外源性TGF-β1诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肌成纤维细胞分化的实验研究

目的　探讨大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs(bone marrow mesenchymal stem cells)的分离、培养、扩增方法及外源性转化生长因子TGF-β1(Transforming growth factor-1)诱导BMSCs向肌成纤维细胞定向分化的可能性,为放射性诱导的颌骨纤维化提供体外理论依据。方法　取大鼠股骨的骨髓,全髓培养法分离培养骨髓间充干细胞;培养至第三代时分别用+/-TGF-β1的2组诱导培养基定向分化诱导;诱导2周后显微镜下观察细胞形态变化,Real-time PCR检测细胞的基因表达情况;细胞爬片行免疫组化鉴定α-SMA及胶原纤维的表达。结果　大鼠股骨骨髓组织中可分离出骨髓间充质干细胞,体外生长形态类似成纤维细胞,呈梭型、纺锤型,定向诱导后TGF-β1组细胞可表现出肌成纤维细胞的特性（α-SMA+）,同时伴有COLⅠ、COLⅢ、α-SMA基因的高表达。结论　从大鼠股骨骨髓组织中可分离出骨髓间充质干细胞,TGF-β1能定向诱导BMSCs向肌成纤维细胞方向分化,为放射诱导的颌骨纤维萎缩机制提供了体外理论依据。     

miR146a参与炎症条件下骨髓间充质干细胞成骨分化的降低及其机制研究

目的：阐明炎症对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及miR146a在此过程中的调控作用。方法：将骨髓间充质干细胞置于3种不同条件培养基下培养：①成骨分化诱导培养基、②成骨分化培养基联合BMP2、③成骨分化联合炎症刺激TNF（10 ng/mL）,观察其成骨分化情况。通过miRNA特异性的qRT-PCR观察miR146a在上述条件下变化情况,进而对细胞转染miR146a的拮抗体antago-miR146a观察炎症条件下骨髓间充质干细胞的成骨分化情况。结果：建立了稳定的骨髓间充质干细胞体外培养体系,在不同诱导条件下其能成骨、成脂、成软骨。BMP2能够促进MSC成骨分化,而模拟炎症刺激TNF则能抑制MSC的分化;分化条件下,miR146a表达下降;而TNF剂量依赖性能增强miR146a的表达;miR146a拮抗体则能逆转TNF引起的骨髓间充质干细胞成骨分化降低。结论：miR146a参与炎症条件下骨髓间充质干细胞成骨分化的抑制。     

体外三维培养下诱导人胚胎面突外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化

目的: 探讨人胚胎面突外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的过程.方法:采用体外细胞三维立体培养的方法在转化生长因子β1(TGFβ1)、牙本质非胶原蛋白(DNCP)的诱导下通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法探索外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的可能性及生长因子在其中所起的作用.结果:人胚胎面突外胚间充质干细胞在胶原中生长良好.培养4 d在TGFβ1+DNCP组中细胞出现核极化有很长的突起细胞平行排列.诱导的细胞有许多与成牙本质细胞相似的超微结构.抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应.碱性磷酸酶活性增强.细胞在矿化液中能形成矿化结节.RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSPP).结论:三维立体培养下人胚胎面突外胚间充质干细胞在TGFβ1及DNCP的作用下能分化为成牙本质样细胞.本结果将外胚间充质干细胞作为前体诱导分化出成牙本质样细胞为研究牙齿的发育及分化提供了良好的模型和实验依据.     

经典Wnt通路调节骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞的分化

目的:探讨经典Wnt通路在骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞分化中的作用,以期为临床治疗牙髓损伤提供新策略。方法:用牙胚细胞条件培养液诱导骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞的分化,培养液内分别加入外源性Wnt激活剂Wnt3a/抑制剂DKK-1,检测经典Wnt通路中β-catenin、LEF1、TCF4及成牙本质样细胞特异表达物DSPP、DMP-1变化。结果:骨髓间充质干细胞经Wnt激活剂/抑制剂处理后,胞浆内β-catenin水平明显上升/下降,其下游核内转录因子LEF1、TCF4基因水平明显上升/下降,而细胞内DSPP、DMP-1的表达明显降低/升高。结论:Wnt信号通路抑制骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞分化。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及向软骨细胞定向分化的实验研究

目的：探讨人骨髓间充质干细胞体外分离培养和向软骨细胞定向分化的条件，为髁突软骨组织工程提供种子细胞。方法：采用Percoll分离液，根据细胞密度梯度原理，从健康人骨髓组织中分离骨髓间充质干细胞，对所获得的细胞进行体外培养和表面标志的流式细胞仪分析。对经过鉴定证实的骨髓间充质干细胞用含胰岛素、转铁蛋白、丙酮酸、地塞米松和TGF－β的诱导培养基处理7－14d。对诱导细胞进行蕃红花O－亮绿染色和Ⅱ型胶原染色，鉴定诱导后细胞的软骨细胞表型，结果：培养的人骨髓间充质干细胞均一表达CD29、CD44，而CD34、CD45和HLA－DR呈阴性。细胞经过诱导液作用14d后，蕃红花O－亮绿染色和Ⅱ型胶原染色阳性。结论：采用比重为1073g/L的Percoll能分离获得高纯度的人骨髓间充质干细胞（纯度大于95％）。该细胞经诱导液作用，可定向分化为软骨细胞。     

体外三维培养下诱导人胚胎面突外胚问充质干细胞向成牙本质样细胞分化

目的：探讨人胚胎面突外胚间允质干细胞向成牙本质样细胞分化的过程。方法：采用体外细胞三维立体培养的方法，在转化生长因子B1(TGFβ1)、牙本质非胶原蛋白(DNCP)的诱导下，通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法，探索外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的可能性及生长因子在其中所起的作用。结果：人胚胎面突外胚间充质干细胞在胶原中生长良好。培养4d，在TGFβ1 DNCP组中细胞出现核极化，有很长的突起，细胞平行排列。诱导的细胞有许多与成牙本质细胞相似的超微结构。抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应。碱性磷酸酶活性增强。细胞在矿化液中能形成矿化结节。RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSFP)。结论：三维立体培养下，人胚胎面突外胚间充质干细胞在TGFB1及DNCP的作用下能分化为成牙本质样细胞。本结果将外胚间充质干细胞作为前体，诱导分化出成牙本质样细胞，为研究牙齿的发育及分化提供了良好的模型和实验依据。     

间接共培养诱导大鼠骨髓间充质干细胞向牙周膜成纤维样细胞分化

目的：探讨通过间接共培养诱导骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）向牙周膜成纤维细胞（Periodontal ligament fibroblasts,PDLFs）分化的可行性。方法：将大鼠BMSCs与PDLFs间接共培养,分别于不同时间段检测碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性以及骨钙素（Osteocalcin,OCN）、Ⅲ型胶原（Collagen typeIII,COLⅢ）mRNA表达的变化。结果：间接共培养后的BMSCs表现出类似PDLFs的性质,各检测指标与单独培养的PDLFs无统计学差异,与单独培养的BMSCs有统计学差异。结论：牙周膜成纤维细胞通过旁分泌机制可以诱导骨髓间充质干细胞向其分化。     

BMP-2对大鼠骨髓间充质干细胞成骨作用的影响

目的:携带骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)基因的慢病毒载体感染大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)后,观察BMP-2对BMSCs成骨作用的影响。方法:原代培养大鼠BMSCs并进行传代及鉴定,用携带BMP-2的慢病毒感染第3代BMSCs后,进行骨向诱导,通过茜素红染色观察钙沉积。观察细胞黏附能力及对成骨标志分子骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)、胶原蛋白Ⅰ(Col-Ⅰ)及smad(drosophila mothersagainst decapentaplegic protein)表达的影响。采用SPSS11.0软件包对数据进行统计学分析。结果:①原代培养出大鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定;②携带BMP-2和EGFP的慢病毒感染第3代BMSCs后,免疫荧光检测和RT-PCR及WB检测感染成功;③大鼠骨髓间充质干细胞感染慢病毒后进行骨向诱导,钙沉积明显增加;④BMSCs细胞黏附能力增强;⑤OPN、OCN、Col-Ⅰ及smad表达增加。结论:BMP-2通路增强了细胞黏附及相关成骨分化因子的表达,可明显促进大鼠...     

富血小板血浆对骨髓间充质干细胞成骨向分化的作用

目的:观察不同浓度改良富血小板血浆(PRP)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨向分化的作用效果。方法:使用健康志愿者骨髓培养的3~4代BMSCs。将由该志愿者静脉采集的静脉血制备成改良PRP作用于BMSCs,使用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒测定矿化诱导7 d后BMSCs的ALP活性,通过茜素红染色观察矿化诱导21 d后BMSCs的矿化结节形成情况,并通过实时荧光定量PCR检测矿化诱导7 d后BMSCs中成骨相关基因Runx2表达的变化。结果:5%改良PRP明显提高了BMSCs的ALP活性,促进了其矿化结节的形成,并上调了BMSCs中Runx2基因的表达。结论:液氮冻融激活的改良PRP促进BMSCs成骨向分化具有浓度特异性。     

糖基化终末产物对小鼠骨髓间充质干细胞增殖及相关基因P27、cyclinD1 的影响

目的:探讨糖基化终末产物(AGEs)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖能力以及相关基因P27、cyclinD1的影响。方法:全骨髓法培养小鼠骨髓间充质干细胞;成骨、成脂诱导骨髓间充质细胞,对其进行干细胞鉴定;将培养出的骨髓间充质干细胞与不同浓度的AGEs 共培养,MTT检测不同浓度下骨髓间充质干细胞增殖的改变;实时定量聚合酶链反应(Real time PCR)检测AGEs刺激后P27、cyclin D1表达的改变。结果:小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后茜素红染色出现钙化结节;成脂诱导21 d后油红O染色出现脂滴;MTT显示不同浓度的AGEs(10、50、100、200 mg/L)均能抑制BMSCs的增殖差异有统计学意义(P<0.05),且随着浓度的增加抑制越明显;Real time PCR结果显示:AGEs(50 mg/L)刺激3 d后P27 mRNA的表达水平较对照组升高,cyclinD1 mRNA的表达水平较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:AGEs能抑制小鼠骨髓间充质干细胞的增殖并能改变P27 、cyclinD1 mRNA的表达。     

骨髓间充质干细胞向成纤维细胞分化的研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)由于能向骨、软骨、脂肪等多个细胞系分化并且分离方便,所以在组织工程及再生医学中有广泛的应用.在特定的微环境刺激下,BMSCs可以向多种细胞系分化,但是其向成纤维细胞分化的研究较少.BMSCs源性成纤维细胞与肿瘤、纤维化等疾病的发生有密切关系.该文就BMSCs的分离、分化条件及相关疾病作一综...     

牙胚细胞与骨形态发生蛋白4转染的骨髓间充质干细胞相互诱导的体外实验研究

目的:探讨牙胚细胞和骨形态发生蛋白4(BMP4)转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)相互间的成牙诱导作用。方法:构建骨形态发生蛋白4慢病毒载体,转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,并将骨髓间充质干细胞和BMP4转染的骨髓间充质干细胞分别与SD大鼠牙胚细胞按1∶1比例混合培养,同时将细胞分为5组,BMSCs组、BMP4/ BMSCs组、牙胚细胞组、BMSCs/牙胚细胞组(混合组1)、BMP4/ BMSCs/牙胚细胞组(混合组2),分别采用实时荧光定量PCR和western-blotting检测五组细胞Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1成牙相关基因mRNA水平和蛋白水平相对表达量的变化。结果:与混合组1相比,混合组2Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1 mRNA水平和蛋白水平表达量增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:牙胚细胞与BMP4转染的骨髓间充质干细胞共培养,促进了成牙相关基因的表达,可作为组织工程牙的备选种子细胞。     

多种生长因子对胚胎面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的诱导作用

目的: 探讨转化生长因子β1(TGFβ1)、牙本质非胶原蛋白(DNCP)、TGFβ1 DNCP、肝素 胰岛素样生长因子1(IGF-1)在诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用.方法:取妊娠12.5 d SD大鼠胎鼠颌突外胚间充质细胞(第4代),在转化生长因子β1(TGFβ1)(2 ng/mL)、牙本质非胶原蛋白(DNCP)(100 μg/mL)、TGFβ1(2 ng/mL) DNCP(100 μ/mL)、肝素(1 μg/mL) IGF-1(100 ng/mL)的诱导下,通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法,探索生长因子在外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用.结果:6 d后,在DNCP、TGFβ1 DNCP作用下,胎鼠面突外胚间充质细胞出现明显的形态改变,细胞由成纤维样变为梭形,部分核极化,有很长的突起,部分细胞呈现平行排列趋势.TGFβ1组部分细胞出现极化改变.DNCP、TGFg 1 DNCP诱导组抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应,RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSPP),另外DMP1亦呈阳性表达.TGFβ1组不表达DSPP、DMP1.肝素 IGF-1组在细胞形态和蛋白、mRNA上均未出现成牙本质细胞特异的表达.结论:胎鼠面突外胚问充质细胞在DNCP和TGFβ1 DNCP的作用下能分化为成牙本质样细胞.表明在诱导中起关键作用的是DNCP.TGFβ1可诱导细胞在形态学上分化成类成牙本质细胞.本结果与该细胞在三维体系中的诱导分化结果相似,表明胚胎面突外胚间充质细胞在体外被诱导分化为成牙本质样细胞不是偶然现象,这为研究牙齿的分化和发育提供了良好的模型和实验依据.     

大鼠骨髓间充质干细胞与脂肪间充质干细胞生物学特性的比较

目的:本研究旨在比较同一个体来源的脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)和骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长特点和诱导分化能力。方法:取7～10 d SD大鼠的脂肪和骨髓,体外分离、纯化脂肪和骨髓来源间充质干细胞,分别从细胞形态、生长动力学、表面标志、分化潜能等方面进行鉴定和比较。结果:脂肪间充质干细胞的增殖速度明显大于骨髓间充质干细胞(P<0.05),两种细胞所表达的表面蛋白标志物基本相似,但脂肪间充质干细胞表面蛋白标志CD106呈阴性,而骨髓间充质干细胞CD106呈阳性。在成软骨分化中脂肪间充质干细胞弱表达Ⅱ型胶原,而骨髓间充质干细胞不表达。第5、10、15、20代ADSCs及BMSCs经成骨诱导后茜素红染色均呈阳性且有"矿化"结节形成,碱性磷酸酶活性以第5代最强,随着细胞代次的递增,碱性磷酸酶活性呈递减趋势。结论:ADSCs较BMSCs更易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨、成脂、成软骨能力较强,适合作为再生医学的种子细胞。     

TGF-β、rhBMP-2体外诱导下颌突外胚间充质细胞向平滑肌细胞分化

目的：探讨TGFβ、rhBMP-2体外诱导下颌突外胚间充质细胞向平滑肌细胞分化的能力。方法：取妊娠12．5d胎鼠第三代下颌突外胚间充质细胞，分别在含60、100mmol/L的TGF－β和1．6、3.2mmol/L的rhBMP-2的DMEM／F12中培养，相差显微镜下观察细胞的形态变化，免疫组化鉴定细胞性质。结果：培养2d,60pmol/L的TGF－β组细胞形态发生明显变化，细胞变得大而扁平，培养4d，免疫组化鉴定约70％的细胞分化为平滑肌细胞，rhBMP-2组细胞形态未见明显改变，1.6nmol/L组免疫组化鉴定约5％的细胞分化为平滑肌细胞，未能诱导分化出神经元细胞。未加LIF的对照组细胞出现向平滑肌细胞的自然分化。结论：TGFβ、rhBMP-2可诱导外胚间充质细胞向平滑肌细胞分化。     

内皮祖细胞对骨髓间充质干细胞－种植体复合物成骨能力的影响

目的：研究内皮祖细胞（EPCs）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）膜片－种植体复合体成骨能力的影响。方法：分离培养大鼠 BMSCs 并采用细胞膜片技术培养细胞膜片;分离培养大鼠骨髓来源 EPCs;将 EPCs 加载于 BMSCs 细胞膜片上并检测相关基因;制作细胞膜片－种植体复合体并植入裸鼠皮下,8周取材,行 Micro-CT 检查及组织学检测。结果：体外实验显示EPCs 加载于 BMSCs 细胞膜片后成骨相关 Runx-2、ALP、BMP2和成血管相关 VEGF 的基因表达提高;裸鼠体内实验取材 Mi-cro-CT 检查显示加载 EPCs 组成骨量较高,HE 切片显示加载 EPCs 组成骨面积较多,免疫组化检测显示加载 EPCs 组 Runx2、BMP2表达较高。结论：加载 EPCs 能提高 BMSCs-种植体复合物的成骨能力。     

稀土元素铈对骨髓间充质干细胞成骨分化调控的体外实验研究

目的:研究铈离子对体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化能力的影响。方法:分离培养小型猪骨髓间充质干细胞,分别用含有1×10-5mol/L CeCl3的成骨诱导液和单纯成骨诱导液进行培养;然后用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测两组细胞诱导培养1、7、14、21 d的ALP活性;用实时荧光定量PCR分析两组细胞诱导培养14 d时的成骨相关基因Runx2、BSP、OCN mRNA的表达水平。结果:诱导培养1、7、14、21 d后,CeCl3组各时间点的ALP活性均较对照组显著增加(P<0.05);诱导14 d后,CeCl3组的各成骨相关基因Runx2、BSP、OCN mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。结论:CeCl3能促进BMSCs的成骨分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养与鉴定

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的体外培养方法及其生物学特性。方法:体外分离、培养大鼠BMSCs,进行细胞形态学观察、生长曲线测定、细胞表面标记物检测;并采用体外诱导分化方法对BMSCs多向分化潜能进行鉴定。结果:大鼠BMSCs传代后细胞生长状态相对稳定,呈梭形;流式细胞仪鉴定CD90阳性率为88.2%,CD29阳性率为98%,CD34阴性率为2.8%,CD45阴性率为2.7%。成骨诱导21 d后,茜素红染色后可在显微镜下观察到矿化结节形成。成脂诱导14 d,油红O染色后显微镜下可见红色脂滴形成。结论:BMSCs在体外培养中贴壁生长,增殖较快;表达骨髓组织来源干细胞的表面标记物CD29、CD90;诱导后能向成骨细胞、脂肪细胞分化。     

miR-335对牙囊干细胞成骨分化能力的影响

目的 体外研究大鼠牙囊干细胞成骨分化能力,以及miR 335对牙囊干细胞成骨分化能力的影响。 方法 双向差速法体外分离培养大鼠牙囊干细胞,进行成骨诱导。用茜素红染色检测成骨分化的能力,进而用qRT-PCR检测miR-335的表达,并且在瞬时转染miR-335 mimics和inhibitor后成骨诱导,用PCR和Western Blot的方法检测成骨能力的改变。 结果 双向差速法培养的牙囊干细胞具有成骨样细胞分化能力。成骨诱导的牙囊干细胞中miR-335表达降低,转染mimics后成骨能力降低,转染inhibitor后成骨能力升高。 结论 在体外条件miR-335可以抑制牙囊干细胞成骨分化。     

TGF-β1基因修饰BMSCs对Ⅰ型胶原表达的影响

目的：通过对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）转染人TGF-β1基因,观察该基因对BMSCs表达Ⅰ型胶原的影响。方法：采用脂质体介导法转染人TGF-β1基因至BMSCs,采用定量RT—PCR,免疫荧光分析等方法分析转基因后,BMSC表达Ⅰ型胶原的变化。结果：重组质粒pCDNA3．1（＋）-TGF-β1成功转染至大鼠BMSCs,细胞免疫荧光和定量RT—PCR均证实了TGF-β1表达的增强。结论：转TGF-B1基因可以促使BMSCs合成Ⅰ型胶原。