TNNT3(R69H)突变转基因小鼠模型的建立

目的 建立TNNT3(R69H)突变转基因小鼠模型.方法 构建pEGFP-TNNT3(R69H)转基因构件,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒pEGFP-TNNT3(R69H)注射入BDF1小鼠受精卵中,胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠.用PCR和Southern blot方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT-PCR及Western blot的方法检测TNNT3基因表达.结果 8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎82枚,出生40只子代鼠,经PCR和Southern方法检测得到5只转基因阳性小鼠.对其子代小鼠进行RT-PCR、Western blot检测结果显示,TNNT3在转基因小鼠心脏和骨骼肌中表达量明显增多.结论 通过显微注射法使外源基因pEGFP-TNNT3(R69H)在小鼠基因组中整合,成功建立了TNNT3(R69H)突变转基因小鼠模型.     

TNNI2突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNI2突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-tnni2转基因构件,TNNI2基因的第175个氨基酸缺失,通过原核显微注射法。把线性化、纯化后的外源基因pEGFP-tnni2注射入BDF1小鼠受精卵中。胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。用PCR和Southern方法检测子代鼠尾DNA鉴定基因型。通过RT-PCR方法检测tnni2基因表达。结果移植注射胚胎115枚给4只假孕小鼠共出生了23只后代鼠。经PCR和Southern方法检测得到4只阳性小鼠。对其子代进行RT-PCR检测,tnni2基因在肌肉、心脏内表达。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-tnni2（TNNI2基因的第175个氨基酸缺失）在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP-tnni2的转基因小鼠模型。     

人胰岛素转基因小鼠模型的建立

目的:建立人胰岛素的转基因小鼠模型.方法:通过原核显微注射法,把外源基因pEF1α-mINS注射入FVB种小鼠受精卵,胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠获得子代小鼠.结果:移植注射胚胎204枚给38只假孕小鼠共出生108只后代鼠,经PCR和Southern blot检测到5只阳性小鼠.结论:通过显微注射法使外源基因pEF1α-mINS在小鼠基因组中得到整合,建立了人胰岛素的转基因小鼠模型.     

绿色荧光蛋白转基因小鼠模型的建立及胚胎冷冻保种

目的建立绿色荧光蛋白转基因小鼠模型，并采取胚胎冷冻的方法进行保种。方法通过原核显微注射法，把线性化、纯化后的外源基因pEGFP注射入BDF1小鼠受精卵中，胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠，获得子代小鼠。经鉴定对有表达的转基因鼠进行胚胎冷冻保种。结果移植注射胚胎385枚给30只假孕小鼠共出生了306只后代鼠，经PCR和southern blot检测得到5只阳性小鼠。F2代转基因鼠胚胎冷冻240枚胚胎。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP在小鼠基因组中得到整合，建立了转pEGFP的转基因小鼠模型。     

WNK4转基因小鼠的建立

目的制备WNK4转基因小鼠模型。方法通过显微注射法把线状WNK4基因注射入FVB小鼠受精卵雄原核中，然后将受精卵细胞移植于受体假孕母鼠输卵管内，发育产生子代小鼠。结果产生出112只F0代小鼠。鼠尾基因组DNA经PCR法检测1只阳性，并进行测序。结论通过显微注射法，外源基因WNK4在FVB小鼠基因组中得到整合，将对研究WNK4基因功能和与高血压疾病发病机制的作用和关系提供了有效的动物模型。     

抗菌肽转基因小鼠模型的建立

目的:制备抗菌肽转基因小鼠模型.方法:显微注射pcDNA3.1-PCMG到FVB小鼠受精卵雄原核中,注射存活胚胎移植到假孕母鼠输卵管内发育产生子代小鼠.结果:在生出的119只小鼠中经PCR和Southern blot检测到7只阳性.结论:通过显微注射法使外源基因pcDNA3.1-PCMG在FVB小鼠基因组中得到整合,为抗菌肽抗菌谱的研究,抗病毒、抗肿瘤机制的研究提供有价值的抗病动物模型.     

瞬时受体电位通道家族M8型受体转基因小鼠模型的建立

目的 建立瞬时受体电住通道家族M8型受体(TRPM8)转基因小鼠模型.方法 通过显微注射法将pcDNA3.1-hTrpm8导入C57BL/6J×CBA F1小鼠的受精卵中,并将其移植到假孕母鼠输卵管中获得子代小鼠.采用PCR方法鉴定子代基因型,通过RT-PCR和免疲印迹法检测Trpm8基因及蛋白在组织中的表达.结果 将405枚注射受精卵移植给15只假孕鼠,其中13只顺利妊娠并产下95只子鼠,经PCR鉴定得到5只转基因阳性首建鼠,其中4只小鼠可稳定传代,经与C57BL/6J小鼠回交7代后互交数代建系.子代转基因小鼠经RT-PCR检测发现Trpm8基因在心脏、肝脏、肾脏、脂肪和骨骼肌中均有表达,且TRPM8蛋白表达在转基因小鼠中显著增加.结论 通过显微注射法成功建立了Trpm8转基因小鼠模型.     

GAP-43高表达转基因小鼠的建立

目的构建GAP-43(growth associated protein-43)高表达转基因小鼠,为进一步研究GAP-43对神经发生及损伤修复的作用机制提供基础。方法构建pCEP4-PDGF-GAP-43转基因构件,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒pCEP4-PDGF-GAP-43注射入C57小鼠受精卵中,胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠。用PCR方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过Western blotting法检测GAP-43基因表达,并通过免疫荧光的方法对GAP-43表达位置进行定位。结果经PCR方法检测得到转基因阳性鼠,Western blotting结果显示GAP-43蛋白的表达量高于同胞对照组的小鼠且差异有统计学意义,免疫荧光染色结果显示GAP-43阳性反应物弥散分布于大脑皮质和海马中,且特异性存在于神经元中。结论外源基因GAP-43在小鼠基因组中得到整合并稳定遗传,为神经损伤修复及神经发育的相关研究提供了有价值的动物模型。     

四环素调控SV40Tag转基因小鼠模型的建立

目的构建四环素调控的SV40T转基因小鼠模型。方法同时显微注射外源基因p205-rtTA-C3和pTRE-Tag至FVB小鼠原核,注射受精卵移植到同期发情的假孕受体出生个体,经PCR和Southern检测获得阳性转基因小鼠。结果经PCR结合Southern检测得到rtTA和Tag双阳性转基因小鼠一只,rtTA单阳性两只和Tag单阳性一只。结论通过饮水给与四环素的双阳性小鼠可在卵巢中检测到Tag mRNA的表达。     

高表达人源Her2乳腺癌小鼠模型的建立及鉴定

目的 构建并鉴定高表达人源Her2乳腺癌转基因小鼠模型.方法 构建pMD18T-MMTV-huHER2-EGFP转基因构件,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒pMD18T-MMTV-huHER2-EGFP注射入C57BL/6J小鼠受精卵中,胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠.采用PCR鉴定子代小鼠尾部组织基因组DNA,用蛋白质免疫印迹法检测乳腺组织Her2蛋白的表达,通过组织病理学切片观察转基因小鼠乳腺组织的病理学变化.结果 经PCR方法检测得到转基因阳性小鼠.蛋白质免疫印迹结果显示,与野生型小鼠相比,F2代阳性小鼠的乳腺组织中Her2蛋白高表达.病理组织切片表明25周龄阳性小鼠的乳腺组织已经出现明显的癌变倾向.结论 高表达人源Her2乳腺癌小鼠模型成功建立并能稳定遗传,可自发形成乳腺癌,其生物学特性和病理学改变与人乳腺癌相近,可作为研究乳腺癌发生发展的动物模型.     

基于四环素调控系统的ApoE-rtTA/TRE-HCV-C双转基因小鼠的制备

目的为了丰富现有的四环素调控系统的小鼠资源库,同时也为更好地研究目的基因HCV-C的作用机制提供一个活体的动物模型,制备基于四环素调控系统原理的调控部分ApoE-rtTA的转基因小鼠,与反应部分TRE-HCV-C转基因小鼠,相互交配制作出双转基因小鼠。方法应用显微注射法将构建好的两种基因片段ApoE-rtTA及TRE-HCV-C分别注入超排的昆明母鼠的受精卵,再植入假母输卵管,出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性,将两者及阳性后代交配产生携带5只转基因鼠再经Western blot和RT-PCR在RNA和蛋白水平上进一步鉴定。结果产生了3只整合有ApoE-rtTA基因的首见鼠和125只阳性子代,以及产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首见鼠和16只阳性子代。PCR及Southern Blot证实上述阳性鼠确有转基因整合。将两者交配产生携带5只双转基因鼠。结论成功制备了携带有ApoE-rtTA及TRE-HCV-C转基因小鼠,建立了分别携带有这两种基因的鼠群,以及同时携带有两种基因的双转基因小鼠,为四环素调控系统提供了一个良好的通用型的调控动物模型,同时也可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用,也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。     

APP695K595N/M596L突变转基因小鼠的建立和病理表型动态分析

目的建立APP695K595N/M596L(Swedish突变)转基因小鼠和评价痴呆表型的发生和发展过程。方法将APP695K595N/M596L突变基因插入到小鼠朊蛋白(mouse prion protein)启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立APP695K595N/M596L突变转基因C57BL/6J小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因表型,Western blotting检测APP突变基因表达。Thioflavin-S染色检测不同年龄转基因小鼠大脑病理改变。Morris水迷宫动态观察小鼠行为学改变。结果建立了人APP695K595N/M596L转基因小鼠,Thioflavin-S染色显示转基因小鼠9月龄时在脑海马区可检测到老年斑形成,并且在11、12月龄时明显增多。Morris水迷宫结果发现与同月龄野生型小鼠相比,该转基因小鼠5月龄开始出现学习记忆能力缺陷,7、9、11月行为学结果证实转基因小鼠的学习记忆能力缺陷随年龄增加而日趋严重(P<0.05)。结论建立了人APP695K595N/M596L转基因小鼠,并能再现人类阿尔茨海默症的行为学及神经病理学特征,为阿尔茨海默病发病机制研究和药物研发提供了有价值的动物模型。     

Bcl-2高表达小鼠模型的建立

目的 建立Bcl-2高表达的转基因小鼠品系,为在活体动物上研究bcl-2蛋白的功能提供动物模型.方法 构建含人Bcl-2基因的质粒;通过显微注射将该质粒转入C57BL/6J×CBA的杂交小鼠的受精卵,并植入假孕母鼠的子宫,PCR检测后携带人Bcl-2基因的小鼠即为“Founder”鼠;将“Founder”鼠与C57BL/6J×CBA杂交小鼠不断回交,经PCR和Western bilotting筛选后即可获得阳性小鼠.结果 共获得5只“Founder”鼠,其中#6、#14成功建系,连续回交繁殖7代后,PCR和Western筛选后获得bcl-2高表达阳性小鼠42只.结论 成功将人bcl-2基因转入小鼠基因组内,并稳定传代,建立Bcl-2高表达小鼠,为进一步研究Bcl-2蛋白提供了很好的动物模型.     

基于pMTR1质粒的转基因小鼠突变研究模型的建立

建立在基因组中整合有ｐＭＴＲ１质粒的Ｃ５７ＢＬ／６转基因小鼠家系,为体内基因突变研究提供有效的动物模型。方法：利用分子克隆技术构建ｐＭＴＲ１质粒。将其线性性化后,用显微注射注射入５７２只Ｃ５７ＢＬ／６小鼠受精卵,再将它们分别移入４５只受体母鼠的输卵管中,共产仔４４只,存活３５只,采用ＰＣＲ,ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交三级筛选法鉴定子代小鼠。以４只经基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂     

钙蛋白酶抑制蛋白转基因小鼠的构建和鉴定

目的 将人的钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin,CAST）外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建高表达CAST的转基因小鼠模型。方法 利用Gateway技术构建pRP.EX3d-EF1A-CAST-IRES-eGFP载体,回收片段后通过显微注射法将目的基因片段注入到C57BL/6J小鼠受精卵中,将其胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内获得子代小鼠。采用PCR方法鉴定出阳性的转基因小鼠,确定首建鼠,通过与C57BL/6J小鼠回交后互交数代建系。利用RT-PCR和Western blotting方法检测CAST基因和蛋白在各组织中的表达情况。结果 将90枚注射受精卵移植到3只假孕鼠中,3只均怀孕,移植成功率100%,产下23只子鼠,经PCR鉴定得到2只转基因阳性首建鼠,阳性率为9%。子代小鼠进行RT-PCR检查显示,CAST基因在转基因小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和骨骼肌中均有表达;Western blotting检查显示,CAST蛋白表达在转基因小鼠中显著高于同窝阴性小鼠。结论 通过显微注射法成功构建CAST高表达的转基因小鼠,为进一步研究CAST奠定了良好的模型基础。     

人载脂蛋白C3基因转基因小鼠的建立及血脂变化分析

目的制备系统性表达人载脂蛋白C3(APOC3)基因的转基因小鼠,建立高血脂小鼠模型。方法将人APOC3基因插入系统性表达启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立人APOC3转基因C57BL/6J小鼠。并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Western blot检测基因表达水平,血生化分析检测不同月龄转基因小鼠与同龄野生型小鼠的血脂指标,脂肪染色观察肝脏脂肪水平。结果建立了高表达人APOC3基因的转基因小鼠品系;转入的人APOC3基因在血液、肝脏、小肠、肌肉、心脏、肾脏、脾脏中均有明显表达;不同月龄转基因小鼠的血浆甘油三酯水平明显高于同龄野生型小鼠;转基因小鼠的肝脏脂肪含量高于野生型小鼠。结论系统性表达人APOC3基因的转基因小鼠表现高脂血症表型,可以作为高血脂以及高血脂相关的心血管病的工具动物。     

肝脏特异性可调控丙型肝炎病毒核心蛋白表达的转基因小鼠模型的建立

 【目的】制备TRE-HCV-C转基因小鼠，为四环素调控系统的体内研究提供了反应部分的转基因小鼠。以便与本实验室同时建立的调控部分的小鼠共同作用，为进一步建立双转基因小鼠模型奠定基础，更为丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV-C）的发病机制的研究提供一个实用方便的模型。【方法】重组构建含有目的基因HCV-C、TRE序列和SV40polyA的转基因载体pTRE-HCV-C．以显微注射的方法将l_153kb的转基因片段注人BALB／C母鼠的受精卵．出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性．再经Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定。用转基因阳性小鼠和整合有肝脏特异性启动子ApoE和胛A基因的另一品系转基因小鼠杂交，得到子代F1小鼠，通过免疫组织化学来初步检测HCV-C在肝脏中特异性的可调控性的表达。【结果】产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首建鼠，以及它的子代也带有此基因。与基因组上整合有肝脏特异性启动子ApoE和rtTA基因的转基因小鼠杂交后，得到子代F1小鼠。特定时问与DOX作用后，小鼠肝脏的免疫组织化学结果表明，TRE-HCV-C小鼠为丙型肝炎病毒核心蛋白的发病机制研究提供了一个良好的动物模型工具。【结论】成功制备了HCV-C转基因小鼠，可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用，为进一步建立四环素调控系统调控下表达HCV-C基因双转基因小鼠模型奠定基础．也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。