白血病骨髓基质细胞促进Jurkat细胞抗药物诱导凋亡研究

目的探索骨髓基质细胞增强白血病细胞抗凋亡、抗药特性的可能机制.方法体外分离培养骨髓基质细胞模拟骨髓微环境功能,与白血病细胞Jurkat体外共培养.0.5 μmol/L DNR处理Jurkat 细胞诱导凋亡,应用Annexin V/PI 双标法流式细胞仪检测白血病细胞凋亡率.PI染色流式细胞仪检测细胞周期分布.结果 0.1～2.0 μmol/L浓度范围DNR作用一定时间后,Jurkat细胞发生的凋亡率随药物浓度的增加与作用时间的延长而升高.共培养后骨髓基质细胞抑制药物诱导的白血病细胞凋亡,白血病细胞凋亡率明显低于单独悬浮培养组(P<0.05).白血病骨髓基质对白血病细胞的屏蔽效应强于正常骨髓基质细胞[白血病细胞凋亡率分别是(5.73±1.78)%, (8.39±4.08)%, (P<0.05)].DNR处理共培养组Jurkat细胞G0/G1期阻滞,而正常与白血病骨髓基质细胞屏蔽的白血病细胞G0/G1期阻滞现象无显著性差异(P>0.05).结论一定浓度的DNR在体外可诱导Jurkat细胞凋亡.骨髓基质细胞抑制化疗药物诱导的白血病细胞凋亡,这种保护作用可能部分通过阻滞白血病细胞于G0/G1期实现.白血病骨髓基质细胞对白血病细胞的屏蔽效应可能存在较细胞周期阻滞更复杂的机制.     

白血病骨髓基质细胞黏附对DNR在Jurkat细胞内蓄积及分布的影响

目的初步探讨细胞黏附介导耐药模型中DNR在Jurkat细胞内的蓄积浓度及分布特征.方法分离、培养骨髓基质细胞,Jurkat细胞与60Co照射的基质细胞层黏附培养,构建细胞黏附介导耐药模型,0.5μmol/L DNR作用24h,FITC-Annexin V/PI标记后流式细胞仪定量Jurkat细胞的凋亡率及DNR在Jurkat细胞内蓄积浓度,荧光显微镜观察其荧光信号在Jurkat细胞内的分布.结果白血病基质细胞黏附组、正常基质细胞黏附组Jurkat细胞凋亡率分别为(6.05±0.54)%、(8.48±0.86)%,与悬浮对照组(25.74±6.15)%比较均相差非常显著(P<0.01),且白血病基质细胞组与正常基质细胞组间相差显著(P<0.05).基质细胞黏附并未降低Jurkat细胞内DNR的蓄积浓度,其红色荧光信号在Jurkat细胞内仍呈均匀、弥漫性分布.结论白血病骨髓基质细胞黏附能介导Jurkat细胞耐药,但其耐药机制可能独立于药物泵出增多致细胞内药物蓄积浓度降低这一经典耐药机制.     

不同来源骨髓基质细胞微环境对Jurkat细胞生物学特性的影响

目的观察正常及急性淋巴细胞白血病骨髓基质细胞微环境对Jurkat细胞生物学特性的影响。方法收集与正常及急性淋巴细胞白血病骨髓基质细胞微环境共培养10d的Jurkat细胞,观测Jurkat细胞增殖、细胞周期分布、凋亡、分化及DNR摄药量的改变。结果白血病骨髓基质细胞微环境对Jurkat细胞黏附、趋化及降低摄药量的作用强于正常骨髓基质细胞微环境;抑制增殖及促分化作用弱于正常骨髓基质细胞微环境。白血病骨髓基质细胞微环境抑制Jurkat细胞凋亡,而正常骨髓基质细胞微环境促进其凋亡。结论正常骨髓源基质细胞微环境较白血病源骨髓基质细胞微环境对Jurkat细胞具有更强的促进凋亡、分化及抑制增殖的作用,增加Jurkat细胞对DNR的敏感性。     

人淋巴细胞白血病细胞黏附介导耐药模型构建初探

目的 构建白血病细胞黏附介导耐药(cell adhesion mediated drug resistance,CAM-DR)模型,从一新的角度研究白血病细胞耐药机制.方法 采用人淋巴细胞白血病Jurkat细胞株与经60Co射线照射后的白血病骨髓基质细胞贴壁层共培养构建CAM-DR模型,应用扫描电镜从形态及结构对该模型进行鉴定;MTT法测定柔红霉素(daunorubicin,DNR)在Jurkat细胞中的IC50及运用流式细胞仪检测DNR在Jurkat细胞内的储积浓度及分布;Annexin V-FITC/PI双参数法流式细胞仪定量Jurkat细胞凋亡率.结果 Jurkat细胞与骨髓基质细胞共培养24 h,即观察到Jurkat细胞通过伪足黏附于骨髓基质细胞层,部分Jurkat细胞通过伪足龛于骨髓基质细胞融合所形成的"网眼"中,培养48 h时可见部分Jurkat细胞移行到骨髓基质细胞层下,包裹于骨髓基质细胞层内,并可见Jurkat细胞呈巢状龛于骨髓基质细胞"网眼"中.该模型未影响DNR在Jurkat细胞中的蓄积及分布,但显著抑制了DNR诱导Jurkat细胞的凋亡及Jurkat细胞对DNR的反应性.结论 成功构建了CAM-DR模型,从一新的角度为进一步研究白血病细胞耐药机制奠定了基础.     

上调白血病骨髓基质细胞GJIC功能对Jurkat细胞药物敏感性的影响

目的 观察上调白血病骨髓基质细胞间隙连接细胞间通讯(GJIC)功能对共培养的人急性淋巴细胞白血病细胞株(Jurkat)细胞药物敏感性的影响.方法 体外培养白血病骨髓基质细胞,转染Cx43基因,罗氏黄染料传输法检测转染后骨髓基质细胞的GJIC功能变化;将Jurkat细胞与转染Cx43基因的骨髓基质细胞共培养,观察共培养的Jurkat细胞对化疗药物甲氨蝶呤(MTX)药物敏感性的改变.结果 转染Cx43基因的白血病骨髓基质细胞的GJIC功能明显增加;与转染Cx43基因的骨髓基质细胞共培养的Jurkat细胞在MTX作用下的存活率(61.3±3.24)%较未转染Cx43基因的骨髓基质细胞共培养的Jurkat细胞(82.4±3.12)%明显下降;与转染Cx43基因的骨髓基质细胞共培养的Jurkat细胞在MTX作用下的凋亡率(48.1±3.78)%较与未转染Cx43基因的骨髓基质细胞共培养的Jurkat细胞(18.5±3.43)%明显增加,差异有统计学意义(P<0.01).结论 上调白血病骨髓基质细胞GJIC功能能够增加共培养的Jurkat细胞对化疗药物的敏感性.     

不同来源基质细胞对骨髓瘤KM3细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察人脐血基质细胞及骨髓瘤患者骨髓基质细胞对骨髓瘤KM3细胞生物学特性的作用.方法 体外分离培养骨髓瘤骨髓基质细胞和人脐血源基质细胞,与骨髓瘤KM3细胞共培养.采用扫描电镜观察共培养后基质细胞和KM3细胞的位相关系;应用CCK-8、P I染色流式细胞仪和Annexin V/P I双标法检测不同培养条件下KM3细胞的增殖、细胞周期和凋亡率.结果 人脐血基质细胞比骨髓瘤患者骨髓基质细胞有更强的抑制KM细胞增殖的作用;共培养后骨髓瘤患者骨髓基质细胞使KM3细胞阻滞于G0/G1期[(59.70±1.28)%],人脐血基质细胞使S期的KM3细胞比例增高[(46.07±2.46)%];KM3/MM-BMSCs组KM3细胞凋亡率为(3.26±0.12)%明显低于KM3/hUCBDSCs组KM3细胞凋亡率(4.76±0.12)%(P<0.01);KM3/MM-BMSCs组KM3细胞Bax mRNA的表达较KM3/hUCBDSCs组明显下降(P<0.01);KM3/hUCBDSCs组KM3细胞Bcl-2 mRNA的表达较KM3细胞悬浮培养组下降(P<0.05),KM3/MM-BMSCs组KM3细胞Bcl-2 mRNA的表达则明显升高,为悬浮培养组的1.982倍(P<0.01).结论 骨髓瘤基质细胞微环境抑制骨髓瘤细胞凋亡和死亡;而人脐血源基质细胞有更强的抑制骨髓瘤细胞增殖的作用,并促进其凋亡.     

柔红霉素诱导急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡的作用因素研究

目的 探讨柔红霉素(DNR)致急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞株凋亡的作用因素.方法 不同浓度(0、0.05、0.1、0.5、1μg/mL)DNR及N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理组作用于Jurkat细胞株,采用MTT法检测细胞活力,Hoechst/PI双染法观察细胞凋亡,流式细胞术检测细胞活性氧(ROS)浓度及凋亡,RT-PCR法检测bax、survivin、bcl-2和bcl-xl基因的表达.结果 DNR可明显抑制Jurkat细胞株的活性,0、0.05、0.1、0.5、μg/mL的DNR及NAC预处理组分别作用于Jurkat细胞株24 h后,ROS水平分别为(7.98±0.55)%、(8.88±0.86)%、(9.46±0.98)%、(17.48±2.98)%、(24.46±2.43)%和(11.59±1.29)%,加入NAC后ROS生成受到抑制(P<0.01);细胞凋亡率分别为(11.41±1.44)%、(34.96±3.32)%、(45.58±3.12)%、(84.19±2.65)%、(87.93±1.74)%和(80.47±0.63)%,NAC预处理组与0.5 μg/mL DNR组比较,细胞凋亡率变化无统计学意义(P>0.05).NAC抑制bax基因mRNA表达,上调survivin、bcl-2和bcl-xl表达(均P<0.05).结论 DNR能够诱导Jurkat细胞株凋亡;ROS参与了DNR诱导的Jurkat细胞株凋亡;凋亡相关基因bax、bcl-2、bcl-xl及survivin能够与ROS相互作用,调节DNR诱导的Jurkat细胞株凋亡.     

柔红霉素诱导Jurkat细胞凋亡的实验研究

目的探讨柔红霉素在体外诱导Jurkat细胞发生凋亡的规律.方法应用DNR体外作用于Jurkat细胞,研究DNR诱导Jurkat 细胞凋亡的规律,Annexin V/PI双标法流式细胞仪检测Jurkat细胞凋亡率,PI染色流式细胞仪检测细胞周期分布.结果 0.1～2.0μmol/L浓度范围DNR作用一定时间后,Jurkat细胞的凋亡率随药物浓度的增加与作用时间的延长而升高.DNR作用后Jurkat细胞G2/M期比例明显增加.结论一定浓度的DNR在体外可诱导Jurkat细胞凋亡,在一定的剂量范围内,呈现剂量-效应、时间-效应关系,其机制可能与DNR抑制细胞有丝分裂有关.     

新型白血病骨髓基质细胞黏附介导耐药模型构建的探索性研究

目的以急性淋巴细胞白血病（ALL）患者骨髓基质细胞（BMSC）构建白血病细胞黏附介导耐药（CAM—DR）模型,从一新的角度探讨CAM—DR在白血病细胞耐药中的作用。方法采用人淋巴细胞白血病Jurkat细胞株与经^60Co射线照射后的ALL骨髓基质细胞贴壁层共培养构建CAM—DR模型,应用扫描电镜从形态及结构对该模型进行鉴定;四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）和流式细胞仪分别测定柔红霉素（DNR）对Jurkat细胞的细胞毒作用、DNR在Jurkat细胞中的储积浓度及分布。结果扫描电镜结果显示CAM—DR模型中Jurkat细胞通过伪足黏附于骨髓基质细胞层,或移行到骨髓基质细胞层下,并可见Jurkat细胞呈巢状龛于骨髓基质细胞“网眼”中。流式细胞结果显示该模型并未影响DNR在Jurkat细胞中的蓄积及药物的分布,但显著抑制了Jurkat细胞对DNR的反应性。结论成功构建了以白血病BMSC为基础的CAM—DR模型,为进一步研究白血病细胞耐药机制奠定了理论和实验基础。     

雷公藤甲素对白血病HL-60和Jurkat细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨雷公藤甲素对人急性髓系白血病HL-60细胞、急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞增殖及凋亡的影响。方法:采用MTT法、Annexin V-FITC/PI双染法、PI染色法、透射电镜观察不同浓度雷公藤甲素作用于两种细胞,对其生长增殖、凋亡、细胞周期及形态等方面的影响。结果:雷公藤甲素能显著抑制HL-60、Jurkat细胞的增殖,降低其存活率。给药24 h后,半数细胞抑制剂量(IC50)分别为(42.50±9.38)nmol/L和(60.91±9.77)nmol/L。能以剂量依赖方式诱导两种细胞凋亡,细胞周期分布G1期比例增加,S期比例降低(P<0.05),且伴有典型的细胞凋亡形态学改变。结论:雷公藤甲素能显著抑制HL-60、Jurkat细胞的生长增殖,并诱导细胞凋亡。     

Effect of gamma irradiation on nuclear factor—kappa B in cultured bone marrow stromal cells

Objective: To explore the effect of gamma irradiation on nuclear factor-kappa B in cultured bone marrow stromal cells. Methods: Immunocytochemistry, Western blot and electrophoretic mobility shift assay (EMSA) were used. Results: The expression of NF-kB in cultured mouse bone marrow stromal cells (BM-SCs) on the level of protein was elevated after exposure to 60Co in the dosage of 8. 0 Gy with the use of im-munocytochemistry and Western blot. The activity of nuclear factor-kappa B in cultured BMSCs was significantly increased after exposure to gamma irradiation by using EMSA. The activity peak was at the 4th h after irradiation. Conclusion: Our results suggest that the activation of nuclear factor-kappa B in the BMSCs after irradiation may be involved in the protection of BMSCs against apoptosis and in the recovery of hematopoiesis after radiation.     

胎儿骨髓基质细胞与外源性细胞因子的协同造血支持作用

目的 :探讨胎儿骨髓基质细胞与外源性细胞因子的协同造血支持作用。方法 :联合应用胎儿骨髓基质细胞与外源性细胞因子如重组人干细胞因子 (rh SCF)、IL - 3、IL - 6、粒巨噬细胞集落刺激因子 (GM- CSF)、粒细胞集落刺激因子 (G- CSF)、促红细胞生成素 (EPO)等先后对成人骨髓单个核细胞及 CD34 + 富集细胞培养 5 d至 2周。结果 :胎儿骨髓基质细胞与上述细胞因子具有良好的协同作用 ,CD34 +富集细胞以胎儿骨髓基质细胞 +SCF+IL- 3+IL- 6 +G- CSF+EPO培养 2周 ,可使细胞总数、粒 -单系造血祖细胞 (CFU- GM)、早期红系造血祖细胞 (BFU- E)及 CD34 +细胞分别扩增 (119.6± 30 .9)倍、(5 4.6± 17.4)倍、(2 5 .2± 4.4)倍、(11.1± 4.2 )倍。结论 :胎儿骨髓基质细胞可协同上述外源性细胞因子支持成人骨髓造血祖细胞的有效扩增     

小鼠c-Kit+lin-骨髓细胞移植生成肝细胞的实验研究

目的 评价小鼠c-Kit^＋Lin-骨髓细胞的肝干细胞潜能,为骨髓源性肝干细胞的临床运用提供可行性实验依据。方法 供体为纯系BALB／C雄性小鼠．c-Kit^＋Lin-骨髓细胞采用免疫磁珠分选法分离细胞。受体为行35Gy全肝照射处理后的同龄同系BALB／C雌性小鼠,立即移植供体c-Kit^＋lin-骨髓细胞。接受c-Kit^＋lin-骨髓细胞移植1月后,活杀取肝做常规病理学检查、Y染色体的原位杂交检查、甲胎蛋白与白蛋白的免疫组化检测。结果 移植1月后小鼠肝脏的组织结构已恢复正常．肝组织细胞中存在原位杂交和免疫组化均呈阳性反应的双阳性细胞。结论 小鼠c-Kit^＋Lin-骨髓细胞具有肝干细胞潜能,移植后可以在肝内定居并分化形成肝细胞。可做为肝病细胞移植疗法的种子细胞。     

小鼠骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞的实验研究

目的探讨小鼠骨髓基质细胞体外诱导及向神经细胞方向分化.方法从小鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSC),应用碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF),维甲酸(retinoic acid, RA),二甲亚砜和神经生长因子(nerve growth factor, NGF)对细胞诱导分化,72 h后对细胞表达神经微丝蛋白(NF-200),胶质原性纤维酸性蛋白(GFAP),纤维结合素(fibronectin)的结果进行荧光和组化检测.结果诱导72 h后细胞形态类似神经细胞改变,免疫组化显示约60%细胞分化为NF-200阳性细胞,约50%细胞分化为GFAP阳性细胞,同时细胞fibronectin表达明显降低,与对照组比较相差显著.结论维甲酸,神经生长因子,二甲亚砜,碱性成纤维细胞生长因子的联合作用可体外诱导骨髓基质细胞向神经细胞分化.     

体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的体外分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其一般的生物学特性.方法通过密度梯度离心法分离MSCs、体外培养传代细胞计数、流式细胞仪检测细胞增殖周期、表面分子测定以及细胞化学染色了解人MSCs一般的特点.结果人MSCs经过体外培养均一地表达CD29、CD44、CD166,而CD34、CD45阴性.细胞化学结果显示,细胞糖原(PAS)强阳性,脂肪(SB)为阴性,5%～10%细胞碱性磷酸酶(ALP)阳性.细胞周期分析表明:G0/G1、S和G2/M所占比例分别为83.11%、5.17%和11.72%.分离细胞在成骨诱导体系下进一步向成骨细胞分化.结论密度梯度离心法能够分离纯化MSCs有其特殊的生物学特点,能够向成骨细胞分化.     

不同来源树突状细胞的培养研究

目的 比较不同来源的树突状细胞(DC)在体外扩增、分化成熟的特点。方法 将骨髓和外周血采集物作为DC的培养源,联合GM-CSF、IL-4细胞因子培养DC,观察培养过程中DC的超微结构变化,检测其免疫表型。结果 外周血采集物培养的DC成熟明显早于骨髓采集物培养的DC(P<0.01)。DC表型CD1a-PE、HLA-DR-PE、CD54-FITC、CD80-FITC的阳性率平均值在骨髓组和外周血组分别为23.3±3.6和25.8±2.2、95.0±2.1和96.9±1.0、54.4±1.4和56.1±1.2、40.5±2.7和41.7±1.8(P>0.05)。结论 外周血组DC表型的阳性率稍高于骨髓组,但获取费用较昂贵,适用范围有限;骨髓来源则较简便,但培养成熟时间较长,且受个体差异的限制。     

大鼠骨髓基质干细胞向神经元样细胞的分化

目的:体外定向诱导大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）向神经元样细胞的分化。方法： 用DMEM培养液冲洗骨髓,收集骨髓细胞接种在培养瓶中体外扩增、纯化。用诱导剂诱导BMSCs分化为神经元样细胞。用免疫组化ABC法鉴定神经丝蛋白（NF-200）、微管相关蛋白（MAP-2）、神经元特异核蛋白（NeuN）、巢蛋白(Nestin) 、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、GAD和ChAT的表达。结果： BMSCs经诱导后,胞体增大,并伸出细长突起,与神经元形态相似。免疫组化显示大部分细胞NF-200,MAP-2,NeuN和Nestin表达阳性,(3±0.8)%的细胞GAD表达阳性,(5±0.3)%的细胞ChAT表达阳性,而GFAP 表达阴性。结论： BMSCs可被诱导分化为神经元样细胞,部分细胞可表达GAD与ChAT。     

大鼠骨髓基质细胞的体外分离、培养和鉴定的实验研究

目的:观察大鼠骨髓基质细胞在体外培养的条件及生物学特性并加以鉴定.方法:取Wistar大鼠骨髓,分离培养骨髓基质细胞(BMSC),相差显微镜下观察其形态,传代后观察其生长特性,用免疫组化方法加以鉴定.结果:原代培养20d后可分离得到BMSC,在5代以前生长形态相对稳定,典型的BMSC可分为两个类型.结论:BMSC具有贴壁生长特性,较易对其进行分离扩增,增殖速度快,可用于多种疾病的细胞治疗.     

骨髓间充质干细胞培养条件的改良及其定向分化

目的：探讨建立大鼠骨髓间充质干细胞（ BMSCs）快速、有效的体外分离纯化方法。方法全骨髓离心贴壁法分离大鼠BMSCs;分别采用同种异体血清培养基（同种异体血清组）、胎牛血清培养基（胎牛血清组）、无血清培养基（无血清组）培养BMSCs,传代后换用胎牛血清培养;12、24、48、72 h和5 d首次换液;绘制P3代BM-SCs生长曲线;免疫荧光鉴定BMSCs CD44和vimentin的表达;诱导BMSCs的骨向、内皮向分化;茜素红检测钙结节表达;免疫荧光鉴定血管内皮样细胞CD31和vWF的表达。结果（1）同种异体血清组及胎牛血清组细胞形态均一,生长速率相似。（2）P3代BMSCs生长曲线显示：同种异体血清组与胎牛血清组倍增速率相似,均快于无血清组。（3）P3代BMSCs免疫荧光染色显示：同种异体血清组与胎牛血清组CD44、vimentin表达均高于无血清组。（4）成骨诱导14 d后,茜素红染色可见大量橘红色钙化结节形成。（5）内皮诱导14 d后,内皮样细胞表面标志物CD31、vWF阳性。结论改良培养条件后所获得的骨髓细胞具有间充质干细胞的表型和功能特点。