检测抗HIV-1/2型抗体的双抗原夹心方法的建立及其试剂盒的研制

目的 建立更敏感的检测人免疫缺陷病毒（HIV）抗体的方法,并研制检测试剂盒。方法 根据HIV－1／2型的基因序列及其所编码氨基酸结构,采用固相法合成了HIV－1型的gp41.1、gp41.2、gp120、p24和HIV－2型的gp36五条多肽,混合包被酶标板作为固相抗原。用辣根过氧化物酶标记以上多肽抗原作为标记物,建立检测血清中抗HIV－1／2抗体的双抗原夹心ELISA法。同时,应用该方法制备检测HIV抗体的试剂盒,并检测三批中国卫生中药品和生物制品检定所HIV诊断试剂国家参比品。结果 建立了检测HIV－1／2抗体的双抗原夹心法。用检定所参比品检测,该方法特异性、灵敏度均为100％,变异系数小于10％。与间接法相比较其灵敏度、特异性均高于间接法（P＜0．05）。检测210份其他病种患者血清均为阴性。与GBI公司的HIV抗体诊断试剂比较,检测40份卫生部药品和生物制品检定所提供的质控参比品（阳性20份,阴性20份）,GBI试剂阴、阳性符合率及总符合率分别为100%(20/20)、85％（17／20）及92．5％（37／40）,而应用该方法所研制的诊断试剂盒、阳性符合率及总符合率为100％。该试剂已通过国家卫生部质检。与雅培公司HIV诊断试剂比较检测90份献血员血清和88份HIV－1／2型感染者血清,符合率为100％。试剂盒于37℃放置4d后的检测结果的阴、阳性判定不受影响。结论 本法特异性强、灵敏度高、稳定性好,适用于献血员的筛选和临床HIV感染的检测。     

双抗原夹心法检测抗HIV-1/2总抗体方法的建立和评价

目的 进一步提高HIv感染诊断试剂的敏感性。方法 以人工合成的HIv—1 gp41．1(sP1)、gp41．2(sP2)、gp120(sP3)、P24(sP4)和HIV—2gp36(sP5)5条多肽，采用双抗原夹心酶链免疫吸附试验(ELISA)原理，以sP1、sP3、sP4和sP5混合包被酶标板作为因相抗原，辣根过氧化物酶标记sp1、sp2、sP4和sP5多肽为标记物，建立了检测抗HIV—1／2总抗体的双抗原夹心ELISA法。结果 检测卫生部药品生物制品检定所第2代40份质控参比血清，其特异性和灵敏度均为100％，高于间接ELISA法(特异性为90％，灵敏度为65％)。检测210份其他病种患者血清均为阴性，与雅培HIVAB试剂比较检测如份健康献血员血清和88份HIv感染者血清，符合率为100％。结论 本方法特异性强、敏感性高，操作简便，适用于献血员的筛选和临床HIv感染的检测。     

同时检测HIV抗体及p24抗原快速诊断试剂的研制

目的：研制可同时检测HIV－1、HIV－2抗体及p24抗原的胶体金快速诊断试剂。方法：利用重组杆状病毒－昆虫细胞系统进行HIV－1 gp41及HIV－2 gp36抗原的高效表达，以免疫亲和层析法纯化抗原。抗－HIV p24单克隆抗体杂交瘤细胞株，并制备抗－HIV p24单克隆抗体。以硝酸基纤维膜为载体，以纯化的HIV－1 gp41、HIV－2 gp36抗原及抗p24抗体点膜，20nm胶体金颗粒／抗人IgG和抗－HIV p24单克隆抗体进行标记，对33份已知HIV感染者阳性血清及6份阴性血清进行检测。结果：通过重组杆状病毒－昆虫细胞系统进行HIV－1 gp41及HIV－2 gp36抗原的表达，可获取浓度为2．0mg/L的纯化抗原。从抗p24单克隆抗体杂交瘤细胞株中培养上清液，通过葡萄球菌蛋白A免疫亲和层析柱可得到1．5mg/L的纯化抗体。利用纯化的抗原抗体进行标记，对39份已知血清进行检测，与荷兰Organon公司HIV1＋2抗体、p24抗原、ELISA诊断试剂同时检测结果进行比较，证实有较强的特异性及敏感性。结论：同时检测HIV－1、HIV－2抗体及p24抗原快速诊断试剂的问世，可为HIV感染的诊断提供一个简便、可靠、敏感的方法。     

甲肝IgM抗体诊断试剂盒在甲肝病毒抗原检测中的应用

将HAV IgM-Ab诊断试剂盒用HAV-Ag标准品调控灵敏度后,用于检测HAV-Ag,并比较快速检测法和常规过夜法两种检测方法的测定效果,以选择在甲肝疫苗生产中,抗原检测的合适方法.经过调控灵敏度后,抗HAV IgM诊断试剂盒完全可以用来检测HAV-Ag.并可以正确评价HAV-Ag滴度,HAV感染性滴度.适用于甲肝疫苗的检定工作.     

国产HIV-1p24抗原检测试剂盒的评价

目的探讨国产的HIV-1 p24抗原检测试剂盒进行药物筛选研究的可行性。方法对国产试剂盒的使用性能与Biomerieux公司商品化的Vironostika试剂盒进行比较,评估国产试剂盒的敏感性、重复性及检验效能。结果国产试剂盒具有较高的敏感性和重复性,在体外药效学筛选实验中国产试剂盒的阳性检出率及药物评价结果与Vironostika试剂盒差异无统计学意义(P>0.05)。结论国产试剂盒具有较好的使用特性,在药物筛选中可以用国产试剂盒替代Vironostika试剂盒。     

HIV-1膜蛋白抗原优化改造研究进展

HIV-1的外膜糖蛋白能与T细胞或单核／巨噬细胞表面的CD4受体分子结合，从而起始HIV感染靶细胞的生物学过程。由于HIV-1膜蛋白是中和抗体的主要作用靶位，因此成为HIV疫苗中不可缺少的组分。越来越多的研究表明：天然HIV-1膜蛋白不能激发有效的中和抗体，所以需要对膜蛋白进行优化改造，以提高中和表位的免疫原性。本文就近年来HIV-1膜蛋白抗原优化改造研究做一简要回顾以供参考。     

HIV-1膜蛋白抗原优化改造研究进展

HIV-1的外膜糖蛋白能与T细胞或单核/巨噬细胞表面的CD4受体分子结合,从而起始HIV感染靶细胞的生物学过程。由于HIV-1膜蛋白是中和抗体的主要作用靶位,因此成为HIV疫苗中不可缺少的组分。越来越多的研究表明天然HIV-1膜蛋白不能激发有效的中和抗体,所以需要对膜蛋白进行优化改造,以提高中和表位的免疫原性。本文就近年来HIV-1膜蛋白抗原优化改造研究做一简要回顾以供参考。     

ELISA弓形虫IgG抗体试剂盒的研制

弓形虫病 (Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ)是一种人兽共患的寄生虫病。病原体为弓形虫 (Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ) ,属球虫类原虫 ,广泛分布于世界各地 ,人和动物普遍易感。许多欧美国家的血清试验阳性率达 2 5～ 50 %。我国自 1 980年以来 ,在全国范围内进行了人和动物弓形虫病的流行病学调查 ,所调查地区均发现弓形虫感染 ,说明我国弓形虫感染和弓形虫病分布十分广泛 ,人体感染弓形虫后 ,体内最先产生的是循环抗原 (ＣＡｇ) ,最早出现的抗体是ＩｇＭ抗体 (病期的 7～ 8天 ) ,它是早期弓形虫感染诊断的主要指标 ,随后出现ＩｇＡ抗体…     

HIV-1 p24抗原检测的应用研究

目的：用抗ＨＩＶ－１ｐ２４单克隆抗体和多克隆抗体和多克隆抗体构建的间接ＥＬＩＳＡ试剂,检测ＨＩＶ－１抗体阳性及其它样品,探讨应用的可行性。方法：采用单克隆抗体固相、兔抗ＨＩＶ－１ｐ２４抗体夹心,羊抗兔ＨＲＰ结合物的间接ＥＬＩＳＡ法。结果：显示试剂盒ＨＩＶ－１ｐ２４抗原检出灵敏度为５０ｐｇ／ｍｌ（基因工程抗原）;特异性９９．４６％;ＨＩＶ抗体阳性血样性率３．２％;抗体阴性的特殊人群血样阳性率３．９＆     

一种新型甲型H1N1流感核酸双检诊断试剂盒的验证评价

目的验证一种“甲型流感通用型及H1N1型病毒核酸双检试剂盒（PCR-荧光探针法）”。方法连续收集流感样患者咽拭子标本150例,提取RNA后,以北京市CDC配发的“甲型H1N1流感病毒Real—timePCR诊断试剂盒”为对照,同时用待评价的双检试剂盒平行扩增,对结果进行Kappa一致性检验和McNemar x2差异性检验以及计算两种方法的检测一致率。结果待验证的双检试剂盒与北京市CDC配发的Real—timePCR诊断试剂盒的一致率,通用引物M为97．33％,H1N1为98．67％。经Kappa一致性检验和MeNemarX。差异性检验,两种方法诊断试剂盒有较高的一致性（分别为Z=10．6466,P〈0．0001和Z=11．3402,P〈0．0001）,且待验证双检试剂盒相对于CDC配发试剂的“假阴性率”和“假阳性率”很低（分别为P=0．3173〉0．05和P=1．000〉0．05）。结论上海科华生物工程股份有限公司生产的“甲型流感通用型及H1N1型病毒核酸双检试剂盒（PCR．荧光探针法）”对于甲型流感通用型和H1N1型的诊断均有良好的诊断特性。     

HIV抗体快速检测试剂的临床评价

目的对注册前的HIV抗体快速检测试剂的质量进行临床评价。方法用不同的评价试剂检测440份健康献血员样品、300份HIV抗体强阳性样品以及264份HIV感染高危人群样品，并分别计算其特异性和敏感性。结果17家注册前试剂检测300份HIV抗体强阳性样品的敏感性为100％；检测440份健康献血员样品的特异性为97．7％-100％；检测264份HIV感染高危人群样品的特异性为59．1％-100％，敏感性为70．3％-95．1％。结论不同试剂之间存在敏感性和特异性的差异，而且HIV感染的高危自然人群来源的样品有助于客观地反应试剂的质量差异。     

单克隆抗体AU_(14-1)测定的抗原在人宫颈病变中的表达

本研究应用抗小鼠宫颈癌(U_(14))单克隆抗体(AU_(14-1))对人宫颈癌和癌前病变进行免疫组织化学分析,以观察AU_(14-1)测定的抗原在人宫颈病变中表达的发生率和意义。所用材料为福尔马林固定和石蜡包埋的活检标本。切片经过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)染色。结果发现,宫颈鳞状细胞癌的单克隆抗体免疫组织化学染色的阳性率为20/20,腺癌为13/13,原位癌为15/21,非典型增生为2/20,慢性炎为2/24。提示U_(14)抗原的表达可能与宫颈的恶性转化有关。     

抗人肝细胞肝癌单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备高特异性和高亲和力的抗人肝细胞肝癌(HCC)的单克隆抗体(MAb),为肝癌的靶向诊断及治疗提供依据.方法 用人肝细胞肝癌细胞株HepG-2经"尾静脉.脾脏联合方法"免疫BALB/c小鼠.取其脾脏细胞与同源小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14融合,经ABC免疫组化初筛抗体、有限稀释法亚克隆化、染色体分析、免疫组化鉴定抗体特异性、共聚焦显微镜扫描技术(LSCM)进行组织定位、ELISA分析鉴定抗体的亚型及荷人肝癌裸鼠牛物分布等进一步鉴定其生物学特性.结果 (1)获得一株分泌抗人肝细胞肝癌单克隆抗体的杂交瘤;该抗体与肝癌组织结合的特异性高达98.5%(67/68);(2)注射131I-MAb后瘤部位放射性分布有逐渐增加的趋势,血液、肝脏、肾脏和肺脏放射性有逐渐减低的趋势,72 h肿瘤/血液和肿瘤,肝脏比值分别为15.76±3.28和7.23±1.70.结论 成功制备抗人肝细胞肝癌的单克隆抗体,具有较好的肝癌特异性、靶向性,对原发性肝癌有潜在的诊断及治疗作用.     

Use of the Abbott Architect HIV antigen/antibody assay in a low incidence population

BackgroundWith the availability of 4th generation HIV diagnostic tests which are capable of detecting acute infection, Iowa evaluated the 3rd and 4th generation HIV test and compared the performance of these products in a low incidence population.ObjectiveThis study was conducted to evaluate the performance of an HIV antigen/antibody combination (4th generation) assay compared to an EIA 3rd generation assay.Study designOver a 4 month period, 2037 specimens submitted for HIV screening were tested by Bio-Rad GS HIV-1/HIV-2 Plus O EIA and the Abbott Architect i1000SR HIV Ag/Ab Combo. The performance characteristics of sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value were determined.ResultsOf the 2037 specimens tested, there were 13 (0.64%) true positives detected. None of the positive specimens were from patients in the acute phase of infection. The Abbott antigen/antibody combo assay had a sensitivity, specificity, positive-predictive value and negative predictive value of 100%, 99.85%, 81.25%, and 100% respectively. The Bio-Rad EIA assay had a sensitivity, specificity, positive-predictive value and negative predictive value of 100%, 99.80%, 76.47% and 100%, respectively. The EIA had four false positive results which tested negative by the antigen/antibody assay and western blot.ConclusionIn a low-incidence state where early infections are less commonly encountered, the EIA assay and the antigen/antibody assay performed with near equivalency. The antigen/antibody assay had one less false positive result. While no patients were detected in the acute stage of infection, the use of the antigen/antibody assay presents the opportunity to detect an infected patient sooner and prevent transmission to others.     

Colgalt2-酶联免疫试剂盒的制备

目的 利用N末端Colgalt2多克隆抗体和C末端Colgalt2多克隆抗体,制备Colgalt2双抗体夹心酶联免疫试剂盒.方法 体外扩增Colgalt2的N-末端编码序列,构建其原核表达质粒,诱导纯化Colgalt2重组蛋白.免疫大耳白兔获得抗Colgalt2 N-末端重组蛋白的多克隆抗体.以Colgalt2 N-末端重组蛋白为抗原,利用ELISA和Western Blot技术检测多克隆抗体效价和特异性.以Colgalt2 N-末端多克隆抗体包被酶标板,同时利用HRP标记的C末端Colgalt2抗体,制备Colgalt2-ElISA试剂盒.结果 我们成功克隆表达了N末端Colgalt2基因片段,制备了兔抗Colgalt2多克隆抗体,ELISA分析表明该抗体效价较高（＞1∶1 280000）,Western Blot分析显示该抗体有良好的特异性.对我们所制备的不同浓度的Colgalt2重组蛋白进行分析显示,所制备的分析试剂盒,在1.25～25 μg/ml范围内具有较好分析线性.线性相关系数约为0.98.结论 所制备的Colgalt2-ELISA分析试剂盒可以用于标本内Colgalt2蛋白检测.     

139例HIV感染者P24抗原，HIV DNA，HIV RNA相关研究

目的探讨ＨＩＶＤＮＡ，ＨＩＶＲＮＡ，Ｐ２４Ａｇ与宿主的相互关系及三者间的内在联系。方法收集１３９例抗ＨＩＶ阳性血标本，用固相免疫酶法测Ｐ２４Ａｇ，定量逆转录聚合酶链生物酶法测定ＨＩＶＲＮＡ和巢式聚合酶链法测ＨＩＶＤＮＡ。结果ＨＩＶＲＮＡ阳性数１０８／１３９，ＨＩＶＤＮＡ阳性数１０９／１３９，Ｐ２４Ａｇ阳性数为３４／１３９。进一步分析，同一标本ＨＩＶＤＮＡ，ＨＩＶＲＮＡ均阳性的占８０％，单一阳性为２０％。结论三种ＨＩＶ检测方法的敏感性、一致性与ＨＩＶ毒株变异、个体宿主免疫应答及抗病毒治疗密切相关。多引物多区域同时测ＨＩＶＤＮＡ，ＨＩＶＲＮＡ和抗原，并结合临床进行综合分析，对加强ＨＩＶ感染机理的理解和疗效考核有实际意义     

筛选HIV-1 P24蛋白适配子的一种简便的SELEX方法

目的 快速筛选HIV-1 P24抗原适配子,并验证其特异性与亲和力.方法 利用聚碳酯材料PCR板包被P24抗原,在PCR板中运用SELEX技术进行适配子筛选.对多条适配子序列进行了一级结构及二级结构软件分析.酶联免疫法(ELISA)对筛选到的适配子进行亲和力及特异性验证.结果 确定用聚碳酯材料可以包被P24抗原,ELISA法检测抗原包被浓度与吸光度(A值)正相关;电泳显示适配子得到富集筛选;测序后软件分析表明多条适配子有共有序列,空间结构多样;用ELISA法,结合辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(SA)与生物素标记的适配子,对适配子与P24的亲和力进行验证,表明筛选到的适配子与P24抗原有特异性的高亲和力结合.结论 建立了一种简便的筛选HIV-1 P24抗原适配子的方法,筛选到特异性的高亲和力P24适配子.     

我国戊型肝炎ELISA诊断试剂的质量比较

目的对戊型肝炎(戊肝)诊断试剂进行质量评价。方法选择北京万泰生物药业(万泰),北京现代高达生物技术(高达),上海科华生物工程(科华),GeneLabs Diagnostic Inc(GeneLabs),和河南华美生物工程(华美)共5家公司生产的检测戊肝病毒IgG(HEV-IgG)抗体的ELISA试剂,分别检测戊肝诊断试剂参比品、可疑戊肝临床患者和正常人群血清HEV抗体。结果对24份阳性和30份阴性参比品检测,以万泰试剂检测符合率最高,阳性和阴性符合率分别为95.83%(23/24)和96.67%(29/30),总符合率为96.30%,其次为高达试剂87.50%(21/24)和100%(30/30),总符合率为94.44%,华美试剂87.50%(21/24)和96.67%(29/30),总符合率92.59%,GeneLabs66.67%(16/24)和100%(30/30),总符合率为85.18%,科华试剂45.83%(11/24)和100%(30/30),总符合率为75.93%。对42份可疑戊肝患者血清HEV抗体检测阳性率,高达试剂为100%(42),万泰和华美试剂均为97.62%(41),GeneLabs和科华试剂均为90.48%(38)。对230份正常人群HEV抗体检测阳性率,从高到低依次为万泰试剂31.74%(73),华美试剂为23.91%(55),高达试剂为17.39%(40),GeneLabs和科华试剂分别是7.83%(18)和3.48%(8)。结论5家试剂检测急性期戊肝患者抗体阳性率均能达90%以上,具有很高的一致率,而应用于普通人群HEV感染的调查,其抗体阳性率从31.74%~3.48%不等。不同的试剂存在假阳性或和阳性漏检现象。依本室参比品和人群血清阳性率来看,万泰试剂检出率较高。