人慢性粒细胞白血病融合蛋白BCR-ABL适配子筛选及结构分析

目的:筛选、鉴定人慢性粒细胞白血病融合蛋白BCR-ABL适配子。方法:利用SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential)技术,以高纯度融合蛋白BCR-ABL为靶分子,从体外化学合成的长度为90 bp的随机单链DNA文库中来筛选与融合蛋白BCR-ABL特异性结合的寡核苷酸适配子,并进行解离常数(Kd)值测定和适配子序列测定,再分别用Clustal W软件包和DNA Folding Sever分析适配子一级结构及二级结构,以酶联仪测定OD450值,根据OD值高低判定适配子亲和力大小。结果:经过13轮筛选,随机ss DNA文库与融合蛋白的亲和率从0.3%上升到47.1%,所有的一级结构没有共同的同源序列,二级结构分析结果显示,茎和环等二级结构可能是适配子和融合蛋白BCR-ABL结合的基础,其中,寡核苷酸适配子A2与BCR-ABL亲和力最高,kd值达72 nmol/L。结论:利用随机寡核苷酸文库筛选技术成功获得抗融合蛋白适配子,为临床上治疗和预防慢性粒细胞白血病提供一定的参考。     

DC-SIGN特异性适配子的筛选及鉴定

目的:筛选高特异性、高亲合力结合DC-SIGN的单链DNA适配子,为开发抗HIV、HCV和结核杆菌感染的新型预防和治疗试剂奠定基础。方法:采用基于细胞表面展示的SELEX技术(TECS-SELEX),筛选出具有高亲合力结合DC-SIGN的单链DNA(ssDNA)适配子;运用流式细胞术(FCM)检测该适配子的亲合力;对最高亲合力适配子库进行克隆和测序;ELISA和FCM方法检测单适配子ZD8与DC-SIGN蛋白结合的剂量相关性;MTT法测定IC50观察适配子对细胞的毒性。结果:第14轮筛选的适配子库亲和力最高;DC-SIGN抗体能抑制适配子结合表达DC-SIGN蛋白的细胞;第14轮库中筛选的单适配子ZD8与DC-SIGN蛋白的结合率呈剂量依赖性;所筛选的单适配子对肝细胞几乎无毒性。结论:成功筛选出DC-SIGN蛋白的ssDNA适配子,为防治HIV、HCV和结核杆菌感染等DC-SIGN相关性疾病,提供新型预防和治疗的候选试剂和小分子药物。     

核酸适配子及其筛选进展

随着对单链DNA/RNA的不断研究,人们发现这些单链的寡核苷酸序列具有特殊的三维结构,能高亲和力和高特异性地结合各类靶标。根据单链DNA/RNA的这一性质,人们应用指数富集配体的系统进化技术在体外进行数轮筛选和扩增到特异性高、亲和性强的寡核苷酸序列,即核酸适配子,也称为适配子。基于适配子的化学结构和特点,稳定性的不断提高和筛选的方法不断改进,适配子被广泛运用于早期临床诊断和治疗等生物医学研究领域,并不断取得进展。本文就适配子技术及其筛选进展作一综述。     

核酸适配子及其治疗应用

核酸适配子(aptamer)是从大容量的组合化学库中筛选出的短的寡核苷酸。与抗体类似,它与靶分子结合具有高特异性和高亲和力。大多数核酸适配子与靶分子结合后对靶分子有抑制作用。适配子可广泛用于抗凝血、抗病毒、抗增殖、抗炎等方面。特异针对人VEGF165的核酸适配子已在美国被批准上市。     

特异性结合幽门螺杆菌黏附蛋白A(HpaA)核酸适配子的筛选及鉴定

目的通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选特异性结合幽门螺杆菌(H.pylori)黏附蛋白A(HpaA)的核酸适配子,并鉴定其结合特性。方法构建pET28a/HpaA原核表达质粒并诱导表达纯化重组HpaA蛋白;以重组HpaA蛋白为靶标利用SELEX技术筛选出能够与HpaA具有高特异性、高亲和力结合的核酸适配子。随后利用筛选所得HpaA适配子通过体外实验验证与H.pylori菌体的结合以及对临床胃黏膜切片中H.pylori的检测效能。结果本研究培养并提取ATCC26695菌株基因组,通过PCR扩增HpaA部分基因长度约699 bp,并成功克隆构建了原核表达质粒pET28a/HpaA。经异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达、纯化获得纯度约98%的重组HpaA蛋白作为筛选靶标。利用SELEX技术通过10轮正向筛选和5轮的负向筛选,获得6条与HpaA高亲和力的适配子分别命名为HA1～HA6。其中适配子HA6具有较高的亲和力和特异性,且适配子HA6核心序列在体外仍表现出与H.pylori菌体较高的结合力;利用羟基荧光素(FAM)标记的HA6适配子对166例H.pylori感染的患者胃黏膜中H.pylori进行检测,检出率为94.58%,高于同批次快速脲酶检测法的检出率(87.95%)。结论本研究筛选出的特异性结合H.pylori菌体表面HpaA的适配子,可能作为一种新的方法应用于胃黏膜组织中H.pylori的检测。     

筛选HIV-1 P24蛋白适配子的一种简便的SELEX方法

目的 快速筛选HIV-1 P24抗原适配子,并验证其特异性与亲和力.方法 利用聚碳酯材料PCR板包被P24抗原,在PCR板中运用SELEX技术进行适配子筛选.对多条适配子序列进行了一级结构及二级结构软件分析.酶联免疫法(ELISA)对筛选到的适配子进行亲和力及特异性验证.结果 确定用聚碳酯材料可以包被P24抗原,ELISA法检测抗原包被浓度与吸光度(A值)正相关;电泳显示适配子得到富集筛选;测序后软件分析表明多条适配子有共有序列,空间结构多样;用ELISA法,结合辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(SA)与生物素标记的适配子,对适配子与P24的亲和力进行验证,表明筛选到的适配子与P24抗原有特异性的高亲和力结合.结论 建立了一种简便的筛选HIV-1 P24抗原适配子的方法,筛选到特异性的高亲和力P24适配子.     

SELEX技术筛选结核分枝杆菌MPT64蛋白DNA适配子方法学研究

目的 利用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选能与结核分枝杆菌MPT64蛋白特异结合的寡核苷酸适配子.方法 体外合成长度为78个核苷酸的随机ssDNA文库,利用SEL-EX技术筛选,以MPT64蛋白为靶物质进行12轮筛选,利用生物素-亲和素显色系统检测寡核苷酸与蛋白的结合性.结果 SELEX技术筛选MPT64蛋白适配子的技术体系:PCR扩增的最佳退火温度为65℃;文库优化时,最佳Mg2+的浓度为1.5 mmol/L;不对称PCR法制备ssDNA时,Mg2+的浓度为0.75 mmol/L;以酶联板为介质筛选时,在10轮后筛选达到饱和,且随着筛选轮数的增加,PCR扩增产物的电泳条带逐渐单一、致密,亲和性检测显示第10轮获得的适配子库,比初始的文库亲和性吸光度(A)值增加了9.18倍.将适配子库克隆,随机挑取10个单克隆子,利用混合夹心法检测其与MPT64的亲和性,亲和性范围分布在0.572～1.606之间.结论 已初步筛选到与MPT64蛋白高亲和性结合的DNA适配子.     

5-羟色胺受体适配子的筛选及其抗抑郁功能

目的 探索通过筛选获得的核酸适配子特异性结合5-羟色胺受体(5-HTR)从而阻断5-羟色胺(5-HT)摄取而达到拮抗抑郁的功效。方法 小鼠5-HT_1AR基因被克隆、构建、表达并纯化后作为靶标,利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选能够特异性结合5-HT_1AR的ssDNA(单链脱氧核苷酸)适配子,并测定ssDNA的结合位点、相对结合力及识别位点;并在体外细胞水平和小鼠抑郁模型中验证ssDNA适配子对5-HT摄取的影响及抗抑郁的疗效。结果 成功克隆构建了pET28a-5-HT_1AR质粒,质粒被转化入DH5ɑ细菌,IPTG诱导表达后通过6×组氨酸标签纯化5-HT_1AR蛋白;经肽指纹图谱分析其与小鼠5-HT_1AR蛋白一致;以此为靶标经过12轮的正向筛选和5轮的负向筛选,获得4个高亲和力和高特异性的适配子,且适配子能够识别相同位点。并在体外验证亲和力最高的18号适配子能够显著影响5-HT的摄取,且通过小鼠悬尾实验证明适配子静脉注射后对小鼠抑郁状态的改善。结论 5-HTR适配子有...     

SELEX技术及其在医学中的应用

指数富集配基的系统进化(SELEX)技术是一类新的组合化学技术,应用人工合成的随机寡核苷酸文库,通过筛选、分离、富集获得能与各种配体特异结合的寡核苷酸适配子(Aptamer),且具有高亲和力。目前涉及多种疾病治疗的适配子,包括感染性疾病,肿瘤,心血管疾病,免疫系统疾病等已被筛选出来,并且疗效已经通过体外实验或动物模型得到证实。两个适配子已进入药物III期临床实验阶段,还有很多适配子正处于预临床实验阶段,其中部分将很快进入临床实验。本文综述了SELEX技术及寡核苷酸适配子在治疗领域的最新进展,并且对其前景进行了分析和预测。     

SELEX技术在神经系统疾病研究中的应用

配体指数级富集系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术是一种组合化学技术,可经过反复筛选扩增得到针对靶分子的高亲和力和高特异性的适配子.适配子通过识别、结合特定靶分子并对其进行功能调控从而达到对疾病诊断和治疗的目的 .近年来SELEX技术在神经系统功能和疾病研究中的应用越来越多.现已经筛选出针对朊蛋白、肌腱蛋白-C、β-淀粉样肽、乙酰胆碱受体的自身抗体等靶标的适配子,促进了对朊病毒病、脑肿瘤、阿茨海默病、重症肌无力等神经系统疾病的诊断和治疗研究,为这些疾病的诊治提供了新的研究工具.