汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

目的 将编码汉坦病毒76-118株核蛋白的S基因片段克隆到真核表达载体DTARGET TM，构建含汉坦病毒核蛋白S基因的重组真核表达质粒pTARGET-hans，并在体外进行瞬间表达。方法 采用PCR产物直接克隆方法，将核蛋白S基因插入到真核表达载体pTARGE TM中；酶切鉴定；用电穿孔法将重组质粒转染入Vero-E6细胞；用间接免疫荧光法检测其表达产物。结果 酶切鉴定证实S基因已被正确地插入pTARGET TM中；在部分转染重组质粒的Vem-E6细胞胞质内观察到中等强度的特异性荧光。结论 重组的真核表达载体pTARGET-hans已被成功地构建并可在体外表达．为下一步基因免疫打下基础。     

广西汉坦病毒全S基因核苷酸序列测定

目的 查明广西汉坦病毒的基因型及其基因亚型.方法 用夹夜法捕获宿主动物,用免疫吸附试验(ELISA)检测鼠肺标本.对汉坦病毒抗原阳性标本用RT-PCR法扩增,产物直接测序,拼接后获得全S基因序列,用生物软件进行核苷酸及氨基酸系列分析和病毒的系统进化分析.结果 应用ELISA法检测鼠肺抗原792份,阳性6份,RT-PCR测定其中5毒株.基因型为汉城病毒,进一步的核苷酸序列分析均为S2亚型.结论 广西汉坦病毒基因型为汉城型汉坦病毒,亚型为S2.     

广西汉坦病毒全S基因核苷酸序列测定

目的查明广西汉坦病毒的基因型及其基因亚型。方法用夹夜法捕获宿主动物,用免疫吸附试验（ELISA）检测鼠肺标本,对汉坦病毒抗原阳性标本用RT-PCR法扩增,产物直接测序,拼接后获得全S基因序列,用生物软件进行核苷酸及氨基酸系列分析和病毒的系统进化分析。结果应用ELISA法检测鼠肺抗原792份,阳性6份,RT-PCR测定其中5毒株,基因型为汉城病毒,进一步的核苷酸序列分析均为S2亚型。结论广西汉坦病毒基因型为汉城型汉坦病毒,亚型为S2。     

湖北省武汉地区啮齿动物汉坦病毒S基因的特征分析

目的 了解湖北省武汉地区啮齿动物自然感染汉坦病毒（HV）情况以及流行的基因型和亚型。方法 2000-2003年、2009-2011年秋冬季在武汉地区新洲、江夏区野外及居民区采用夹夜法捕鼠。对捕获的动物进行分类鉴定并取肺脏用间接免疫荧光法检测病毒抗原。抗原阳性的样本,采用RT-PCR方法扩增部分S片段核苷酸序列,构建系统发生树并进行基因分型。结果 2000-2003年捕获啮齿类动物437只,HV抗原阳性鼠肺标本24份,病毒携带率为5.49%。2009-2011年捕获啮齿类动物173只,HV抗原阳性鼠肺标本7份,病毒携带率为4.05%。褐家鼠为当地的优势鼠种。22份标本成功地用汉滩病毒（HTNV）、汉城病毒（SEOV）特异引物扩增部分S基因片段并测序。17只（13只褐家鼠,4只黑线姬鼠）鼠肺标本中扩增出SEOV部分S基因片段（nt 588~1147）,分别属于第3亚型和2个新的基因亚型。5只黑线姬鼠的鼠肺标本中扩增出HTNV部分S基因片段（nt615-1141）,分别属于第7亚型和1个新的亚型。结论 武汉地区流行的HV为SEOV和HTNV,并发现新的基因亚型,SEOV可能“溢出”感染黑线姬鼠。     

一株汉坦病毒的分离及基因鉴定

目的分离汉坦病毒并采用分子生物学方法进行基因鉴定.方法组织细胞培养法和RT-PCR法.结果在黑线姬鼠体内分离出一株汉坦病毒,分别用HTN型和SEO型的特异引物对其进行基因扩增,同时以76-118株和L99株作对照,结果分离株经HTN型引物扩增出一条明亮带并同76-118株结果一致.结论分离株经基因鉴定为HTN型病毒.     

北海道型汉坦病毒核蛋白基因的克隆表达及其免疫原性

目的 构建北海道型汉坦病毒(HOKV)核蛋白(NP)基因的重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中表达出具有免疫原性的抗原,用于HOKV的检测及诊断.方法 应用RT-PCR方法扩增HOKVFusong-Cr-247株的NP基因,并将该基因片段克隆到PCR[R]2.1TA载体,转化到One ShortTM TOP10感受态细胞构建TA克隆载体,并与pFastBacTM1转座质粒载体分别用Kpn I和Not I双酶切,用T4连接酶连接,构建pFast PUUV-S重组转座质粒,经双酶切、PCR扩增及插入序列方向鉴定后.转化到DH10BacTM E.coli 感受态细胞,经三抗培养基筛选和PCR扩增鉴定后获得重组Bacmid质粒,将重组Baemid质粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒毒液,并继续扩增重组杆状病毒,以第三代毒液感染Sf9昆虫细胞,96h后收获细胞.用间接免疫荧光(IFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定和分析.结果 实验应用Bac-to-BacTM杆状病毒表达系统,成功构建了含普马拉类汉坦病毒核蛋白基因的重组杆状病毒表达载体.并在昆虫细胞中获得表达.IFA结果显示,感染细胞的胞浆中有亮绿色荧光颗粒,SDS-PAGE和Western blot检测细胞表达产物的50×103(M)的蛋白条带,证实重组病毒感染昆虫细胞后表达了相应的重组核蛋白,与预计的结果相符.并能与抗汉坦病毒抗体结合.结论 成功表达具有HOKV免疫原性及反应性的重组核蛋白,为研制HOKV的诊断试剂奠定了基础.     

吉林省汉城型汉坦病毒基因分型研究

目的 查明吉林省褐家鼠中汉城型汉坦病毒的基因亚型及其分布情况。方法 在吉林省的主要疫区采集啮齿类宿主动物，用免疫荧光法检测鼠肺标本，对汉坦病毒抗原阳性标本以RT-PCR法扩增部分M和S基因片段上的核苷酸序列并测序，将扩增片段的核苷酸序列与已知病毒序列进行系统发生分析并分型。结果 褐家鼠携带的汉坦病毒均为汉城病毒。序列分析发现在吉林省主要疫区褐家鼠流行的汉城病毒均为S3亚型，与辽宁、黑龙江省褐家鼠中的病毒株同源性较高，进化关系较近。结论 吉林省褐家鼠主要携带S3亚型的汉城型汉坦病毒。     

南昌市鼠类汉坦病毒检测及基因分型

摘要:目的 了解从江西省南昌市捕捉的鼠类汉坦病毒感染情况,分析汉坦病毒基因型别和基因特征。方法 捕鼠取鼠肺,冷冻切片后运用直接免疫荧光法检测鼠肺中汉坦病毒抗原,提取抗原阳性鼠肺标本RNA,采用特异性引物对部分M基因片段进行基因扩增,对扩增产物进行序列测定和基因分析。结果 共捕获鼠类130只,褐家鼠（99,76.15%）、小家鼠(13,10.00%）、黄胸鼠（18,13.85%）,其中18份汉坦病毒免疫荧光阳性,鼠类汉坦病毒携带率为13.85%,不同地区间汉坦病毒携带率差异有统计学意义（χ2=17.89,P=0.00129＜0.05）,青山湖区最高（26.67%）;对所有的免疫荧光抗原阳性鼠肺标本进行核酸检测、序列测定和分析,结果发现所有标本汉坦病毒均属汉城型S4亚型,毒株之间核苷酸同源性986%～100.0%。结论 南昌市鼠间流行的汉坦病毒为汉城型,S4亚型。     

汉坦病毒的基因进化与地理分布

汉坦病毒(HV)是单股负链RNA病毒,引起病死率高的肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒肺综合征(HPS)。HV基因有L、M和S 3个片段组成,具有高变异特点,目前在世界范围内存在30个基因型,我国以HTN和SEO型为主。HV基因变异的主要原因是基因漂移,基因重组和重配。HV宿主范围非常局限,特定的型别一般只感染1种啮齿类动物,宿主转换是其基因进化的主要原因。各型分布具有地区聚集性,我国HV主要分布在东经100°以东的多水地带。     

上海地区汉坦病毒基因分型和序列分析

[目的 ]　研究上海地区汉坦病毒基因型分布。　 [方法 ]　采用逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR)、核苷酸测序法和系统发生树分析上海宿主动物中获得的 3 6株汉坦病毒M基因片段。　 [结果 ]　上海郊区汉坦病毒流行株有HTN型和SEO型 ,以HTN型为主 ;市区流行株为SEO型。核苷酸序列同源性及系统发生树分析表明上海地区HTN型汉坦病毒存在 3个不同分支 ,不同HTN型病毒间的核苷酸的差异在 6% -19%。　 [结论 ]　上海地区汉坦病毒以HTN型为主。可能存在汉坦病毒的不同基因亚型 ,对本市肾综合征出血热 (HFRS)的防治有重要指导意义     

北京地区汉坦病毒宿主动物生态流行病学调查

目的了解北京地区啮齿动物问汉坦病毒（HV）感染状况、HV基因型及其与宿主动物的关系。方法夹夜法捕鼠，计算鼠密度，确定鼠种构成。针对HV基因M片段部分序列设计2种型特异性引物，应用RT—PCR法检测宿主动物带毒情况，并用ClustalX（5．0）和DNAClub软件对序列进行分析。采用SPSS软件分析宿主动物HV感染的流行病学特征。结果共捕获宿主动物295只，褐家鼠为优势鼠种，占71．53％。其次为小家鼠。占14．58％。RT—PCR检测宿主带病毒率，其中褐家鼠阳性率为18．01％，小家鼠为2．33％。对5份扩增阳性标本进行序列测定并对其核苷酸序列进行分析，结果显示均为汉城型（SEO）病毒。不同性别的褐家鼠HV感染率之间差异无统计学意义（X^2=0．032，P〉0．05）；不同体重的褐家鼠HV感染率之间差异有统计学意义（X^2=16．900，P〈0．001），体表有、无疤痕的褐家鼠之间HV感染，差异有统计学意义（X^2=30．441，P〈0．001）。结论北京地区存在较为广泛的汉城型HV感染，目前尚未发现汉滩型HV疫源地。褐家鼠为北京地区HV优势宿主和主要带毒鼠，宿主动物种群特征与HV感染具有不同程度的相关性。     

2007年浙江省鼠类感染汉坦病毒监测及病毒分离

目的了解浙江省鼠类自然感染汉坦病毒（HV）情况和病毒型别,为肾综合征出血热（HFRS）防治提供科学依据。方法采集鼠类肺组织和血清标本,用间接免疫荧光试验检测鼠血清IgG抗体,直接免疫荧光试验检测鼠肺Hv抗原。HV抗原阳性鼠肺接种Vero—E6细胞分离病毒,用HV单克隆荧光抗体鉴定分离株的型别。结果共捕获鼠形动物1129只,其中黑线姬鼠为优势种,鼠肺HV抗原阳性率为3．0％,鼠血标本IgG抗体阳性57份,阳性率8．0％。分离到6株汉滩（HTN）型病毒,其中来自黑线姬鼠5株,褐家鼠1株。结论浙江省存在以黑线姬鼠为主要传染源的HFRS疫源地,HV主要流行型别为HTN型。     

中国肾综合征出血热病人血清型研究

总结中国大部分地区近年应用血凝抑制试验等方法检测肾综合征出血热病人血清型的初步结果，并用量化的方法进行了肾综合征出血热的疫区分型，结果表明中国大部分地区已经演变为混合型肾综合征出血热疫区，同时尚存部分姬鼠型和家鼠型肾综合征出血热疫区。近十年来，抽样监测表明，中国肾综合征出血热病人汉坦病毒Ⅰ型感染５０．０３％～５１．０８％，Ⅱ型占４８．９２％～４９．９７％。指出了血清型研究对指导防制实践，尤其是对当前合理选用疫苗具有重要指导意义。还提出了对人群致病的汉坦病毒属，不同种（型或亚型）的同源性大小，与鼠科和仓鼠科中的汉坦病毒主要宿主动物黑线姬鼠、褐家鼠、欧洲棕背、鹿鼠系统发育的远近，有密切的亲缘关系。     

汉坦病毒四川分离株S85-46 的遗传学特征

目的：了解汉坦病毒四川分离株S85－46株分子流行病学特征。方法：将特异性引物从S85－46病毒感染细胞PCR扩增的产物克隆于T载体,正确的克隆纯化后测序,应用DNASTAR软件比较分析。结果：S85－46株M片段与HTN型毒株同源性为84．1％－99．7％,而与SEO型毒株同源率仅为70．4％－70．9％,表明S85－46毒株属HTN型。核苷酸同源性比较显示,S85－46与韩国分离的76－118株高度同源,而与国内一些HTN型病毒差异较大。而且同一地区的毒株也以差异很大。S片段全基因序列同源性比较也支持以上的观点。结论：不同地区汉坦病毒的流行株基因序列可以高度同源。     

大林姬鼠中汉坦病毒的分离及其S片段的序列分析

目的 分析吉林省大林姬鼠携带的汉坦病毒(HV)在进化过程中的系统发生关系。方法采用病毒分离技术、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、克隆以及测序技术对中国大林姬鼠携带的HV进行研究。结果从4只大林姬鼠Hv抗原阳性的肺组织标本中分离到2株HV(CJ189和CJ193)，对其中CJ193病毒株的S片段进行克隆、测序以及分析，基因分型结果为汉滩型(HTN)汉坦病毒。根据S片段的核苷酸序列同源性分析，CJ193与Aa2499核苷酸序列的同源性最高(94．3％)，而与Ap61、Ap63的同源性最小(83．3％，82．9％)。由全S片段构建的HTN型汉坦病毒的系统发生树表明CJ193与Aa2499等俄罗斯黑线姬鼠携带的HV的亲缘关系最近，其次为中国的HTN型病毒，然后才是Ap61、Ap63等俄罗斯大林姬鼠携带的HV。结论从我国吉林省大林姬鼠分离到的CJ193株是HTN型汉坦病毒的新亚型。     

HFRS病毒滇绒鼠分离株E-142全S基因序列分析

目的了解肾综合征出血热病毒云南地区滇绒鼠分离株E-142的分子生物学特征.方法应用PCR方法克隆了该株全S基因.结果序列测定结果表明E-142株的S片段的全基因序列共1702个核苷酸,编码429个氨基酸.四种核苷酸的比例分别为A32.79%,G25.12%,T23.02%,C19.07%,GC含量为44.19%,AT含量为55.81%.E-142与汉坦病毒S基因核苷酸和氨基酸同源性比较表明,E-142株与HTN型同源率为86.6%～90.4%,而与SEO型仅为68.3%～69.6%,E-142株病毒属于HTN型,但与HTN型其它毒株相差高达9.6%～13.4%.结论E-142株病毒是HTN型的新亚型毒株.     

汉坦病毒核蛋白基因表达及产物抗原活性的研究

为了制备肾综合征出血热（ ＨＦＲＳ） 诊断用基因工程抗原,构建了合汉坦病毒７６１１８ 株编码核蛋白（ ＮＰ） 基因片段的重组质粒ｐＢＶ２２０Ｈ１－３Ｓ, 经转化大肠杆菌和诱导表达,ＳＤＳＰＡＧＥ 显示菌体中有分子量约为４８ ＫＤ 的新蛋白质生成。用经包含体纯化获得的表达产物做抗原,以间接酶联免疫（ＥＬＩＳＡ） 检测了４８ 份疑似出血热患者的血清特异性ＩｇＧ,其结果与经典的间接免疫荧光（ＩＦＡ） 检测的阴性、阳性及总符合率分别为１００ ％ 、９２－８６ ％ 和９３－７５ ％ 。证实该重组ＮＰ 具有良好的生物活性和诊断抗原价值     

汉坦病毒接种小白鼠后病毒的分布及血清中抗体与生化值的动态观察

用汉坦病毒ＮＱＲ－１０７Ｒ株接种小白鼠，观察病毒在小白鼠体内各器官的分布和消长情况以及血清抗体和血清中的ＧＰＴ、ＬＤＨ、总ＢＩＬ、ＢＵＮ及尿酸值的变化趋势。结果，初期几乎能从小白鼠所有的器官分离到病毒，随着时间的推移，病毒的分离越来越少，而血清抗体的滴度则相反，随时间而升高，从血清的各生化值看出，初期是一过性的血清ＬＤＨ、尿酸升高，ＢＵＮ值下降，但是，病毒对肝肾的直接损害不大。     

汉坦病毒生物学特性研究进展

汉坦病毒（Hantavirus，HV）属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，是有包膜分节段的单股负链RNA病毒，能引起肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒肺综合征（HPS）。HV在全球分布广泛，中国是受HV危害最严重的国家，历年报告的HFRS病例数约占世界病例总数的90％左右。自1978年韩国李镐汪等首先从HFRS疫区黑线姬鼠中分离到HV以来，各国学者在不同宿主动物中相继发现或分离到HV。随着分子生物学方法应用于HV研究，不仅发现了许多新型HV，而且侄其遗传特征、演变进化、致病性等生物学特性研究上均取得了长足进展，为有效地预防控制HV的感染做出了很大贡献。本文结合当前实验室的某些工作和HV生物学特性研究的情况作以下综述。