双阴性选择法纯化培养人骨髓多能成体祖细胞

目的 建立体外分选纯化及培养人骨髓来源多能成体祖细胞(MAPCs)的方法.方法 取健康成人志愿者适量骨髓采用梯度密度离心法分离获取单个核细胞,贴壁培养后,将获取的骨髓贴壁细胞通过CD45、血糖蛋白A(GlyA)免疫微磁珠(miniMACS)负分选,流式细胞术鉴定分选后细胞纯度;对传代到不同阶段的细胞进行CD45、GlyA流式细胞分析,初步了解MAPCs在培养、增殖过程中的免疫学稳定性.结果 通过miniMACS分选,平均每1×10⁶/ml骨髓贴壁细胞可分选出约(5～10)×10⁴/ml的MAPCs,分选前后细胞活力分别为(96.7±1.7)%和(96.0±2.4)%,无明显差异;自制的培养基培养分选后的MAPCs生长良好,最长传代到第16代;流式细胞仪分析获取的CD45、G1yA-细胞纯度大于98%;流式细胞仪分析传代第4、8、12代MAPCs,CD45^-、G1yA^-细胞纯度大于98%.结论 CD45、GlyA miniMACS负分选可从骨髓中分离高纯度的MAPCs;MAPCs在本室自制的人MAPCs培养基中体外有较强的增殖能力,且能保持较长时间的稳定状态.     

钩吻素子对免疫磁珠分离纯化的小鼠CD4^＋T细胞体外增殖的影响

OBJECTIVE: To assess the separation efficiency of magnetic-activated cell sorting in the purification of CD4+ T cells from murine spleen, and observe the effects of koumine on the proliferation of the separated cells. METHODS: CD4+ T cells were isolated from murine spleen by magnetic-activated cell sorting (MiniMACS). Fluorescence-activated cell sortering was employed to determine the purity of CD4+ T cells before and after the separation procedure followed by evaluation of the cell viability using trypan blue staining. Concanavalin A- (ConA, 5 microg/ml) or phytahematoagglutinin (PHA,1 mg/ml)-induced murine T cells were treated with different concentrations of koumine (10-320 microg/ml), and their proliferation was determined by MTT colorimetry, and enzyme-linked immunosorbent assay was used to measure IL-2 level in the cell culture supernatant. RESULTS: The purity of CD4+ T cells reached (90.3+/-5.8)% after the purification with a cell viability of (94.9+/-3.6)%. Koumine (20-320 microg/ml) dose-dependently inhibited ConA- or PHA-induced proliferation of murine lymphocytes as compared with the controls (P<0.05). Koumine (20, 100, and 200 microg/ml) significantly decreased the level of IL-2 in comparison with the control group (P<0.05). CONCLUSIONS: CD4+ T cells of high purity can be obtained from murine spleen using MiniMACS without impairing the viability of the cells. Koumine significantly inhibits the proliferation of murine CD4+ T cells due to its immunosuppressive effect and inhibition of IL-2 secretion.     

大鼠骨髓间质干细胞培养扩增及表面标志

目的 建立体外分离培养大鼠骨髓间质干细胞(MSC)方法．探讨MSC的扩增与鼠龄的关系及其部分细胞表面标志的动态改变。方法 分别取2月龄和5月龄鼠骨髓，经密度梯度离心后取单核细胞层接种．待细胞长满后进行传代．隔日行细胞计数。对2月龄鼠的4代MSC分别进行表面标志抗原动态观察。结果2月龄鼠MSC的扩增率明显高于5月龄鼠MSC。流式细胞仪鉴定显示随着传代次数增多，CD29阳性率趋向升高；CD90阳性率趋于降低；CD34与CD45阴性率趋于升高。结论 进行大鼠MSC培养扩增时MSC的取材可能要考虑大鼠月龄。在MSC培养扩增的过程中其表面抗原标志会发生变化．这些变化可能表示了细胞纯度的变化。     

人骨髓间充质干细胞体外分化为雪旺样细胞的方法

目的 :建立人骨髓间充质干细胞体外向雪旺样细胞定向诱导分化的方法。方法 :取健康人骨髓血标本 ,利用percoll(密度为 1.0 73 g·ml-1)分离骨髓单个核细胞 ,在DMEM LG + 10 % (体积分数 )FBS中培养 ,通过流式细胞术对培养细胞进行表型测定 ,对第 2、3、5、8代间充质干细胞进行定向诱导分化 ,用单抗S 10 0、神经胶质纤维酸性蛋白 (glialfibrillargacidicprotein ,GFAP) ,通过免疫组化方法对诱导的细胞进行鉴定。 结果 :经 percoll分离的间充质干细胞可传 16代 ,细胞数增加了大约 6× 10 7倍。流式细胞术结果显示 :percoll分离出来的未经培养的细胞 ,其CD2 9+CD4 4 +CD3 4 -CD4 5 -细胞数为 3 2 .4 7%± 3 .4 9% ,而培养后贴壁细胞中CD2 9+CD4 4 +CD3 4 -CD4 5 -细胞数为 94 .3 8%± 1.5 0 %。诱导后免疫组化染色结果显示 :由 β ME +bFGF预诱导、β ME +bFGF诱导的S 10 0阳性细胞最多 ,可达 90 %± 4 % ,GFAP阳性细胞为 2 1%± 5 %。结论 :人骨髓中间充质干细胞能定向诱导分化成雪旺样细胞。     

钩吻素子对免疫磁珠分离纯化的小鼠CD4+T细胞体外增殖的影响

目的 探讨小鼠脾脏CD4⁺T细胞的分离方法,观察钩吻素子(Kou)对小鼠脾脏CD4⁺T细胞体外增殖的影响.方法 以免疫磁珠分选法从小鼠脾脏细胞中分离CD4⁺T细胞,流式细胞术检测所得细胞的纯度,台盼蓝法检测细胞活力.将10～20μg/ml Kou分别作用于经刀豆蛋白A或植物血凝素刺激的小鼠T淋巴细胞,四唑盐比色法检测细胞增殖情况,用酶联免疫法检测细胞上清中IL-2的含量.结果 经过流式细胞仪测定分离后的小鼠脾脏CD4⁺T细胞纯度达到90.%±5.8%:0.2%台盼兰染色细胞活力为94.9%±.6%;增殖试验表明分离后未加Kou的CD4⁺T细胞对刀豆蛋白A、植物血凝素的刺激保持了良好的增殖能力,当浓度范围为20～20μg/ml时,Kou均能抑制淋巴细胞的增殖(P<0.05),且表现出一定的剂量相关性;不同浓度的Kou(20、100、200μgm1)作用后,CD4⁺T细胞培养上清中的IL-2水平明显低于对照组(P<0.05).结论 免疫磁珠阴性分选法操作简单、快速,可获得较高纯化率、有活性的CD4⁺T细胞;Kou明显抑制小鼠CD4⁺T淋巴细胞增殖反应,此抑制作用可能与Kou抑制小鼠CD4⁺T细胞IL-2的分泌及免疫抑制作用相关.     

人骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化的实验研究

目的:探索体外分离子与培养人骨髓间充质干细胞的方法,同时研究其细胞生物学特性,分析其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法:分离人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stemcells,hBMSCs),通过常规培养,在体外观察其生长特性、抗原表达等特征;然后通过条件培养基定向诱导,观察其分化潜能。结果:人骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,常规培养条件下,原代培养需要2～3周,转代后生长速度加快;应用流式细胞仪检测MSCs的表面抗原,CD44、CD29、CD105阳性,CD45、CD06、CD34以及HLA-DR阴性;在相应条件培养基的诱导作用下,MSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞以及神经细胞。结论:人骨髓间充质干细胞可以从骨髓中分离并在体外培养增殖,同时在体外具有多向分化潜能,可以分化成为骨细胞,符合骨组织工程种子细胞的要求。     

骨髓间充质干细胞体外可定向诱导为内皮细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力。方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含VEGF、bFGF的诱导分化培养液定向诱导传代使细胞向血管内皮细胞分化,免疫荧光及免疫组化检测内皮细胞特异性标志物鉴定。结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后的细胞具有内皮细胞的形态学特征可表达CD31及Ⅷ因子。结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化。     

小鼠骨髓间充质干细胞接种小鼠肝癌组织诱发肝癌细胞坏死

目的:观察小鼠骨髓间充质干细胞(mesenehymal stem cells,MSCs)移植对H22原位肝癌移植小鼠生存期的影响,探讨小鼠骨髓MSCs在肝癌微环境中是否向肝细胞分化和可能的抗肿瘤机制.方法:体外利用贴壁培养法联合免疫磁珠阴性分选CD45-、CD11b-细胞法制备BALB/c小鼠骨髓MSCs,流式细胞仪行细胞表面标志鉴定,采用绿色荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯[5(6)-carboxyfluoresce indiacetate N-succinimidyl ester,CFSE]对其标记后备用.随机取12只8周龄BALB/c小鼠,肝脏原位注射法建立小鼠H22原位肝癌移植模型,建模1周后随机分为MSCs移植组和对照组,开腹亢视下分别注射入肝癌组织和/或同一肝叶的正常肝组织内.观察荷瘤小鼠生存期,利用免疫荧光法和激光共聚焦技术检测小鼠肝组织白蛋白表达,并行常规组织学检查.结果:MSCs移植组平均生存期为25 d(95%可信区间:22～28 d),对照组平均生存期为21 d(95%可信区间:20～23 d),但组间生存期差异无统计学意义(P=0.0713).激光共聚焦显微镜观察到在肿瘤边缘和瘤体内可见CFSE标记细胞有白蛋白表达;另与对照组相比,MSCs移植组肝癌组织内出现大片坏死.结论:小鼠骨髓MSCs可在原位肝癌移植小鼠模型的肝脏定植,并且能分化为具有肝细胞功能的肝细胞样细胞,同时可能诱发肿瘤细胞坏死,机制有待进一步研究.     

慢性高原病患者骨髓间充质干细胞的体外扩增及鉴定

目的探讨慢性高原病（chronic mountain sickness,CMS）患者骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs）的体外培养方法、生物功能及分子生物学特征。方法采用密度梯度离心和贴壁筛选法对15例CMS患者（CMS组）和15例正常人（对照组）骨髓MSCs进行分离培养,于倒置显微镜下观察MSCs形态,用流式细胞仪行细胞表面抗原检测,检测MSCs生长情况,测定生长曲线。结果采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞（BMMNC）后培养,骨髓MSC均分离培养成功,贴壁细胞呈梭形;两组骨髓MSCs均表达CD29、CD105和CD13,不表达CD45、CD4、CD8、CD14、CD3、CD34、HLA—DR和CD20。CMS组MSCs增殖能力高于对照组（P〈0．01）,但传代率低于对照组（P〈0．05）,对P3代细胞生长曲线进行观察发现CMS骨髓MSCs生长较对照组活跃。结论CMS患者骨髓MSCs在体外可有效分离培养,所培养扩增的细胞成分单一,CMS患者骨髓MSCs具有其特有的生物学特性。