实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌方法的建立及评价 

目的：建立利用实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌浓度的方法,为检测人肠道内菌群浓度提供有效手段。方法：提取60例儿童粪便样本中细菌总DNA。选择细
菌种属的特异性基因16SrRNA作为扩增区,依据双歧杆菌的16SrRNA序列共设计3条引物,以常规PCR扩增出的16SrRNA部分基因片段制作标准品,应用SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料,对连续稀释的标准品及待测样本进行分析,建立绝对定量的标准曲线,同时计算出待测样本双歧杆菌浓度;根据可检测到的标准品最低拷贝数计算反应灵敏度;分析PCR产物熔解曲线评价反应特异性;重复检测梯度稀释的标准品,用相同浓度标准品的Ct值变异系数（CV）评价反应稳定性。结果：常规PCR扩增出双歧杆菌16SrRNA部分基因片段长度约为613 bp,测序结果正确,成功构建了双歧杆菌实时荧光定量PCR反应中的标准品;生成的标准曲线R2=0.999,最低检测限度为每个反应1.48×102个拷贝;实时荧光定量PCR产物的熔解曲线为单峰。对待测样本分批进行荧光定量PCR检测,各组间每微升1.48×103~1.48×107个拷贝浓度标准品Ct值的变异系数为2.94%、3.39%、3.54%、3.08%和3.34%。60份儿童粪便样本双歧杆菌浓度对数值为7.77±0.86（拷贝数?g-1湿便）。结论：本研究所建立的实时荧光定量PCR法敏感性高、特异性强,且重复性好,适用于检测人粪便中双歧杆菌的浓度。     

一步法实时荧光定量PCR检测白血病WT1基因mRNA

目的 构建RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因mRNA表达的方法,准确定量检测白血病患者微小残留病,指导临床判断预后和早期预测复发.方法 从K562细胞提取的RNA用特异性引物扩增WT1基因,pMD18-T载体克隆法构建荧光定量PCR标准模板,建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测wTl基因方法,并对该方法的灵敏度、重复性和稳定性进行检测.结果 构建的RT-PCR一步法实时荧光定量PCR方法的灵敏度达10-4水平:以拷贝数为1.0x106～1.0×102 cps/ml的标准品,分别进行RT-PCR一步法实时荧光定量PCR扩增后,标准品的Ct值与该标准品模板起始浓度的对数存在线性关系,r值达0.998:管间和批间的变异系数均小于8%.结论 所建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因方法的灵敏度、重复性和特异性好;RT和PCR反应过程一步完成,更简便快捷,减少加样和污染机会,更适合临床检测.     

小鼠诺如病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)实时荧光定量PCR检测方法,为建立MNV规范化检测方法提供依据。方法根据NCBI公布的60个MNV病毒株核酸序列设计特异性引物,构建标准阳性质控品,建立MNV实时荧光定量PCR方法,并进行特异性、灵敏度、重复性及稳定性评价。用该方法对766只送检小鼠的盲肠内容物样品进行检测,初步了解北京地区实验小鼠MNV感染状况。结果成功建立MNV实时荧光定量PCR检测方法,该方法特异性好,与同种属人类诺如病毒(Hu No Vs)、猫杯状病毒(FCV)均无交叉反应,检测灵敏度可达101copies/μL。批内及批间CT值变异系数均小于2%。应用该方法在766份小鼠盲肠内容物样品中检出301份MNV核酸阳性样品,阳性率39.3%。结论建立的MNV实时荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度高,重复性好,可以用于MNV的快速定量检测。     

α变形菌纲磁螺菌属TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立一种快速有效检测环境中α变形菌纲磁螺菌属细菌的方法。方法本研究以α变形菌纲磁螺菌属保守且特异的16SrRNA片段为靶序列,化学合成基因序列,制备重组质粒作为磁螺菌属检测的标准品;用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术,针对目的片段基因设计特异性引物和TaqMan荧光探针,进行实时荧光定量PCR检测,运用统计学方法评价该方法的特异性、敏感性及重复性。结果本实验成功构建了质粒PUC19-QC,引物、探针特异性良好,标准曲线在5.10×101~5.10×107拷贝数之间具有较好的线性关系,相关系数R2=0.999。该法最低可检测到5.10×10个DNA拷贝数,灵敏度明显高于普通PCR;重复性试验表明,荧光定量PCR检测结果 Ct值波动范围较小,Ct值的标准差均小于0.23,表明该法重复性好,可靠性高。析因方差分析表明不同稀释度之间的Ct值差异有统计学意义(F=3 125.305,P0.001),三个批次的再现性良好,差异无统计学意义(F=0.057,P=0.945),而浓度分组与时间之间也无交叉效应(F=0.533,P=0.873)。结论本实验所建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术,能够快速有效地检测α变形菌纲磁螺菌属细菌,且检测结果稳定,受外界条件如时间、气温等影响小。     

树鼩腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的通过建立树鼩腺病毒(tree shrew adenovirus,TAV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测树鼩腺病毒。方法根据TAV全基因组3’端保守序列设计合成特异性引物;用含目的基因片段的重组质粒作为标准品进行标准曲线绘制,建立TAV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的TAV实时荧光定量PCR检测方法特异性好,与树鼩源及其他物种常见病毒无交叉反应;方法的最低检测限度为每微升3.7拷贝,灵敏性强;相关检测系数R2为0.998,扩增效率为95.7%;扩增结果具有良好的线性关系,且重复性检测效果好。结论成功建立了TAV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,灵敏度高,重复性好,可用于TAV感染的早期快速检测。     

猴免疫缺陷病毒(SIV)实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒(SIV)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法 RT-PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796 bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD-SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIV QPCR检测方法,质粒DNA模板在107～102拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3.26,相关系数为0.999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV%均小于1%。结论建立的SIV QPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)核酸拷贝量。     

双重实时荧光PCR检测肠出血型大肠埃希菌stx1和stx2基因方法的建立

目的建立一种检测肠出血型大肠埃希菌(EHEC)产毒基因stx1和stx2的TaqMan双重实时荧光PCR法。方法根据GenBank公布的EHECstx1和stx2基因序列进行比对后设计相应的PCR引物和TaqMan探针,探针报告基团分别使用FAM和HEX标记,淬灭基团使用BHQ1标记。建立双重实时荧光PCR反应体系并对反应条件进行优化,对方法的灵敏度、特异性及其重复性进行分析。结果建立了EHEC双重实时荧光PCR检测方法。菌液浓度为102～108cuf/ml时,均可观察到扩增曲线,且扩增曲线平滑;检测30份模拟临床样品,均检测到stx1和stx2基因,且均培养出EHEC,该方法灵敏度为100%;3次重复测定108、105、102cfu/ml3个高、中、低浓度的菌液DNA模板,得到其扩增曲线,计算各浓度的Ct值标准差及变异系数,均小于5%,在误差允许范围内。结论建立的双重实时荧光PCR法可快速、灵敏、特异、有效地检出EHEC。     

荧光实时定量PCR检测前列腺癌抗原3评分方法的建立

目的 前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3,PCA3)基因表达具有前列腺癌特异性,文中建立荧光实时定量PCR(FQ-RT-PCR)检测PCA3评分的方法.方法 分别以LNCap和PC-3细胞株为阳性和阴性对照,用TaqMan探针建立检测PCA3和前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA) mRNA的荧光实时定量PCR方法,评价特异性、重复性和计算扩增效率,建立PCA3评分计算公式.结果 检测PCA3和PSA mRNA的批内变异系数分别为1.19%、1.09%、0.84%和0.06%、0.71%、0.79%,批间变异系数分别为1.03%和0.56%;扩增效率分别为0.98和1.00;以2-ΔCt表示PCA3评分.结论 荧光实时定量PCR检测PCA3评分方法的特异性好,重复性高.     

单纯疱疹病毒2型ICP4基因荧光实时定量PCR检测方法的建立

目的 建立实时荧光PCR定量检测单纯疱疹病毒2型(HSV2)ICP4基因的方法.方法 依据HSV2 ICP4基因序列设计引物.PCR纯化后克隆到pMD-18T载体上进行测序,抽提重组质粒作为标准品.根据测序结果设计荧光定最PCR的引物和探针,质粒标准品10倍稀释后进行扩增,建立标准曲线,并进行灵敏度和可靠性分析.结果 测序结果显示在扩增的PCR片段中有在A-G无和T-C的无义突变.标准品101以下没有检测信号,101具有明确的检测信号,因而检测的灵敏度为10.可靠性测定结果:107-101进行10次重复Ct值的平均值分别为14.275±0.137、17.988±0.162、22.081±0.259、25.957±0.345、29.565±0.203、33.269±0.287、37.737±0.698,变异系数分别为0.965%、0.902%、1.174%、1.329%、0.686%、0.862%、1.851%.Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系.回归系数为0.998.结论 成功建立了HSV2 ICP4基因实时定量荧光PCR检测的方法,灵敏度高,重复性好,可用于HSV2 ICP4基因的定量分析.     

多重荧光定量PCR检测婴幼儿腹泻病毒感染及其临床应用

目的:建立一种能同时检测婴幼儿腹泻粪便中常见病毒的多重荧光定量 PCR技术。方法:根据GenBank上几种病毒基因组保守序列设计引物序列,建立多重荧光定量PCR方法,对所建立的多重荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性及重复性进行验证;并以所建立的方法对150例婴幼儿病毒性腹泻患者粪便标本进行检测。结果:所建立的多重荧光定量PCR检测方法具有很好的特异性,灵敏性检测可达102拷贝/mL,检测不同病毒核酸浓度各自的检测 Ct 值标准差均较小,变异系数均低于1.0%,具有较好的重复性;检测150 份粪便标本,多重荧光定量 PCR 的检出率为36%,胶体金方法检出率为38.67%,两者比较差别无统计学意义（χ2= 6.91,P > 0.05）。多重荧光定量 PCR方法中轮状病毒、腺病毒、诺如病毒、星状病毒的检出率分别为12.67%、6.00%、13.33%和4.00%,测序结果与已知病毒株基因都具有高度同源性。结论:所建立的多重荧光定量PCR方法快速、特异、灵敏,可以作为临床病原诊断的一个重要工具且适用于流行病学调查研究。     

TaqMan 探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用

目的： 在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体。方法：选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288 bp。回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒。构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较。结果：支原体PCR产物大小约为288 bp,质粒质量浓度为13.9 mg/L,A260/Ａ280 (Ratio)为1
.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝/ μL。10 μmol/L的引物浓度和10 μmol/L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件。检测灵敏度为4.250×101 拷贝。拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式：Ct= －2.916×log拷贝数+40.02。特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好。准确性检测中变异系数小,表明稳定性好。组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好。样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法。结论：支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好。     

辣椒中常见产毒性真菌的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR检测方法

目的将多重实时荧光定量PCR技术与裸磁珠富集技术联用,建立辣椒样品中常见3类（曲霉属、青霉属、镰刀菌属）产毒
性真菌的快速定量检测方法。方法根据真菌核糖体RNA（rDNA）基因序列选择真菌广谱引物及属特异性探针,联用裸磁珠富
集技术,建立多重实时荧光定量PCR体系,并评价所建方法的灵敏度、特异性、重复性和一致性。结果裸磁珠-多重实时荧光定
量PCR方法灵敏度高,与本研究优化后的普通实时荧光定量PCR相比提高了10倍,是原报道的100倍,直接检测辣椒样品中3
类产毒性真菌的检出限均可达103 CFU/ml,即104 CFU/g,且特异性良好（与非目标菌无交叉反应）、重复性良好（CV<1.5%）,该
方法模拟检测辣椒样品中3 类产毒性真菌的计数结果与标准培养法的计数结果相比均无统计学差异（P>0.05）,实验过程仅
需7 h（标准培养鉴定法耗时7~14 d）。结论构建的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR方法能大大缩短产毒性真菌的检测时间,并
成功应用于模拟辣椒样品中常见3类产毒性真菌的定量检测,值得进一步研究和推广。
     

阿尼昂尼昂病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的 建立阿尼昂尼昂病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法.方法 针对阿尼昂尼昂病毒nsP1基因设计特异性引物和探针,以珠海国际旅行卫生保健中心之前构建的MS2病毒样颗粒为标准品,采用一步法建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的检测下限、特异性、精密度、抗干扰能力、符合率进行评价.结果 建立的阿尼昂尼昂病毒实...     

应用MGB探针检测人丙型肝炎病毒的基因型

目的检测血浆或血清样本中人丙型肝炎病毒（HCV）的基因型,建立了基于MGB探针的实时荧光定量PCR检测体系。方法在HCV基因组型特异性碱基的聚集区域设计荧光定量PCR引物及探针,为保证特征特异性及高分辨率,选择设计MGB探针,然后将PCR扩增的产物先进行基因克隆,而后制备病毒样颗粒做为阳性质控品,从而建立完整的MGB探针法的荧光定量PCR检测体系,最后对该检测体系进行方法学评价。结果成功建立了基于MGB探针的HCV荧光定量PCR的基因分型检测体系。方法学评价显示,该检测体系的灵敏度达100IU/mL;重复性好;特异性良好,以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性。结论本研究建立基于MGB探针的HCV荧光定量PCR的基因分型检测方法,可定性检测血浆或血清样本及血液制品中的人丙型肝炎病毒HCV的基因型及含量,对于该疾病的研究及临床治疗都具有重要的意义。     

实时荧光定量TaqMan-PCR检测小鼠多瘤病毒方法的建立

目的 建立一种快速、特异、敏感的小鼠多瘤病毒 (murine polyomavirus, MPyV)荧光定量 TaqMan PCR检测方法, 用于MPyV核酸的检测。 方法 根据GenBank中小鼠多瘤病毒基因组序列设计了一对特异性引物及TaqMan探针, 扩增长度为69 bp的片段, 通过优化反应体系和反应条件, 对构建的重组质粒标准品进行检测, 并绘制标准曲线, 进行特异性、敏感性和重复性试验。最后用建立的方法对人工感染MPyV的肺脏、脾脏和粪便, 及86 份小鼠临床样本进行检测, 验证在临床应用中的效果。 结果 所建立的检测方法特异性强, 只能在小鼠多瘤病毒DNA中检出荧光信号, 检测灵敏度达到100拷贝, 批内和批间重复性好, 检测结果变异系数(CV)均小于1.13%, 人工感染MPyV小鼠的肺脏、脾脏和粪便均为阳性, 对86份临床样本进行检测, 有3份样本呈阳性(阳性率为3.5%)。 结论 建立的MPyV荧光定量TaqMan-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好, 适合用于MPyV临床诊断、日常监测和流行病学调查。     

胆汁螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立快速、敏感、特异的胆汁螺杆菌(Helicobacter bilis,H.bilis)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对胆汁螺杆菌进行定量检测。方法 PCR扩增H.bilis保守基因P17序列全长ORF435 bp,进行TA克隆,构建质粒标准品pMD-HBP17。通过对pMD-HBP17标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性及重复性;用所建立的qPCR方法检测77份临床样品,并与普通PCR的检测结果作比对。结果 所建立的qPCR检测方法,质粒DNA浓度在10⁸~10¹拷贝之间表现出较好的线性和相关性,所得标准曲线的斜率为-3.46,相关系数为0.999,检测灵敏度达到20个拷贝,对77份临床样品的检出率为14.3%,较普通PCR(7.8%)的检出率高。结论 建立的H.bilis qPCR检测方法特异性好、敏感性高、稳定性强,可用于胆汁螺杆菌的定量及定性检测。     

CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

目的建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法。方法针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。对2008～2012年期间采集的1 344份临床标本中的CAR菌进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照。结果 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌间无交叉反应,检测灵敏度达2.7拷贝。标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.22,TaqMan MGB探针荧光定量PCR效率为104.432%。对1 344份标本进行检测,结果 TaqMan MGB探针荧光定量PCR检出510份CAR菌阳性样本。TaqMan MGB探针荧光定量PCR能够直接从标本中检出CAR菌DNA,检测时间仅为40 min。结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于CAR菌的快速检测。