O1群小川型霍乱弧菌单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗O1群小川型霍乱弧菌(VibriocholeraeO1serotypeOgawa)特异性单克隆抗体(McAb),为霍乱的早期快速诊断提供有力的抗体工具。方法以灭活的O1群小川型霍乱弧菌免疫Balbc小鼠,通过杂交瘤技术制备针对O1群小川型霍乱弧菌的McAb,以间接ELISA法对所需的杂交瘤细胞株进行筛选,分析其亚类,检测其效价及相对亲和力,以间接ELISA和Westernblot鉴定McAb特异性,并进行McAb结合表位分析。结果融合了602株能分泌抗O1群小川型霍乱弧菌McAb的杂交瘤细胞株,最后得到5株能稳定分泌特异性的针对该McAb的细胞株,其抗体亚类分别为3株IgG1,1株IgG2b,1株IgG3;腹水效价均达1×10-6;亲和常数在1×108～1×109之间。间接ELISA法及Westernblot证实所获的McAb可与O1群小川型霍乱弧菌发生特异性反应。ELISA相加实验结果显示除有2株McAb识别相同的抗原表位外,其余均识别不同的抗原表位。结论获得霍乱弧菌O1群小川型特异性McAb,为O1群小川型霍乱早期快速诊断和发病机理的研究提供基础。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其特性鉴定

为制备抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDHp)单克隆抗体（McAb),并对其特异性进行鉴定。用纯化的LDHp重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,筛选出分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA,Westen blotting试验分析其特异性。结果,制备出2A5和1H10两株能稳定分泌抗LDHpMcAb的杂交瘤细胞株,两株单抗均为IgG2b,2A5和1H10培养上清的ELISA效价分别为1：512和1：256,腹水效价分别为1：25600和1：12800,两株单抗与间日疟,红细胞,弓形虫,日本血吸虫等抗原均不发生交叉反应,能识别恶性疟原虫的33Kda虫源蛋白。证明制备的抗LDHp杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗。     

抗伏马菌素B_1单克隆抗体的制备及鉴定

目的建立抗伏马菌素B1（FB1）的单克隆杂交瘤细胞株,制备抗FB1的单克隆抗体（McAb）。方法采用FB1-KLH偶联物小剂量长周期免疫BALB/c小鼠后,采用细胞融合方法获得分泌抗FB1的杂交瘤细胞株,采用多次亚克隆的方法建立了4株稳定分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株。腹水诱生法获得大量McAb,采用抗体亚类测定试剂盒鉴定抗体的亚类,SDS-PAGE测定抗体分子量,McAb的特异性和灵敏度用间接竞争抑制ELISA。结果免疫小鼠血清检测结果显示经过5次免疫后血清的效价稳定在1×10-6,经过4次亚克隆后建立4株稳定分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株,获得腹水,纯化抗体,抗体亚类属于IgG2a类,轻链为κ,轻链和重链的相对分子质量分别是55000和32000,ELISA检测抗体特异性显示可与FB1发生特异性反应,采用此抗体建立间接竞争抑制ELISA方法的线性范围在2～500ng/ml。结论制备了特异性和灵敏度较高的抗FB1单克隆抗体,为建立伏马菌素免疫学检测方法打下良好基础。     

两株抗鸡CARP单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的:制备抗鸡CARP单克隆抗体(McAb)。方法:克隆并原核表达鸡CARPN端110个氨基酸,纯化CARP蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性克隆;并利用ELISA、Western blot方法测定其效价和特异性。结果:获得2株能够稳定分泌抗鸡CARP的McAb杂交瘤细胞株,命名为4A8和4E6,亚型都属于IgG1,轻链为κ链;抗体腹水效价分别为3.2×104、1.28×105。Western blot检测到这两株抗体能够识别鸡CARP蛋白。结论:成功获得了2株能识别鸡CARP的杂交瘤及其分泌的特异性McAb。     

一对高亲和力抗人肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备及鉴定

目的 获取抗人肌钙蛋白Ⅰ（cTnI）的单克隆抗体（McAb）.方法 以人cTnI作为抗原,免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备了抗人cTnI高亲和力、高特异性单克隆抗体.随后采用间接ELISA法测定抗血清效价,用protein G亲和纯化法纯化抗体,抗原竞争ELISA法鉴定抗体亲和力,SDS-PAGE法鉴定纯度,Western blotting鉴定抗cTnI单克隆抗体的特异性,竞争ELISA法分析抗原结合位点.结果 筛选出9株稳定分泌抗cTnI的单抗杂交瘤细胞株,其中A3、A9两株免疫球蛋白亚类均为IgG2a,分泌的抗体纯度高,与CK-MB、cTnT无交叉反应,效价均为：1：1024000,亲和力分别为4.21×10^8mol/L、1.07×10^8mol/L,抗原结合位点不同.结论 成功制备出了一对高亲和力、高特异性抗人cTnI单克隆抗体.     

抗重组志贺毒素ⅡB亚基单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

目的 制备出高效价的抗重组志贺毒素ⅡB亚基(rStx2B)单克隆抗体.方法 以融合蛋白EspA-Stx2B作为抗原,免疫Balb/c小鼠,以未免疫的Balb/c小鼠脾细胞为饲养细胞;运用细胞杂交瘤技术制备,运用间接ELISA法筛选产生针对rStx2B的单克隆抗体细胞株;体内诱生法产生腹水,饱和硫酸铵沉淀法初步纯化,再采用HiTrap rProtein A柱进一步纯化,快速定性试纸鉴定McAb的Ig亚型,采用间接ELISA法相加实验鉴定抗原识别表位.结果 获得3株产生针对rStx2B的单克隆抗体细胞株Stx2B-1H9、Stx2B-1H10、Stx2B-3E5,Ig亚型分别为IgG1κ型,IgG2aκ型,IgG2bκ型,亲和力常数分别为7.36×108、6.94×108、5.85×108.结论 成功制备3株稳定分泌抗rStx2B的杂交瘤细胞株,产生的McAb特异性好,亲和力高,为应用这些单克隆抗体建立免疫亲和层析法纯化天然志贺毒素Ⅱ,鉴定Stx2B的表位,研究针对EHEC O157:H7感染的治疗性抗体奠定了基础.     

一株中和人IL-17免疫活性的单克隆抗体的制备

目的制备抗人IL-17单克隆抗体,并鉴定其中和活性。方法用hIL-17作为免疫和检测抗原,用间接ELISA法筛选分泌抗人IL-17抗体的杂交瘤细胞株,并对抗体进行中和活性鉴定。结果获得1株稳定分泌抗人IL-17单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型重链为IgG2b,轻链为κ;该株杂交瘤细胞腹水效价为1∶8.192×105;传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;Western Blot检测证明该单抗与人IL-17蛋白特异地结合;单抗亲和常数为8.192×10-9 mol/L;ELISA及Real-time-PCR检测证明该单抗能够有效地阻断人IL-17刺激Hela细胞产生IL-6的作用。结论所制备的抗人IL-17单克隆抗体具有高度的特异性、稳定性及中和活性,为针对IL-17为靶点的抗体药物的开发奠定了基础。     

抗RAET1G2单克隆抗体的研制和初步鉴定

目的:制备鼠源抗RAET1G2单克隆抗体,并对其特异性进行鉴定。方法:以原核表达的RAET1G2蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,运用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗RAET1G2单克隆抗体;用免疫双扩散方法鉴定Ig亚类;Western blot鉴定单克隆抗体的特异性。结果:获得了4株可分泌特异性抗RAET1G2抗体的杂交瘤细胞株7A11、9C6、10F9和12F8,Ig亚类均为IgG1。结论:制备的杂交瘤细胞株能稳定分泌特异性的抗RAET1G2抗体,并且所分泌的单克隆抗体都能识别天然的RAET1G蛋白,为进一步研究游离性的RAETlG2分子与肿瘤进展的关系以及分析各种肿瘤细胞表面的RAET1G表达情况创造了条件。     

抗解脲脲原体单克隆抗体的制备

作者用提纯的解脲脲原体抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞FO融合,获得3株稳定分泌抗解脲脲原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。制备了小鼠腹水抗体,并对杂交瘤细胞株进行了鉴定。用ELISA法测定该抗体腹水效价为1:64000～1:2048000,1F9、2B2抗体的Ig类型为IgG1,5H1为IgG2b。建立的3株能稳定分泌抗解脲脲原体的McAb杂交瘤细胞林,经液氮冻存后复苏,其分泌抗体能力不受影响。     

缺失PRD的人FOXP3单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗脯氨酸富含区缺失的人FOXP3(△PRD-hFOXP3)的单克隆抗体(mAb),为进一步研究人FOXP3各片段功能奠定基础。方法:以纯化的△PRD-hFOXP3重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,经筛选及克隆化建立2株分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb杂交瘤细胞株;利用核型分析、间接ELISA及Western blot分别鉴定了杂交瘤的细胞核型、抗体的效价与特异性。结果:筛选到2株可稳定分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb的细胞株,分别命名为1A2和3A11;2株抗体均为IgG1,腹水经ELISA方法测定效价均可达1∶105;Western blot显示这2株杂交瘤分泌的mAb均可与△PRD-hFOXP3蛋白特异性地结合。结论:成功获得2株能稳定分泌特异性抗△PRD-hFOXP3的mAb的杂交瘤细胞株,可用于人FOXP3的进一步研究及相关试剂的研发等。     

抗人μ链单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备高效价的鼠源性抗人μ链单克隆抗体(mAb),并建立可用于感染性疾病早期血清学诊断的ELISA捕捉法。方法:以人IgM全分子免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,用间接ELISA法筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗μ链mAb的杂交瘤细胞株。mAb的特性(效价、Ig亚类、特异性及相对亲和力)采用ELISA及Westernblot法鉴定。以纯化的mAb包被建立ELISA捕捉法,并用于可疑乙脑患者标本中特异性IgM抗体的检测。结果:筛选到1株可稳定分泌抗人μ链mAb的细胞株2E5。mAb腹水的ELISA效价为1×10-6,Ig亚类(型)为IgG1(κ),相对亲和力为1×10-5。Westernblot结果显示mAb2E5仅与IgM的μ链结合,Mr为75000。以辛酸硫酸铵法纯化的mAb2E5包被,建立了ELISA捕捉法,用于30份乙脑患者血清IgM的检测,敏感性及特异性良好。结论:成功地制备1株抗人μ链mAb2E5,建立了可用于感染性疾病早期血清学诊断的ELISA捕捉法。     

阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:制备抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法:采用灭活的阪崎肠杆菌菌体为抗原,免疫BALB/c小鼠,取血清效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,mAb亚类检测试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型,通过Western blot和间接ELISA法鉴定该单克隆抗体的特性、效价及mAb相对亲和力。结果:获得2株能稳定分泌抗阪崎肠杆菌mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1H7、2B12,抗体Ig亚类分别为IgG1和IgG2b;交叉反应显示单抗具有良好的特异性;ELISA分析表明制备的单抗效价在1×107～2×107,相对亲和常数达109L/mol,染色体鉴定分别为104和106条,符合杂交瘤细胞的特性。结论:抗阪崎肠杆菌单克隆抗体的成功制备为其快速检测方法的建立奠定了基础。     

重组人α干扰素单克隆抗体的研制及其应用

目的　研制抗干扰素的单克隆抗体 (McAb)及其应用。方法　应用杂交瘤技术 ,获得 4 0株抗重组人α干扰素的单克隆抗体细胞株 ;用ELISA方法检测腹水滴度 ,用辛酸法纯化McAb。结果　 4 0株细胞中 2E9、4G1能稳定分泌抗重组人α1b干扰素的单克隆抗体 ,2C9为抗重组新型干扰素 ,2A7、4G10分泌抗重组人α干扰素 (α1b、α2b、α2a、)和重组集成干扰素、重组新型干扰素的单克隆抗体细胞系 ;体外连续传代 6个月 ,分泌抗体能力不变 ,特异性专一。 5株单克隆抗体均为IgG。采用辛酸方法提纯抗体纯度达到 95 %以上。粗制的重组人α干扰素经 4G10单克隆抗体亲和层析柱提纯后 ,获得的干扰素纯度 95 %以上 ,平均收率 93% ,残余鼠IgG含量 <10 0ng 剂量 (5 0 μg)。 2C9单克隆抗体亲和层析柱适用于纯化新型干扰素。结论　 4G10单克隆抗体亲和层析柱可以应用于大规模重组人α干扰素生产。     

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白单克隆抗体2H4的纯化及其免疫学特性研究

目的 纯化抗沙眼衣原体pORF5单克隆抗体2H4并鉴定其免疫学特性.方法 大量培养pORF5单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株并收集培养上清,采用G蛋白免疫亲和层析法纯化2H4单克隆抗体;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定2H4效价及抗体亚类;Western blot鉴定其特异性;免疫荧光试验(IFA)检测2H4单克隆抗体的衣原体种属特异性.结果 纯化后2H4抗体的纯度高达93％;效价为1:1024,免疫球蛋白类型为IgG2a;2H4抗体不仅能特异性识别pORF5融合蛋白,而且能特异性识别Ct血清型A、D、L2、鼠农原体(MoPn)、鹦鹉热嗜农原体(6BC)质粒所编码的内源性pORF5蛋白,但不识别衣原体其他质粒蛋白和肺炎嗜衣原体(Cpn).结论 获得了高纯度的能特异识别pORF5质粒蛋白的单克隆抗体,为进一步研究pORF5蛋白结构和功能以及沙眼衣原体诊断试剂盒的研制奠定了良好的基础.     

诱导细胞凋亡的抗hDR5单抗的研究

目的 研制能诱导肿瘤细胞凋亡的抗人DR5单克隆抗体（McAb）。方法 以可溶性人死亡受体（death receptor，DR）5胞外段免疫小鼠，采用杂交瘤技术制备抗人DR5的McAb；MTT方法筛选分泌有细胞毒活性McAb的杂交瘤细胞；亲和层析方法纯化McAb；夹心ELISA法测定McAb亚型；Western blot和斑点ELISA法检测McAb的抗原表位类型；间接ELISA法检测McAb的特异性；流式细胞仪检测FITC-annexinⅤ／PI双色标记的Jurkat细胞的凋亡率；DNA琼脂糖凝胶电泳测定凋亡细胞的DNA片段化。结果 获得1株杂交瘤细胞，其分泌的McAb命名为mDRA-6，为IgG1；其抗原表位类型为构象表位；其特异性识别hDR5，与hFas、hDR4等无交叉反应。mDRA-6对Jurkat细胞具有细胞毒作用；经McAb mDRA-6处理后，Jurkat细胞膜表面高表达丝氨酸磷脂，并导致Jurkat细胞中的DNA片段化。结论 mDRA-6是一个具有诱导细胞凋亡活性的新的抗人DR5功能性抗体，在以TRAIL／DR5系统进行肿瘤治疗和探讨DR5的功能结构域研究方面具有广泛应用前景。     

人促甲状腺激素单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备特异性强、灵敏度高的人促甲状腺激素（hTSH）单克隆抗体,为建立高灵敏性和高特异性的hTSH检测方法奠定基础。方法：人工合成人促甲状腺激素（hTSH）上的28个氨基酸,采用戊二醛交联法与牛血清白蛋白（BSA）构建完全抗原。用人工免疫原免疫BALB／c小鼠,利用杂交瘤技术建立分泌抗hTSH单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对得到的单抗进行鉴定。结果：建立了一株杂交瘤细胞4E5,制备了腹水单抗,经鉴定,抗体重链属于IgG1类型,轻链属于K型,McAb腹水ELISA效价达1：1．6×10^5,与促黄体生成激素（LH）、促卵泡激素（FSH）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）无明显交叉反应,细胞株冻存复苏后抗体分泌稳定。结论：本实验建立的细胞株显示稳定性好,特异性高,McAb腹水效价高,为进一步提高hTSH检测的灵敏性和简便性提供依据。     

利用基因重组抗原研制人CD20单克隆抗体及其功能的研究

目的　利用基因重组抗原免疫小鼠 ,制备人CD2 0单克隆抗体 ,研究其特异性和功能。方法　用表达重组人CD2 0基因的细胞NIH 3T3免疫BALB c小鼠 ,取其脾细胞与Sp2 0细胞融合 ,以间接免疫荧光法筛选杂交瘤上清。免疫沉淀法及流式细胞术鉴定其识别抗原的相对分子质量 (Mr)和特异性 ;以MTT法、流式细胞术及形态学方法检测诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖的功能。结果　利用杂交瘤技术获得了 1株抗人CD2 0的单克隆抗体 1 2 8,它具有CD2 0抗体特异的细胞反应谱 ,其识别的抗原Mr 为 33× 10 3 。MTT实验证实 1 2 8能显著抑制Daudi和Raji细胞生长。结论　利用基因重组抗原制备了 1株能够稳定分泌抗人CD2 0的单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1 2 8,此单抗具有抑制CD2 0阳性细胞增殖和诱导其凋亡的功能。     

神经微丝的纯化及其单克隆抗体的制备与鉴定

本文采用羟基磷灰石吸附洗脱法,从牛脊髓中分离神经微丝(NF)。用SDS-PAGE显示其分子量为72K,164K及195K,负染电镜可见直径为8-10nm的丝状结构。以此为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与NS1细胞融合,获得了一株持续分泌抗NF单克隆抗体的杂交瘤细胞株AN_1。其染色体众数为91,所分泌抗体属IgG1亚类。免疫印迹表明此抗体为NF195特异性。免疫组化显示该抗体具有神经纤维特异性,对神经原胞体及非神经组织呈阴性反应。     

抗α-玉米赤霉醇单克隆抗体的研制及初步应用

目的:制备抗α-玉米赤霉醇(α-ZER)的单克隆抗体(mAb),建立对动物源性食品中残留α-ZER及其同系物的检测方法。方法:结合O-羧甲基羟胺法和EDC法制备α-ZER-BSA偶联物,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb。用夹心ELISA测定mAbIg亚类;按Beatty法计算亲和常数;间接ELISA法测定效价;用直接竞争ELISA检测mAb与α-ZER的同系物、己烯雌酚、19-去甲睾酮、链霉素及氯霉素等的交叉反应;绘制α-ZER标准品竞争抑制曲线,检定抗体的灵敏度。用该抗体建立的直接竞争ELISA对37份动物肝组织样品进行检测,并与HPLC检测结果比较。结果:紫外线扫描证明,α-ZER-BSA偶联成功。实验获得8株可稳定分泌抗α-ZERmAb杂交瘤细胞株,其中1株(4E5)分泌的mAb效价较高,为5.142×107,其Ig亚型为IgG1。该mAb能特异识别α-ZER及其同系物,而与其它常用兽药无交叉反应。建立了α-ZER直接竞争ELISA,从HPLC确认为阴性的37份样品中,筛出8份阳性样品。结论:利用mAb建立的直接竞争ELISA检测方法,适合动物源性食品中残留α-ZER及其同系物的快速筛选。