脐带间充质干细胞支持脐血单个核细胞冻存复苏后的体外生长

目的:研究人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,h UC-MSC)对冻存复苏后脐血单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)体外生长的支持作用,以提高冷冻损伤后的造血细胞在体外的生存率。方法:用组织块培养法分离获得h UC-MSC,流式细胞仪检测其表面分子并诱导分化进行鉴定。分两组培养冻存复苏后的脐血MNCs:一组以h UC-MSC为滋养层共培养,另一组单独培养。光镜下观察两组MNCs密度。培养第10天,流式细胞仪检测两组造血细胞的百分比,并计数MNCs总数和造血细胞数进行对比。结果:成功分离培养获得h UC-MSC,符合各项鉴定标准。共培养组MNCs总数、CD45、CD14及CD19阳性造血细胞数均明显多于单培养组。结论:h UC-MSC可有效支持冻存复苏后脐血MNCs的体外生长。     

脐血间充质干细胞对脐血单个核细胞体外扩增的支持作用

目的探讨脐血源间充质干细胞（mesenchymal stem cells derived fromumbilical cord blood,UCB—MSCs）联合外源性细胞因子对脐血单个核细胞（umbilical cord blood mononuclear cells,UCB—MNCs）体外扩增的支持作用。方法从脐血中培养出UCB—MSCs,检测其表面抗原,并以此作为滋养层细胞,将UCB—MNCs接种于无血清培养体系中培养10d,检测有核细胞总数（MNCs）、CD34^＋．CD133^＋细胞数、集落形成单位数（CFU）和（G—M＋S）期细胞含量的变化。结果从脐血分离、培养出UCB—MSCs,稳定表达CD29、CD105和CD44,不表达CD34和CD133。外源性细胞因子及UCB—MSCs均支持UCB—MNCs的扩增,但以细胞因子联合UCB—MSCs组效果最好（P〈0．05）。结论从脐血中能成功分离培养出间充质干细胞,并完成细胞表型的初步鉴定。外源性细胞因子联合UCB—MSCs可有效扩增UCB—MNCs。     

人胎盘源间充质干细胞对脐血单核源树突状细胞体外成熟的调节作用

目的探讨人胎盘源间充质干细胞（PMSCs）对单核源树突状细胞（mono-DCs）体外成熟的影响。方法采用密度梯度离心法分离人脐血单核细胞,在人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）和人白细胞介素-4（hIL-4）刺激下获得大量未成熟DCs。将DCs和PMSCs共培养4 d,同时加入LPS刺激,分别通过倒置显微镜、流式细胞仪和混合淋巴反应（MLR）检测DCs的成熟。结果共培养DCs呈散在分布,细胞边缘圆滑;与成熟DCs相比,其表面CD80、CD86、CD83、CD40的表达明显较低,而CD14的表达较高;共培养组DCs刺激同种异型淋巴细胞增殖的能力在各个浓度均明显低于对照组（均P〈0.05）。结论 PMSCs可以明显抑制脐血单核源DCs的体外成熟。     

异基因人骨髓间充质干细胞与外周血单个核细胞体外共培养的相互影响

目的：探讨异基因骨髓间充质干细胞（BMSC）与外周血单个核细胞（PBMC）在体外共培养的相互影响。方法将异基因成人来源的BMSC与PBMC在体外分别按1：10混合共培养,采用氚胸腺嘧啶核甙掺入方法检测PHA刺激PBMC增殖的活性,采用ELISA方法检测培养液中分泌的IL-6、IL-8和PGE2水平。结果 BMSC与PBMC共培养组的PBMC增殖率明显减少（P〈0.01）,抑制率均超过50%。加入PBMC共培养后,BMSC分泌IL-6、IL-8和PGE2显著增加（P〈0.01）。结论 BMSC可以抑制PHA刺激引起的PBMC增殖,PBMC可以促进BMSC分泌免疫活性因子,BMSC可能具有双向的免疫调控作用。     

人骨髓间充质干细胞对脐血干细胞体外扩增支持作用的研究

目的：探讨以人骨髓间充质干细胞(bone nlarrow-mesenchymal stem cells，BM-MSC)为基质的无血清培养方法，体外扩增脐血造血干细胞(cord blood stem cells，CBSC)，研究BM—MSC支持造血的功能，以能最终用于临床。方法：用含血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、fit3／flk2配体(FL)和粒细胞-集落刺激因子(G—CSF)的无血清培养液，比较有或无MSC条件下，体外扩增脐血CD34^ 细胞两周后检测总细胞TC、CD34^ 细胞、集落形成单位(CFU)和长期培养-起始细胞(LTC—IC)增加倍数。结果：在TPO、FL、SCF、和G-CSF的作用下，经两周体外扩增后有MSC组的TC、CD34^ 细胞、CFU—GM、CFU—C和LTC—IC数较起始分别增加了427、39、125、104和16倍。单纯用上述4种细胞因子的无MSC组，TC、CD34^ 细胞、CFU—GM、CFU—C数分别增加了62、11、25、24倍，但LTC-IC只有扩增前的0．8倍。结论：以人BM—MSC为基质的无血清体外培养体系可以更有效扩增CBSC，有潜在的临床应用价值。     

人脐血间充质干细胞体外分离、培养与鉴定

目的 建立体外分离和培养人脐血间充质干细胞的方法,并探讨脐血间充质干细胞是否具有与骨髓间充质干细胞相一致的免疫表型.方法 无菌条件下采集正常产胎儿脐血,用相对密度为1.077的淋巴细胞分离液分离脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB-MSCs),采用贴壁培养法获得MSCs,体外培养并对其增殖进行观察.用流式细胞仪检测细胞周期状态和白细胞表面抗原.结果 来源于脐血的MSCs在含有15%胎牛血清和低糖DMEM培养基中可以贴壁,并表现为间充质样细胞;传3代后,此类细胞可以纯化、扩增;其细胞倍增时间为60h左右.流式细胞分析细胞周期显示大部分细胞(85%)处于G0/G1期;此类细胞稳定地表达相关的抗原标记CD29、CD44、CD54、CD105,但不表达造血细胞系的表面标记CD34、CD45.结论 脐血中可培养出非造血干细胞,其白细胞表面抗原表达与骨髓间充质干细胞有较强的一致性.     

人脐血间充质干细胞的体外分离、培养

目的:研究脐带血间充质干细胞体外分离、培养条件,探讨脐带血间充质千细胞作为细胞治疗种子细胞的可行性.方法:采用不同的实验方法对36例脐血间充质干细胞分离、培养,并与11份骨髓间充质进行对比,探索脐血间充质干细胞的最适培养条件.结果:采用甲基纤维素分离的间接法显著提高了脐血间充质干细胞分离培养的成功率;增加单个核细胞的接种最和适当的血清浓度促进了脐血间充质干细胞的成功培养.结论:脐血间充质干细胞能在体外分离纯化,但培养成功率明显低于骨髓,受多种因素影响.     

胎盘问充质干细胞对骨髓、脐血、胎盘不同来源造血干细胞的体外扩增支持作用比较

目的研究胎盘间充质干细胞（PDMSC）对骨髓、脐血、胎盘来源的CD34^＋造血干细胞体外扩增的支持作用。方法用酶消化方法从胎盘组织分离出贴壁细胞。流式细胞仪测定。用免疫磁珠法从骨髓、脐血、胎盘的单个核细胞里分离出CD34^＋细胞,建立以HPDMSC饲养层的CD34^＋细胞培养体系,并以无饲养层的培养体系作为对照。结果人胎盘中可以分离出hpdmscs,并可以证明其为间充质干细胞。以HPDMSCS作为以上三种来源的造血干细胞的滋养层,对胎盘来源的造血干细胞支持作用明显优于其他两组,脐血次之,骨髓来源的造血干细胞最差。结论胎盘间充质干细胞具有体外造血支持作用,可以作为骨髓、脐血、胎盘不同来源造血干细胞体外扩增的滋养层,尤其适于胎盘来源的造血干细胞。     

成人脂肪源间充质干细胞培养上清对人脐血间充质干细胞体外培养及扩增的支持作用

目的：研究人脂肪间充质干细胞培养上清对人脐带血（HUCB）中所含有间充质干细胞（MSCs）的影响。方法：取脐带血,肝素抗凝,Percoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,低糖DMEM培养获得贴壁细胞层。与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育。流式细胞仪检测表面抗原。结果：脐带血的单个核细胞与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育经体外培养贴壁后出现形似纤维状细胞形态并表达与MSCs相关的抗原（CD13,CD44,CD71,CD166）,但不表达造血细胞抗原（CD34,CD45）,这与源于骨髓的MSCs一致。结论：人脐血间充质干细胞与脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育,对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用。     

体外定向诱导人胎盘源间充质干细胞向内皮细胞分化

目的：探讨人胎盘源间充质干细胞（HPMSCS）在特定环境诱导下向内皮细胞分化的潜能，为其促进创伤愈合提供理论依据。方法：在患者知情同意的情况下，从足月分娩产妇娩出的胎盘组织中分离培养HPMSCS，通过倒置显微镜观察其生物学形态，利用流式细胞术检测其表面标志，并通过成骨诱导鉴定及成脂肪诱导鉴定确定其多向分化潜能。对鉴定后的HPMSCS在体外通过内皮细胞诱导液使之向内皮细胞分化，并对诱导后细胞进行细胞化学荧光染色，检测内皮细胞特异性Ⅷ因子（vWF）的表达；采用流式细胞术检测诱导后细胞表面标志，观察是否具有内皮细胞表型。结果：HPMSCS在培养基中持续培养后,形态由成纤维细胞样转变为类似内皮细胞的铺路石样结构。成熟内皮细胞特异的表面标志vWF为阳性表达。流式细胞术检测结果显示：CD31及CD34均有表达。结论：本诱导方案能够诱导HPMSCS出现内皮细胞表型,提示HPMSCS在体外特定条件下具有定向分化为内皮细胞的潜能。     

人脐血间质干细胞一般特性及其多向分化潜能

 【目的】观察人脐血间质干细胞增殖能力、细胞表面分子标志及多向分化潜能。【方法】从人脐血中分离出单个核贴壁细胞并进行体外培养。将细胞以单克隆抗体标记后用流式细胞仪进行检测。向培养细胞中加入成骨、成软骨和成脂肪诱导剂，检测其多向分化能力。【结果】脐血间质干细胞原代培养时间为7周。流式细胞分析显示这些细胞CD29、CD13、CD44等表达为阳性，但是它们不表达造血干细胞表面标志物。加入成骨诱导剂会导致细胞碱性磷酸酶的表达。采用微球培养法并加入软骨诱导剂对细胞进行诱导，用阿尔新蓝染色显示有蛋白多糖表达。在加入成脂诱导剂后，会导致细胞形态学改变，且油红O染色为阳性。【结论】通过体外传代培养的方法可以从人脐血单个核贴壁细胞中得到纯化的间质干细胞。脐血有望成为间质干细胞的替代来源。     

人脐血间质干细胞一般特性及其多向分化潜能

【目的】观察人脐血间质干细胞增殖能力、细胞表面分子标志及多向分化潜能。【方法】从人脐血中分离出单个核贴壁细胞并进行体外培养。将细胞以单克隆抗体标记后用流式细胞仪进行检测。向培养细胞中加入成骨、成软骨和成脂肪诱导剂，检测其多向分化能力。【结果】脐血间质干细胞原代培养时间为7周。流式细胞分析显示这些细胞CD29、CD13、CD44等表达为阳性，但是它们不表达造血干细胞表面标志物。加入成骨诱导剂会导致细胞碱性磷酸酶的表达。采用微球培养法并加入软骨诱导剂对细胞进行诱导，用阿尔新蓝染色显示有蛋白多糖表达。在加入成脂诱导剂后，会导致细胞形态学改变，且油红O染色为阳性。【结论】通过体外传代培养的方法可以从人脐血单个核贴壁细胞中得到纯化的间质干细胞。脐血有望成为间质干细胞的替代来源。     

人脐血间充质干细胞的分离与纯化

目的:探讨人脐血间充质干细胞(MSC)的培养纯化条件。方法:比较不同的梯度离心速度及时间、接种密度、首次换液时间、不同培养基对脐血中的MSC分离及原代培养过程的影响,以流式细胞仪对优化条件下培养的MSC进行细胞周期分析,并对细胞表面标志进行检测。结果:在其他条件不变的情况下,以1 000g×15 min的梯度离心速度及时间分离脐血为最宜,5×106/mL是脐血MSC培养的适宜接种密度,首次换液时间7 d。优化条件下培养的MSC传至3代时,几乎全部强表达CD29、CD44。结论:建立了一种优化的人脐血MSC分离纯化方法。     

人脐带间充质干细胞分离扩增方法的优化

【目的】 探究一种高效稳定分离、扩增人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）的方法。【方法】取材脐带20条,获得Wharton’s Jelly组织,分别用酶联合消化法（12例）和酶序贯消化法（8例）来分离、提取hUC-MSCs,比较两种方法分离hUC-MSCs的成功率、原代培养时间及获得的细胞数量;利用低糖DMEM（LG-DMEM）完全培养基和LD-Mesen培养基（MesenPro RSTM与LG-DMEM的混合培养基）分别培养hUC-MSCs,比较两种培养体系的扩增效率。对所获取细胞的免疫表型以流式细胞术进行鉴定,并诱导成脂、成骨分化验证其多向分化潜能。【结果】 酶联合消化法和酶序贯消化法成功率分别为100%（12/12）和12.5%（1/8）,二者相比有显著统计学差异（P=1.03×10-4）,前者原代培养平均时间为（14.17±1.14）d,获得细胞（1.30±0.14）×106个。2×105个hUC-MSCs用LD-Mesen和LG-DMEM两种体系培养12d后,扩增所得的细胞数分别为(14.86±0.08)×106和(5.08±0.08)×106,二者有显著统计学差异（P=1.38×10-8)。hUC-MSCs高表达CD73、CD105、CD90、CD29、CD44,不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR;并可向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化。【结论】 酶联合消化Wharton’s Jelly组织并以LD-Mesen体系进行扩增可高效获取hUC-MSCs,效率明显优于传统方法。     

脐血间充质干细胞肌源性诱导分化的研究

目的研究脐血间充质干细胞 (MSC)体外的采集、培养和扩增 ,探讨MSC肌源性分化的条件和能力。方法选择杂种妊娠犬 11只 ,采集适量脐带血 ,常规分离后获得单核细胞 ,分别接种于不同的培养液中进行培养和体外传代扩增。免疫组织化学检测脐血MSC表面抗原的表达 ;5 -氮杂胞嘧啶核苷 (5 aza)诱导处理脐血MSC ,观察细胞形态结构的变化及肌源性标记物的表达。结果犬脐血MSC在IMDM中生长良好 ,增殖迅速 ,每传一代细胞扩增 2 ～3倍 ,传至 7代后细胞可扩增 1.5× 10 2～2 .0× 10 3 倍 ;脐血中包含破骨细胞样和纤维母细胞样贴壁细胞 ,后者CD2 9和CD71表达阳性 ,CD11a、CD11b和CD34表达阴性 ;脐血MSC在 10μmol/L的 5 aza诱导 3周后体积延长 ,与邻近细胞形成连接 ,并表达肌节性肌动蛋白和结蛋白 ,与阳性对照结果相似。 结论脐血MSC是存在于脐血中的一类不同于造血干细胞的原始细胞 ,在体外可大量扩增 ,在诱导剂的作用下向肌源性定向分化     

脐带源间充质干细胞的分离和生物学性状

目的建立从脐带分离间充质干细胞的方法,并研究其生物学性状。方法脐带经酶消化后于DMEMLG/F12培养基中培养,倒置显微镜及电镜观察细胞形态学,细胞计数绘制细胞生长曲线,计数成纤维细胞集落形成单位(CFUF),流式细胞仪测定细胞周期及细胞免疫表型,免疫组织化学染色及RTPCR检测其体外诱导成脂肪和成骨分化的能力,RTPCR检测其细胞因子的分泌,与脐血来源CD34+细胞共同培养检测其支持造血的能力。结果经酶消化后,每cm脐带可得到中位数为1.01×106的有核细胞,CFUF产率为1/1609有核细胞,经贴壁传代可分离出成纤维样细胞,细胞倍增时间为(28.02±10.53)h。流式细胞仪分析细胞周期显示,>80%的细胞处于G0/G1期,S+G2+M期的细胞仅占(13.04±4.31)%。免疫表型分析显示,CD13、CD29、CD44、CD105(SH2)、CD73(SH3)、CD166和MHCI阳性,CD45、CD34、CD38、CD31和MHCⅡ阴性。体外诱导实验证实,该细胞具有成脂肪和成骨分化的能力。RTPCR显示,该细胞表达干细胞因子、血小板生成素,酪氨酸激酶受体配基、白细胞介素6、巨噬细胞集落刺激因子、白血病抑制因子、基质细胞衍生因子和血管内皮细胞生长因子,不表达白细胞介素3。与脐血来源CD34+细胞共同培养2周可见鹅卵石形成区,共培养8周证实其支持长期造血能力。结论建立从脐带中分离间充质干细胞的方法,脐带是间充质干细胞的新的来源。     

OECs无血清上清液体外诱导UB-MSCs向神经细胞分化

目的:观察大鼠嗅鞘细胞无血清上清液诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化的作用。方法:采用差速贴壁联合阿糖胞苷抑制法获得较高纯度的嗅鞘细胞,在最佳状态细胞无血清培养后取上清液。收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,采用差速贴壁法纯化间充质干细胞,传第三代后用上述收集的嗅鞘细胞无血清上清液诱导,观察诱导分化过程,免疫组化鉴定分化结果。结果:用差速贴壁和阿糖胞苷抑制法可获得纯度高达95%的嗅鞘细胞,使用无血清嗅鞘细胞上清液培养脐血间充质干细胞后,发现能诱导脐血间充质干细胞向神经细胞形态分化,胞体呈椭圆形,伸出长突起。诱导7天后相差显微镜下可观察到神经干细胞、神经元和胶质细胞形态的细胞,与NSE、GFAP细胞免疫组化结果一致。结论:大鼠嗅鞘细胞无血清上清液有明显诱导脐血间充质干细胞分化为神经细胞的作用。     

人脐带间充质干细胞致瘤性试验

目的:观察人脐带间充质干细胞对裸鼠的致瘤性。方法:培养扩增人脐带来源的间充质干细胞,制备成细胞生理盐水混悬液注射裸鼠。观察8周裸鼠体内有无肿瘤生长。结果:裸鼠注射细胞后无明显不适,8周观察期内裸鼠体内未见肿瘤生长,病理组织学检测未见异常。结论:人脐带间充质干细胞导致肿瘤发生的可能性低。     

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞,接种含10％胎牛血清的DMEM培养基中。单个核细胞行贴壁培养后,进行细胞形态学观察,绘制细胞生长曲线,分析细胞周期,检测细胞表面抗原。结果采用Percoll（1．073g／mL）分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀,梭形或星形的成纤维细胞样细胞。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期,至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50％～70％细胞为CD29和CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定,可作为组织工程的种子细胞。