPIC9k,热冲击法转化感受态大肠杆菌JM109,阳性克隆提取质粒,双酶切鉴定并测序.结果:PCR产物大小符合要求,重组质粒pPIC9k-SSA双酶切鉴定与预期一致,测序结果正确.结论:成功构建SSA毕赤酵母分泌型表达载体,为下一步取代从动物胸腺中人工提取低纯度、低产量的SSA抗原,研制新型抗SSA诊断试剂盒打下基础.     

Stathmin基因毕赤酵母表达体系的构建及鉴定

目的构建Stathmin基因毕赤酵母表达体系,并对表达产物进行纯化和鉴定,为Stathmin相互作用蛋白的进一步研究提供实验基础。方法通过PCR方法从SKBR3乳腺癌细胞中扩增出人Stathmin基因片段,克隆入毕赤酵母表达载体pPIC3.5K,构建重组载体pPIC3.5K-Stathmin,转化GS115工程菌,经含基因素(G418)的酵母膏胨葡萄糖琼脂(YPD)培养基筛选出阳性克隆。用0.5%甲醇诱导表达,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western Blotting鉴定表达产物。结果 DNA测序结果表明,所获基因片段与Stathmin基因序列一致。在含有G418 600μg/mL的YPD培养基上筛选出的pPIC3.5K-Stathmin转化子,经PCR鉴定为阳性克隆。SDS-PAGE可见约37×103处有目的条带表达,经Western Blotting鉴定,此条带为Stathmin蛋白。结论成功构建了Stathmin酵母表达载体,并在毕赤酵母中表达成功,为Stathmin相互作用蛋白研究以及生物治疗药物的制备奠定了基础。     

血栓调节蛋白表皮生长因子样结构功能域在毕赤酵母中的表达

目的 :构建血栓调节蛋白表皮生长因子样结构功能域(thrombomodulin-domain 2,TM-D2)的毕赤酵母表达体系,以获得重组TM-D2蛋白。方法:以人cDNA序列为模板,用PCR扩增出TM-D2片段,并将其插入pPICZaB质粒,构建重组表达质粒TM-D2-pPICZaB,重组质粒电击转化入毕赤酵母菌株GS115,用甲醇诱导酵母进行蛋白表达,行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白印迹法鉴定蛋白表达及纯化情况。结果:PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和质粒测序证实,TM-D2片段已正确克隆到表达载体中;SDS-PAGE和蛋白印迹法检测结果证实,上清液中含His-tag的重组TM-D2的表达,且其相对分子质量约为55 000。结论:TM-D2-pPICZaB初步判断TM-D2蛋白可在毕赤酵母中表达。     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及其活性检测

目的用PCR技术特异扩增人溶菌酶基因hLYz cDNA序列,克隆至质粒pMD18一T中,获得重组质粒pMD18-T-hLYZ。方法采用EcoRⅠ／NotⅠ双酶切及PCR确认正确后,将人溶菌酶基因cDNA目的片段亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k中,通过电穿孔法转化毕赤酵母菌GS115,获得重组质粒pPIC9k-hLYZ,采用EcoRⅠ／NotⅠ双酶切法及DNA测序证明cDNA序列完全正确,在毕赤酵母菌中诱导表达产物经SDS-PAGE电泳分析,结果表明表达产物与预期大小的hLYZ蛋白分子量一致,采用微球菌溶解法进行抑菌活性测定。结论证实具有明显的抑菌作用。     

重组血小板第4因子在甲醇酵母中的高效表达

目的 利用甲醇酵母高效表达重组人血小板第4因子（rhPF4)。方法 用PCR方法扩增出血小板第4因子（PF4）cDNA序列，插入到穿梭质粒pPIC9的MFα信号肽后，在醇氧化脱氢酶1（AOX1）启动子的下游，得到重组质粒pPIC9-PF4，转化到甲醇酵母宿主菌GS115，经筛选得到PF4高表达菌株进行表达，并测定表达产物氨基酸序列和生物学功能。结果 rhPF4氨基酸序列与天然PF4相同，可中和肝素抗凝作用，并呈剂量相关。结论 rhPF4可在甲醇酵母中获得生产规模表达，产物性质和天然的PF4相同。     

SSA抗原真核表达载体的构建

目的：通过基因克隆构建表达人干燥综合征抗原A（SSA）的巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体。方法：从人白血病淋巴细胞HL60株中提取RNA，反转录出cDNA，然后以cDNA为模板，通过PCR法扩增目的基因SSA，经纯化、双酶切、DNA浓缩回收，插入到酵母分泌型表达载体pPIC9k，用热冲击法转化感受态细胞DH5a，筛选阳性克隆提取质粒，双酶切鉴定并测序。结果：PCR产物大小符合要求，重组质粒pPIC9k-SSA双酶切鉴定与预期一致，测序结果正确。结论：成功构建SSA毕赤酵母分泌型表达载体，为今后获取高纯度、高产量的SSA抗原，研制新型抗SSA诊断试剂盒作前期准备。     

人LYVE-1的基因克隆及其在毕赤甲醇酵母细胞中的表达鉴定

目的获得可溶、稳定、与人淋巴管内皮特异性透明质酸受体（LYVE-1）具备相同抗原性的重组人LYVE-1,为进一步研究LYVE-1在淋巴管形成中的作用及临床肿瘤免疫学诊断打下基础、提供材料。方法采用逆转录-酶链聚合反应（RT-PCR）自人淋巴结获得LYVE-1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPICZα,构建含人LYVE-1的重组质粒（pPICZα-LYVE-1）;经全自动序列分析仪测序确证后,将此重组质粒转化入毕赤甲醇酵母细胞（GS115）中进行诱导表达,表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析及免疫印迹试验（Western blot）鉴定。结果经甲醇诱导的含pPICZα-LYVE-1的酵母细胞表达出重组人LYVE-1的融合蛋白,此蛋白在凝胶上表现为一约70000的区带,在Western blot实验中可被LYVE-1的特异多克隆抗体识别。结论人LYVE-1融合蛋白在酵母表达系统中高水平表达,并具有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

人LYVE-1的基因克隆及其在毕赤甲醇酵母细胞中的表达鉴定

目的获得可溶、稳定、与人淋巴管内皮特异性透明质酸受体(LYVE-1)具备相同抗原性的重组人LYVE-1,为进一步研究LYVE-1在淋巴管形成中的作用及临床肿瘤免疫学诊断打下基础、提供材料。方法采用逆转录-酶链聚合反应(RT-PCR)自人淋巴结获得LYVE-1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPICZα,构建含人LYVE-1的重组质粒(pPICZα-LYVE-1);经全自动序列分析仪测序确证后,将此重组质粒转化入毕赤甲醇酵母细胞(GS115)中进行诱导表达,表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析及免疫印迹试验(Western blot)鉴定。结果经甲醇诱导的含pPICZα-LYVE-1的酵母细胞表达出重组人LYVE-1的融合蛋白,此蛋白在凝胶上表现为一约70 000的区带,在Western blot实验中可被LYVE-1的特异多克隆抗体识别。结论人LYVE-1融合蛋白在酵母表达系统中高水平表达,并具有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

重组人胱蛋白酶抑制剂C在毕氏酵母菌中的高效表达

目的：构建人胱蛋白酶抑制剂C（Cystatin C)的表达载体并进行蛋白的初步纯化。方法：用逆转录聚合酶链反应从人胎盘组织中扩增含有380bp的Cystatin C cDNA基因片段，并将其插入到pPIC9质粒中，携带有Cystatin C片段的pPIC9质粒转化毕氏酵母菌菌株GS115，醇氧化脱氢酶1（AOX1）启动子被甲醇诱导而产生可溶性Cystatin C.重组Cystatin C采用Hitrap-SP阳离子交换柱进行初步纯化。结果：核酸序列测定与预期一致。Cystatin C 表达水平达到16mg/L，约占菌体总可溶性蛋白的60％，蛋白纯化回收率为40．5％，Cystatin C在表达体系中至少可稳定3d，结论：Cystatin C在毕氏酵母力胞外有较高水平的分泌，既可作为抗原免疫动物获取抗体，也可作为测定的标准品，为今后进行国产Cystatin C免疫学测定剂研制奠定了基础。     

融合蛋白hJagged1^ext-Fc毕赤酵母表达载体的构建及表达

本研究旨在构建人IgG1 Fc蛋白及融合蛋白hJagged1^ext-Fc，并在毕赤酵母GS115中表达。用RT—PCR法从人骨髓细胞中扩增hJagged1基因的胞外段。在测序正确后，将hJagged1基因的胞外段插入构建好的PIC—Fc载体，得到PIC—hJagged1^ext-Fc。用MD平板筛选重组子，G418法筛选高拷贝转化子，经甲醇诱导表达后，采用SDS—PAGE分析表达蛋白。结果表明：hJagged1基因的胞外段被有效地扩增。序列分析显示所构建的含phJagged1^ext-Fc融合基因的质粒与设计相同，人IgG1Fc蛋白及融合蛋白hJagged11^extFc得到正确表达。结论：成功地构建了hJagged1^ext-Fc融合基因的毕赤酵母表达载体，并在毕赤酵母中正确表达，为进一步研究Jagged1在造血干／祖细胞的体外扩增奠定了基础。     

融合蛋白hJagged1^ext-Fc毕赤酵母表达载体的构建及表达

本研究旨在构建人IgG1 Fc蛋白及融合蛋白hJagged1^ext-Fc，并在毕赤酵母GS115中表达。用RT—PCR法从人骨髓细胞中扩增hJagged1基因的胞外段。在测序正确后，将hJagged1基因的胞外段插入构建好的PIC—Fc载体，得到PIC—hJagged1^ext-Fc。用MD平板筛选重组子，G418法筛选高拷贝转化子，经甲醇诱导表达后，采用SDS—PAGE分析表达蛋白。结果表明：hJagged1基因的胞外段被有效地扩增。序列分析显示所构建的含phJagged1^ext-Fc融合基因的质粒与设计相同，人IgG1Fc蛋白及融合蛋白hJagged11^extFc得到正确表达。结论：成功地构建了hJagged1^ext-Fc融合基因的毕赤酵母表达载体，并在毕赤酵母中正确表达，为进一步研究Jagged1在造血干／祖细胞的体外扩增奠定了基础。     

乙型肝炎病毒合成e基因在毕赤酵母中的表达及产物免疫学特性

目的 合成适合酵母表达的乙型肝炎病毒（HBV）e抗原基因，在毕赤酵母中表达出高免疫反应性和特异性的重组乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）。方法 采取基因搭桥法及Taq酶聚合反应，选用酵母菌偏爱的同义密码子替换野生型e基因的部分密码子，制备合成e基因，插入pPICZαA酵母菌表达载体。携带有合成e基因的pPICZαA转化毕赤酵母菌株GS115，经甲醇诱导表达HBeAg。结果 酶切电泳及DNA测序证实合成的e基因已正确克隆到表达载体中；聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）、immunoblt及ELISA显示HBeAg在毕赤酵母中高效分泌表达，表达量约为63mg／L，培养上清液ELISA测定效价1：81920，最大吸光度值达2．8；重组HBeAg与乙型肝炎病毒核心抗体间无交叉反应。结论 毕赤酵母表达系统高效分泌表达出与乙型肝炎病毒核心抗原间无交叉抗原性、具有良好免疫反应性的HBeAg。     

重组人uPA_(17)-KPI在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的研究重组人尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator,uPA)-Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂(Kunitz protease inhibitor,KPI)融合蛋白在毕赤酵母中分泌表达的条件。方法利用已构建的KPI-pPICZαC毕赤酵母表达载体,人工合成uPA17,利用基因重组技术构建uPA17-KPI-pPICZαC表达载体。电转化毕赤酵母菌X-33,PCR法筛选阳性克隆,分别用SDS-PAGE、胰蛋白酶抑制实验分析鉴定发酵产物。结果酶切鉴定和DNA测序证实,成功构建uPA17-KPI-pPICZαC表达载体。SDS-PAGE分析在相对分子质量约8 800处出现目的条带,摇瓶水平诱导表达120 h表达量达到高峰,含量可达50 mg/L。表达产物具有胰蛋白酶抑制活性。结论本研究在毕赤酵母中成功表达uPA17-KPI融合蛋白。