适用于提取新生隐球酵母菌及白色假丝酵母菌总核糖核酸快速方法研究

目的 探讨快速可以兼顾提取高质量的新生隐球酵母菌和白色假丝酵母菌总核糖核酸(RNA)的试验方法,为各种功能基因的表达研究奠定基础.方法 针对新生隐球酵母菌荚膜株和荚膜缺陷株新生隐球酵母菌H99及白色假丝酵母菌国际标准菌株ATCC 64548采用冷酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit法提取总核糖核酸(RNA),用紫外线分光光度计测量其OD260、OD280的值,并且进行琼脂糖凝胶电泳,同时应用RT-PCR鉴定RNA质量.结果 提取的新生隐球酵母菌荚膜株和荚膜缺陷株总RNA产量分别为0.6μg/107细胞、1.5 μg/107细胞,且OD260/OD280比值在1.8～2.0,电泳显示提取的总RNA呈现28S rRNA,18S rRNA和5s rRNA 3条清晰的条带;提取的白色假丝酵母和菌丝相总RNA产量分别为2.3 μg/107细胞、3.1 μg/107细胞,且OD260/OD280比值在1.8～2.0,电泳显示提取的总RNA呈现28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA 3条清晰的条带.结论 冷酸洗玻璃珠联合Yeast RNA kit法,快速高质量适用于大小样本的新生隐球酵母菌和白色假丝酵母菌总RNA提取,满足各种类型分子生物学研究需要以及临床鉴别诊断治疗不同种类真菌感染.     

龟分枝杆菌与结核分枝杆菌标准菌株对含氯消毒剂抗力比较

目的 了解龟分枝杆菌与结核分枝杆菌标准菌株对含氯消毒剂杀菌的抵抗力.方法 采用悬液定量杀菌试验方法进行研究.结果 有效氯1 000 mg/L的消毒液作用2.5 min,对龟分枝杆菌脓肿亚种与结核分枝杆菌标准菌株的杀灭对数值均＞ 4.00; 500 mg/L有效氯作用2.5 min对龟分枝杆菌脓肿亚种杀灭对数值为3.05,对结核分枝杆菌标准菌株的杀灭对数值为2.10.结论 龟分枝杆菌脓肿亚种与结核分枝杆菌标准菌株对含氯消毒剂的抵抗力相近.     

评价显微镜观察药物敏感性技术(MODS)快速检测肺泡灌洗液中结核分枝杆菌对菌阴肺结核的临床诊断价值

目的:探讨肺泡灌洗液中结核分枝杆菌对菌阴肺结核临床诊断过程中显微镜观察药物敏感性技术(MODS)的应用价值。方法:整理2017年3月~2019年3月本院100份肺泡灌洗液标本,对其分别实施MODS、罗氏培养法检测,回顾分析检测结果。结果:与罗氏培养法相比,MODS对结核分枝杆菌的阳性检出时间明显缩短(P<0.05);MODS对结核分枝杆菌的阳性检出率高于罗氏培养法对应的阳性检出率(P<0.05)。结论:肺泡灌洗液中结核分枝杆菌对菌阴肺结核临床诊断期间通过应用MODS技术,可缩短诊断时间,提高阳性检出,保证菌阴性肺结核的诊断准确率。     

MPB64抗原检测对分枝杆菌菌型快速鉴别的价值探讨

结核病的控制关键在于早发现和早治疗,在结核的确诊中,必须进行患者痰结核菌的培养鉴定。传统分枝杆菌菌型鉴别耗时长、操作复杂;特异性的核酸探针的检测鉴定方法,需要昂贵的设备和试剂,难以在日常的检查中推广。本实验利用结核分枝杆菌胶体金法对该菌分泌的MPB64特异性蛋白进行检测,以对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行鉴别。     

实时荧光PCR方法检测结核分枝杆菌mRNA的研究

目的建立检测结核分枝杆菌mRNA表达水平的实时荧光PCR反应体系,快速鉴定结核分枝杆菌。方法设计合成结核分枝杆菌mRNA相应引物和探针,探针标记以JOE为报告基团,BHQ1为猝灭基团。优化反应条件,建立结核分枝杆菌mRNA的实时荧光PCR检测方法。通过检测22份肺结核患者痰液、10份健康无症状人群痰液、结核分枝杆菌标准菌株和偶然分枝杆菌菌株培养菌落,检验方法的特异性、重复性和灵敏度。结果肺结核患者痰液检测均出现典型扩增曲线,CT均值31.35,标准差4.31。健康无症状人群痰液及偶然分枝杆菌未出现扩展曲线。对痰液标本及稀释RNA重复检测的变异系数在2.54%以下,检测CT值与痰涂片抗酸染色分枝杆菌的数量呈良好相关性。结论建立了一种快速实时检测结核分枝杆菌mRNA基因的荧光PCR方法,具有良好的敏感性和特异性。     

两种实验方法评价含氯消毒剂对HBsAg破坏试验

消毒剂消毒性能评价常用的试验方法之一是 HBs Ag破坏试验 ,在卫生部 1 999年版《消毒技术规范》中 ,将 HBs Ag破坏试验分为 HBs Ag悬液定性法和载体微量定性法两大类。为了比较同一种消毒剂在相同条件情况下 ,两种方法对 HBs Ag灭活效果是否相同 ,我们选择含氯消毒剂进行试验比较 ,结果报告如下。1　方法1 .1　 HBs Ag试剂灵敏度的检测　取 HBs Ag悬液 ,用 1 0 %小牛血清的 PBS稀释为 1 0 0μg/ ml的参比标准品 ,取标准品用 1 0 %小牛血清的 PBS进行系列稀释。用 EL ISA法测定各管 HBs Ag稀释液的 OD值。以 HBs Ag为阳性的…     

金黄色葡萄球菌试管法血浆凝固酶试验影响因素的探讨

目的 探究金黄色葡萄球菌试管法血浆凝固酶试验的影响因素.方法 按《全国临床检验操作规程》方法操作,比较菌悬液的浓度、菌悬液介质、健康人血浆含抗凝剂种类以及血浆稀释度对试管法血浆凝固酶试验结果的影响.结果 当菌液的浓度分别为2、3、4 MCF和＞4 MCF时,含不同抗凝剂的人血浆凝块形成时间不一,只有当菌液的浓度＞4 MCF时,且该菌悬液与稀释度不超过1:4的血浆混合时,这些血浆都凝固的最短时间为3.5 h;用生理盐水或去离子水配制的菌悬液与含同种抗凝剂血浆的凝固效果无差异.结论 在金葡菌血浆凝固酶试验过程中,菌悬液浓度宜＞4MCF;菌悬液介质可选择无菌去离子水或生理盐水;当血浆稀释度≤1:4时,可在3.5h内观察结果;选择含肝素钠、枸橼酸钠和氟化钠抗凝剂的健康人血浆均可用于血浆凝固酶试验.     

次氯酸消毒液对皮肤软组织感染常见病原体体外杀菌试验效果分析

目的探讨次氯酸对皮肤软组织感染常见病原体(包括标准菌株及临床菌株)的体外杀菌效果,为临床应用提供依据。方法根据《消毒技术规范》将0.5麦氏单位的临床分离菌株菌悬液与次氯酸作用1min和10min,然后将作用后的液体与中和剂混合中和消毒效果;普通病原体的混合液取1.0ml进行琼脂倾注法培养,化脓性链球菌和非结核分枝杆菌的混合液取0.1ml分别在血平板和7H10平板上进行涂布法培养;除非结核分枝杆菌培养7d外,其他病原体培养48h后进行菌落计数,计算杀菌对数值。结果次氯酸作用标准菌株1min或10min均可将菌量从0.5麦氏单位(相当于107)降到0;临床菌株包括化脓性链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐碳青霉烯类的鲍氏不动杆菌(CRAB)、耐碳青霉烯类的铜绿假单胞菌(CRPA)、耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯杆菌(CRKB)、脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌和产气荚膜杆菌也得到同样结果。结论本试验首次系统全面检测次氯酸对皮肤软组织感染常见的病原体(包括非结核分枝杆菌、厌氧菌、真菌等)均有很好的体外杀菌活性,可以作为感染伤口的局部用药。     

3种稀释液制备的菌悬液存活时限比较

目的了解不同稀释液制备的试验菌菌悬液的存活时限,为微生物实验室的菌悬液制备及使用提供参考。方法参照2010年版《中国药典》微生物限度检查的菌悬液制备,用0.9%氯化钠溶液、0.1%蛋白胨水溶液、p H值为7的氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液,分别对6种试验菌制备成含菌数约100 cfu/ml的菌悬液,于4℃保存,并进行活菌计数。结果黑曲霉菌悬液和枯草芽孢杆菌的芽孢菌悬液在3种稀释液中3个月的活菌数相对稳定;白色念珠菌在p H值为7的氯化钠-蛋白胨缓冲液中1个月的活菌数相对稳定;大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等在p H值为7的氯化钠-蛋白胨缓冲液中的稳定性优于另外2种稀释液。结论采用适宜的稀释液制备试验菌的菌悬液,可提高其稳定性,延长存活时限,从而提高工作效率,节约实验成本,更适应微生物实验室的工作需要。     

3种细菌采样方法捕获力的对比研究

目的对常用的细菌采样方法的采样效率进行对比. 方法分别用棉拭子采样倾注培养法、棉拭子采样直接涂抹接种于营养琼脂法以及RODAC印压法3种常用的细菌采样方法,对不同菌液浓度制备的实验菌板和保洁后医院环境进行采样、培养、计数,比较采样效果. 结果当制备菌板的菌浓度为108～105 CFU/ml时,用倾注法采样,菌落数可通过稀释较准确的获得,而RODAC和涂抹法采样则菌落连成片,无法计数;当制备菌板的菌浓度为104～102 CFU/ml时和保洁后医院环境采样,RODAC法对细菌的捕获力优于倾注法和涂抹法(P＜0.05). 结论倾注法适用于物体表面细菌量多时采样;而细菌量少时,RODAC方法优于倾注法和直接涂抹法.     

大鼠深Ⅱ度烫伤合并创面感染模型的构建

目的建立一种稳定性高、重复性好的深Ⅱ度大鼠烫伤合并创面感染的动物模型,用于烫伤合并创面感染的修复及治疗的研究。方法选取40只SD大鼠,随机分成5组,采用自制烫伤仪(蒸汽温度94℃)对大鼠皮肤进行烫伤,致伤时间点分别为4、6、8、10和12 s(每只大鼠脊柱两侧分别致伤2个相同创面),烫伤24 h后观察创面组织学变化,分析形成深Ⅱ度烫伤创面的最佳致伤时间。选取30只SD大鼠,随机分为3组,每组10只,采用最佳致伤时间形成深Ⅱ度烫伤创面,3组大鼠一侧创面分别接种浓度为1×10~7、1×10~8和1×10~(9 )CFU/mL铜绿假单胞菌菌液0.3 mL,另一侧均接种等体积生理盐水作为对照,接种24 h后观察大鼠创面一般状况,采用HE染色对创面进行染色并观察炎症反应,分别于接种1、2、4、7和14 d后检测痂下细菌数量,并记录大鼠创面愈合时间。结果(1)组织病理学结果显示,致伤时间为8 s是形成深Ⅱ度创面的最佳致伤时间。(2)大鼠深Ⅱ度烫伤创面接种1×10~8、1×10~(9 )CFU/mL细菌后均有明显的炎性细胞浸润,后者痂下炎性浸润更明显。烫伤创面接种1×10~(9 )CFU/mL细菌14 d内,痂下细菌含量均高于1×10~(5 )CFU/g,且随着时间延长细菌含量呈持续上升趋势。大鼠创面愈合时间为(21.4±2.4)d,较生理盐水对照组创面愈合时间(18.4±1.7)d明显延长(t=2.72,P0.05)。结论温度94℃,烫伤时间8 s为形成深Ⅱ度烫伤的最佳致伤时间;创面接种浓度为1×10~(9 )CFU/mL铜绿假单胞菌可建立烫伤深度一致、重复性高、稳定性好的SD大鼠深Ⅱ度烫伤合并感染模型。     

氨溴索协同万古霉素对金黄色葡萄球菌生物被膜的研究

目的探讨氨溴索(AMB)协同万古霉素对金黄色葡萄球菌(SAU)生物被膜(BF)的破坏作用。方法构建SAU生物被膜体外模型;两倍稀释法测定最低抑菌浓度;扫描电镜(SEM)观察载体表面BF形态;MTT法行活菌计数。结果 3d或7d的BF,经AMB作用24h后用SEM观察,可见BF均明显少于对照组;BF内活菌计数显示,3d万古霉素(VAN)组、AMB+VAN组的SAU活菌计数分别为(19.14±5.64)、(6.44±1.53)、(3.13±0.95)×107 CFU/ml,7d分别为(43.28±3.74)、(27.39±4.97)、(17.61±2.14)×107 CFU/ml,均明显少于对照组(P<0.01),且AMB+VAN组更少于VAN组(P<0.01)。结论 AMB能破坏SAU已经形成的BF,与VAN联合应用后,可使BF内SAU显著减少,显示出了协同杀菌作用。     

速冻米面制品中两种金黄色葡萄球菌计数方法的比较

目的:比较和分析速冻米面制品中金黄色球菌计数的两种方法。方法:采用直接生理盐水稀释和用7.5%的NaCl肉汤4 h前增菌处理两种样品对含一定浓度(2.6×105 CFU/ml)的金黄色葡萄球菌加菌样品进行处理并采用Baird-Parker培养基对金黄色葡萄球菌计数。结果:4 h前增菌处理法优于生理盐水稀释法,更接近于人工加入的细菌数2.6×105 CFU/ml。结论:采用4 h前增菌处理后计数更接近于加入的细菌数,没有增加,具有可行性。     

ATP含量与细菌数及血液稀释度的相关性研究

目的 对ATP含量与细菌数及血液稀释度进行相关性研究,探讨ATP生物荧光法检测医疗器械清洗效果的可行性.方法 将大肠埃希菌ATCC 8099稀释到108、107、106、105、104、103、102进行ATP含量测定,找到ATP含量与菌落数的对应关系;将志愿者血液梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、5×10-5、2.5×10-5、2.5×10-6、2.5×10-7、2.5×10-8;进行ATP含量测定,找到ATP含量与不同血液稀释度的对应关系.结果 细菌浓度在(102～108) CFU/ml时,菌数对数值与Biotech生物荧光快速检测系统测得的ATP含量对数值成线性关系(R2=0.9791,P＜0.0001);血液稀释10-4～10-8范围时,血液稀释度对数值与Biotech生物荧光快速检测系统测得的ATP含量对数值成线性关系(R2=0.9818,P=0.0001).结论 在一定范围内ATP含量与细菌数成线性相关;血液稀释度在一定范围时ATP含量与血液稀释度成线性相关,通过ATP生物荧光法测ATP含量,可用于检测医疗器械清洗效果.     

秀丽隐杆线虫-泛耐药肺炎克雷伯菌感染模型的建立

目的建立泛耐药肺炎克雷伯菌（XDRKP）感染秀丽隐杆线虫感染模型。方法在液体条件下,利用临床分离的XDRKP菌株感染秀丽隐杆线虫,观察线虫存活及体内细菌数量变化情况。结果线虫感染XDRKP后活动明显迟缓,不同浓度的XDRKP对线虫的致死情况不同。log-rank检验显示,1.5×10⁶ CFU/mL XDRKP组与E.coli OP₅₀对照组的生存曲线差异无统计学意义（χ2=0.08,P>0.05）;1.5×10⁷、1.5×10⁸ CFU/mL组与E.coli OP50对照组的生存曲线差异均有统计学（χ²值分别为229.37、275.98,均P<0.001）,1.5×108与1.5×10⁷ CFU/mL XDRKP组线虫的生存率低于对照组。实验获得上清悬液,经细菌纯培养后进行细菌鉴定和药敏测试,证实为XDRKP。XDRKP感染线虫4、6、12、24 h后,线虫体内细菌总量分别为（0.28±0.02）×10⁵、（0.50±0.38）×10⁵、（1.73±0.56）×10⁵、（2.62±0.53）×10⁵ CFU/mL,不同时间线虫体内细菌总数存在统计学差异（F=1 363.39,P<0.001）。结论成功建立了秀丽隐杆线虫-XDRKP感染模型。     

阳极溶出伏安法同时测定罐头食品中锌、镉、锡、铅和铜的含量

本文研究了用1.5次微分阳极溶出伏安法,在盐酸-甲醇底液中,以棒状银基汞膜电极为工作电极,同时测定罐头食品中锌、镉、锡、铅和铜的方法。在0.24M盐酸-甲醇底液中五种元素的阳极溶出峰电位分别为:锌-1.05V,镉0.74V、锡-0.55V,铅-0.44V,铜-0.25V(相对SCE)。镉、锡、铅、铜的浓度在20～500ng/ml范围、锌浓度在0.2～4μg/ml范围与峰高呈线性关系。罐头食品用混合酸消化后取稀释液测定,果汁可用底液稀释直接测定。样品测定精密度为6.7～8.0％,回收率为91.2～107％。     

华东农村地区利福平耐药结核病的 分子流行病学特征研究

目的 描述华东农村地区利福平耐药结核分枝杆菌(结核菌)的耐药相关分子特征和成簇性规律.方法 以浙江省和江苏省两个农业县结核病防治所一年内所有登记的结核菌检测阳性肺结核病例为研究对象,收集痰标本、培养分离菌株,并进行问卷调查;对培养获得的结核菌株采用比例法进行药敏试验.对获得的65株利福平耐药结核菌株进行rpoB基因利福平耐药决定区和katG基因异烟肼耐药相关热点区测序,采用间隔区寡核苷酸分型(spoligotyping)方法识别北京株,采用IS6110限制性内切酶多态指纹技术(RFLP)对分离株进行基因分型和成簇性分析.结果 92%(60/65)的利福平耐药菌株在利福平耐药决定区531位(57%)、526位(29%)或516位(11%)发生突变,82%(49/60)的rpoB基因突变菌株为耐多药结核菌(MDR-TB);spoligotyping识别H{54株(83%)北京家族菌株;IS6110-RFLP发现共有24株(37%)利福平耐药菌株成簇,形成11个簇,提示簇中病例的结核菌近期传播.所有成簇菌株都为MDR-TB.共有7个簇,簇内菌株具有不完全相同的利福平耐药相关的rpoB基因突变.分析可能与成簇性相关的因素,初治病例在菌株成簇患者中的比例高于在菌株非成簇患者中所占的比例(初治/复治:OR=3.342,95%CI:1.081～10.32).结论 在其他耐药结核菌(如异烟肼耐药结核菌)中进一步产生对利福平的选择性耐药和生长,很有可能是利福平耐药结核病流行的基础,而既往较长的不规则治疗史也为利福平耐药的发生和传播提供条件.     

RP-HPLC法测定雾化温度对吸入用布地奈德混悬液稳定性的影响

目的:建立雾化温度对吸入用布地奈德混悬液稳定性影响的测定方法。方法:采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法,以Gemini C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 m)为分离柱,以甲醇+水82∶18(V/V)体积比为流动相,流速为1.0 ml/min,检测波长为244 nm,柱温约为25℃,测定雾化温度对吸入用布地奈德混悬液稳定性的影响。结果:布地奈德的保留时间约为6 min,布地奈德与其他组峰的分离度>1.5;方法精密度试验RSD为0.46%;供试品溶液在24 h内稳定。布地奈德在浓度0.01~0.15 mg/ml范围内与峰面积呈现良好的线性关系,回归方程为:A=5×107 c+20336(r=0.9999)。不同批次样品测量平均回收率为96.35%(RSD=1.01%,n=3)。超声雾化仪药杯底部中心点最高温度≤46℃,供试品溶液在80℃以内稳定。结论:RP-HPLC法测定吸入用布地奈德混悬液的含量,其精密度好、准确度高,布地奈德在雾化过程中能够保持稳定,不受温度变化的影响。     

薄膜分散-超声法制备BMPs磁性脂质体

目的 采用薄膜分散-超声法制备磁性颗粒(bacterial magnetic particles,BMPs)脂质体,考察BMPs浓度、超声功率和超声时间等因素对BMPs磁性脂质体粒径的影响.方法 薄膜分散-超声法制备BMPs脂质体,调节BMPs浓度、超声功率和超声时间等因素,激光散射粒度仪测定磁性脂质体粒径.结果 以薄膜分散-超声法制备的BMPs脂质体,BMPs浓度在(20～60)μg/mL时,磁性脂质体粒径基本稳定,平均94.9nm;BMPs浓度在(60～100)μg/mL时,磁性脂质体粒径随着BMPs浓度增加而有增大的趋势.超声功率的增加或超声有效时间增大时,磁性脂质体的平均粒径有减小趋势,当超声功率为300W、有效超声时间为100s时,粒径出现最小值;但其后都存在转折,随着超声功率的再增加或超声有效时间再增大时,平均粒径反而出现增大现象.结论薄膜分散-超声法制备BMPs脂质体,通过控制BMPs浓度、超声功率和超声时间等因素,可以对磁性脂质体粒径进行调节.     

免疫抑制BALB/c小鼠系统性白假丝酵母菌感染生物指标模型的建立

目的探讨经腹腔注射白假丝酵母菌建立免疫抑制BALB/c小鼠系统性感染的生物指标模型,为研究白假丝酵母菌感染的致病机制和抗真菌药物的药效学提供相关动物模型。方法对免疫抑制组BALB/c小鼠(腹腔注射环磷酰胺200 mg/kg·d,连续2 d)经腹腔注射白假丝酵母菌增强毒力株0.25 mL(浓度为1×10~(7 )CFU/mL)建立系统性白假丝酵母菌感染模型;取小鼠尾静脉血进行白细胞和中性粒细胞计数,取小鼠组织进行真菌镜检、培养、病理检查以及(1,3)-β-D-葡聚糖检测。结果免疫抑制组与对照组小鼠用药后第4天白细胞计数、中性粒细胞计数、平均体重比较,差异均具有统计学意义(均P0.05)。白假丝酵母菌感染组生存率为30.00%,对照组生存率为100.00%,两组生存率比较,差异有统计学意义(P0.05)。对注射真菌后第2~14天死亡小鼠以及第14天存活小鼠进行解剖,发现肺、肝、肾组织出现多处脓肿,以肾组织感染最为显著;小鼠组织真菌直接镜检可见大量菌丝体,组织培养均为白假丝酵母菌,组织病理可见大量菌丝体、炎细胞及组织坏死。白假丝酵母菌感染组肺、肾组织(1,3)-β-D-葡聚糖均增高,与对照组比较,差异均有统计学意义(均P0.05)。结论本实验方法可以成功建立免疫抑制BALB/c小鼠系统性白假丝酵母菌感染的动物模型。