表达HIV-1 gag基因的重组AAV2/1和Ad5疫苗免疫原性比较

目的 在小鼠体内比较表达HIT-1 gag基因的重组AAV2/1和Ad5疫苗的免疫原性.方法 分别用rAAV2/1-gag或rAd5-gag单独免疫BALB/c小鼠一次或两次,于免疫后不同时间点用CFSE染色法和胞内细胞因子染色法检测Gag特异性细胞免疫应答,用ELISA方法检测Gag特异性抗体反应.结果 单次免疫结果显示,在所有检测点rAd5-gag所诱导的Gag特异性CTL应答都比rAAV2/1-gag强,抗体反应在免疫后4周无明显差异.两次免疫后4周的检测结果表明,rAd5-gag所诱导的Gag特异性CTL应答比rAAV2/1-gag强,但抗体反应比rAAV2/1-gag组弱.结论 rAd5-gag诱导了很好的HIV-1特异性细胞和抗体反应,而rAAV2/1-gag诱导的HIV-1特异性抗体反应很强,但细胞免疫应答较弱.     

表达HIV-1 B亚型env基因的质粒DNA及腺病毒载体疫苗的免疫原性研究

目的 构建表达中国B亚型HIV-1流行株env基因的DNA及重组腺病毒载体疫苗,将其用于预防或治疗HIV感染.方法 构建质粒DNA疫苗pVR-gp160及重组腺病毒载体疫苗rAdV-gp160.将这两种疫苗以不同的方式免疫BALB/c小鼠,分别采用ELISPOT方法 和ELISA方法 检测免疫小鼠中HIV-1 Gp120特异性细胞免疫反应及抗体反应.结果 DNA疫苗单独免疫及DNA疫苗初免/腺病毒疫苗加强免疫的联合免疫方案皆可诱导较高水平的Gp120特异性细胞免疫反应;而在体液免疫方面,各实验组产生的Gp120特异性抗体水平都较低.结论 所构建的DNA疫苗及rAdV疫苗能有效表达Gp160蛋白,并可有效激活机体的细胞免疫反应.     

含HIV-1 gag基因的重组腺病毒5型与35型嵌合病毒免疫效果研究

目的探讨含HIV-1 gag基因的重组腺病毒5型与35型嵌合病毒(rAd5/F35)在BALB/c小鼠中的免疫效果。方法PCR,间接免疫荧光鉴定HIV-1gag基因在重组腺病毒(rAd5/F35-mod.gag)的正确插入和体外细胞水平的表达,用rAd5/F35-mod.gag以不同的方式免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中的p24特异性抗体,细胞内细胞因子染色法检测小鼠的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。结果重组腺病毒rAd5/F35-mod.gag在体外细胞水平可以很好的表达目的基因gag;在小鼠体内重组腺病毒rAd5/F35-mod.gag可诱导特异性的CTL应答和血清IgG抗体反应,用rAd5/F35单独免疫2次,所诱发的CTL和血清IgG反应最强。但Ad5初次感染后,产生的抗Ad5抗体可以抑制rAd5/F35疫苗的特异性免疫反应。结论重组腺病毒rAd5/F35-mod.gag单独免疫可在小鼠体内诱导特异性的CTL应答和血清IgG抗体反应。只改变Ad5纤突蛋白Fiber,不能避免抗Ad5抗体的抑制作用。     

禽流感 HA 基因密码子优化的 DNA 疫苗构建及其免疫原性的初步研究

 目的 构建H5 N1亚型禽流感病毒株密码子优化的血凝素（HA）DNA疫苗并研究其免疫原性。方法 应用MacVector软件分析H5N1亚型禽流感病毒A/Viet Nam 1203/04株HA（H5-VN HA）基因序列，对这些序列进行密码子优化处理，人工合成优化后的H5-VN HA基因。将密码子优化H5-VN HA基因与pSW3891质粒连接，并以人组织纤维蛋白溶酶原激活剂（tPA）信号肽取代H5-VN HA信号肽，构建成表达H5-VN HA基因的重组质粒，命名为HA-VN.tPA（即密码子优化的H5-VN HA基因DNA疫苗）。以HA-VN.tPA转染293T细胞，应用蛋白质印迹法检测转染细胞中HA蛋白的表达。以HA-VN.tPA对2只新西兰兔进行DNA免疫，用ELISA方法检测分析免疫后兔血清中HA特异性抗体的产生。结果 密码子优化的H5-VN HA基因中哺乳动物细胞偏爱的密码子频率高于野生型H5-VN HA基因。蛋白质印迹法分析结果表明，HA-VN.tPA转染293T细胞后，细胞裂解液中检测出HA蛋白的表达。ELISA分析结果表明，以HA-VN.tPA免疫3次后，实验兔体内产生了较高水平的HA特异性抗体（血清中平台期抗体滴度达1:13 500）。结论 成功构建了H5N1亚型禽流感病毒密码子优化的HA 基因DNA疫苗，该疫苗可引导免疫后宿主体内产生高滴度特异性抗体。     

HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因改造及其重组DNA疫苗的构建

目的 构建表达含有密码子优化的HIV-1 CRF01_AE亚型env基因的DNA疫苗,为多载体艾滋病治疗性疫苗的应用提供候选疫苗.方法 对HIV-1感染者血液样本进行型别分析,分型得到的AE亚型标本采用亚型特异性引物克隆env基因,通过序列比对获得其共有序列,对该序列按照哺乳动物密码子使用的偏嗜性进行优化,将人工合成的优化基因克隆至pVR载体,构建DNA疫苗.通过Western Blot方法比较优化前后env基因的表达.结果 成功获得32条具有完整的开放性阅读框的env克隆,型别分析确认均为CRF01_AE亚型.成功对其共有序列进行了优化、合成并构建了DNA疫苗pVR-mod.AE env,该疫苗与野生型的env基因（wt.AE env）相比可以高水平表达env基因,且不依赖Rev的存在.结论 对HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因的优化改造及重组DNA疫苗的构建是成功的.     

改善HIV—1DNA疫苗免疫原性的方法

1　 HIV-1 DNA疫苗的特点自 1 981年首次发现艾滋病以来 ,艾滋病病毒 ( HIV)的感染在全世界迅速广泛流行。到2 0 0 0年底 ,我国在 HIV感染人数已达 60万。由于药物的昂贵和耐药株的产生影响艾滋病的治疗。科学家认为预防 HIV传播的最佳措施是研制和应用安全而有效的预防性疫苗 ,而且认为研制有效的 HIV疫苗是可行的。目前科研人员研究了多种类型疫苗 ,其中最引人关注的是基因疫苗。HIV-DNA疫苗之所以受到科学家的关注 ,是因为 :基因疫苗与传统疫苗、基因工程疫苗相比 ,有以下优点 :1直接接种 DNA疫苗 ,生产成本低。 2接种基因疫…     

HIV gag DNA疫苗诱导小鼠特异性细胞免疫应答的研究

目的 研究小鼠注射HIV gag DNA疫苗后的抗原特异性细胞免疫应答.方法 C57BL/6小鼠以初免/加强的策略经肌肉注射HIV gag DNA疫苗,一周后获取其脾与肺的单个细胞,体外经Gag抗原多肽刺激后,采用ELISA法检测细胞培养上清中IFN-γ的水平,ELISPOT法检测IFN-γ分泌细胞的频率,流式细胞仪分析特异性T细胞的亚群.结果 经Gag多肽刺激后,加强免疫组IFN-γ产生的总体水平和分泌细胞频率均高于对照组及初次免疫组.HIV gag DNA疫苗可同时诱导产生Gag-特异性CD4 和CD8 T细胞.结论 HIV gagDNA疫苗免疫小鼠后可诱导抗原特异性效应性T细胞应答.     

中国HIV-1 CRF01_AE流行株结构基因和调节/辅助基因DNA疫苗的构建和免疫原性研究

目的 构建表达gag-env融合基因和tat-rev-integrase(c-holf)-vif-nef融合基因的DNA疫苗,并评价其免疫原性.方法 按人源密码子使用频率对AE2f株的gag、env、tat、rev、integrase、vif和nef基因序列进行优化,构建真核表达质粒.用Western blot法验证体外表达情况;用ELISPOT法检测小鼠的细胞免疫反应.结果 限制性酶切及DNA测序结果表明两个融合基因质粒构建正确,可以表达相应的融合蛋白.ELISPOT结果显示,Gag-Env特异性的T细胞反应强度为(3010±566)SFC/10~6脾细胞;Tat-Rev-Integrase(C-half)-Vif-Nef融合蛋白特异性的T细胞反应为(948±737)SFC/10~6脾细胞,均显著高于空载体组.结论 构建的表达HIV-1 CRF01_AE流行株gag-env融合基因和tat-rev-integrase(c-half)-vif-nef融合基因的DNA疫苗可以正确表达所编码的融合蛋白并有效地激活机体的T细胞免疫反应.     

增强DNA疫苗免疫原性的研究进展

DNA疫苗是疫苗领域的研究热点,与传统疫苗相比,具有能够同时诱导体液免疫和细胞免疫、安全、廉价等多种优势,但也存在免疫后抗体滴度不高、免疫效果差的问题。本文就目前DNA疫苗的免疫机制研究现状及其优化研究的进展进行了综述。     

插入IL-2基因优化HBV DNA疫苗的研究

目的：观察IL-2基因的插入对DNA疫苗免疫效应的影响，探讨优化DNA疫苗设计、提高DNA疫苗兔疫效应的途径。方法：采用PCR产物直接克隆和重组DNA技术构建了人IL-2和HBsAg融合基因的真核表达载体pcDNA3．1 -S/IL-2，通过脂质体基因转移技术导入Cos-7细胞中检测其瞬间表达，并经肌肉注射免疫C57Bl/6小鼠，以检测和比较它们的细胞和体液免疫应答。结果：通过酶切、PCR及测序证实已正确完整地插入 IL-2基因，成功构建了 pcDNA3．1 -S/IL-2重组质粒。体外转染Cos-7后可见基因的表达和分泌，pcDNA3．1 -S/IL-2可以提高免疫小鼠的抗 HBs抗体滴度和脾淋巴细胞诱生的IL-2的生物活性水平，增加 HBsAg特异性的脾淋巴细胞增殖指数。结论：IL-2和 HBsAg基因的融合表达对 DNA疫苗的免疫反应起协同和增强作用，提示IL-2基因插入可能是增强DNA疫苗的免疫效应的可行途径。     

Immunogenicity of the recombinant adenovirus type 5 vector with type 35 fiber containing HIV-1 gag gene

The immune efficiency of a recombinant adenovirus type 5 with type 35 fiber containing HIV-1 gag gene (rAd5/F35-mod.gag) was investigated in BALB/c mice, in which the rAd5/F35-mod.gag was firstly identified with PCR, then transfected to 293 cells and the in vitro expression level of Gag protein was determined by Western blotting and indirect immuno-fluorescent assay. Mice were immunized with intramuscular injections of rAd5/F35-mod.gag, rAd5-mod.gag or DNA and were boosted after 3 weeks. To test the effect of pre-existing anti-viral immunity on immunization, mice were also injected with Ad5-GFP vector and then immunized 4 and 7 weeks later with Ad5/F35-mod. gag vector. The P24-specific IgG antibody in sera of immunized mice was determined by ELISA and the specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) response was assayed by intracellular cytokine staining. It was demonstrated that the rAd5/F35-mod. gag vector could express efficiently the HIV Gag protein in 293 cells in vitro and induce strong HIV-specific immune responses in vivo. The strongest CTL and serum IgG response occurred when mice were immunized twice with injection of rAd5/F35 alone, but the anti-Ad5 antibody after primary infection with adenovirus could inhibit the specific immune responses induced by rAd5/F35 vector. It is concluded that single immunization with recombinant adenovirus rAd5/F35-mod. gag can induce specific CTL and serum IgG antibody responses in mice, but the immunogenicity of rAd5/F35 is comparably weaker than that of rAd5.     

骨桥蛋白短发卡样RNA质粒载体的构建与筛选

目的 构建携带骨桥蛋白双链小干扰RNA(OPN-siRNA)的质粒表达载体,筛选出基因沉默效果最明显的短发卡样RNA(shRNA)质粒表达载体.方法 设计并合成2个针对OPN的shRNA寡核苷酸片段(shRNA1,shRNA2),退火形成双链并分别克隆进入载体pGenesil-1.酶切鉴定后,采用LipofectamineTM2000介导的转染方法将重组的shRNA质粒转入大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),筛选出稳定转染株.采用RT-PCR及Western免疫印迹检测其对OPN表达的抑制效果.结果 shRNA质粒成功转染入VSMC且效率达50%以上.转染含OPN shRN A1的VSMC的OPN mRNA和蛋白的表达分别为0.16±0.04和0.30±0.09,含OPN shRNA2分别为0.23±0.06和0.44±0.06,两组之间及分别与正常细胞组比较差异均有统计学意义(P<0.01).空载体组和阴性对照组与正常细胞组比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 成功构建了靶向OPN基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为shRN A1质粒.     

携带HSP70-HBsAg嵌合基因复制缺陷型重组腺病毒的制备

目的 构建表达乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和热休克蛋白70(HSPT0)嵌合基因的复制缺陷型重组腺病毒载体.方法扩增结核分枝杆菌HSP70基因片段,亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBsAg上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共同电转化到大肠埃希菌BJ5183内进行同源重组,经卡那霉素抗性筛选和酶切鉴定筛选出携带HBsAg-HSP70嵌合基因的重组腺病毒载体,用脂质体包裹Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒,转染到293细胞内进行重组腺病毒的包装.体外转染真核细胞,通过示踪基因绿色荧光蛋白表达的观察、RT-PCR和ELISA检测目的基因的表达.结果成功获得重组腺病毒质粒pAd-HBsAg-HSP70.重组质粒pAd-HBsAg-HSP70导入293细胞,经包装和二次扩大培养获得了具有感染能力的重组腺病毒颗粒Ad-HBsAg-HSP70,其病毒滴度达2×1012pfu/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因.结论成功构建表达HBsAg-HSP70复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础.     

含密码子优化型HIV-1 gp120基因重组腺病毒的构建及其免疫效果研究

目的 构建能表达野生型和密码子优化型人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)B亚型中国流行株gp120基因的非复制型腺病毒。方法 按哺乳动物细胞偏好的密码子对HIV-1B亚型中国流行株Ch gp42的gp120基因进行优化，合成优化基因。将野生型和密码子优化的gp120基因插入穿梭质粒，再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E．coli BJ5183，获得重组子，转染293细胞后获得重组病毒。分别以两种重组腺病毒疫苗免疫小鼠，ELISA检测小鼠血清中的特异性抗体，乳酸脱氢酶法检测小鼠细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。结果 获得两株重组腺病毒rAd-wt．gp120和rAd．mod．gp120，能正确表达Gp120。rAd-mod．gp120比rAd-wt．gp120蛋白表达水平明显提高。重组腺病毒免疫小鼠后能产生HIV-1特异性的抗体及CTL反应，rAd-mod．gp120组明显优于rAd-wt．gp120组。结论 成功构建了表达野生型和密码子优化的HIV-1 gp120基因的重组腺病毒，能诱导HIV-1特异性体液和细胞免疫反应。     

靶向髓样细胞表达的激发受体1基因短发夹RNA真核质粒表达载体的构建及筛选

目的 构建编码髓样细胞表达的激发受体1(TREM-1)基因短发夹RNA(shRNA)真核质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 针对TREM-1的靶位点设计含shRNA的靶序列,分别构建pGCsi-TREM-1 shRNA1和pGCsi-TREM-1 shRNA2的质粒表达载体和pGCsi-NegshRNA阴性质粒表达载体,通过酶切及测序进行鉴定.鉴定后以脂质体包裹转染肺泡上皮A549细胞,分为未转染对照组(A组)、转染空质粒载体pGCsi对照组(B组)、转染阴性shRNA质粒表达载体pGCsi-NegshRNA对照组(C组)、转染TREM-1 shRNA1质粒表达载体组(D组)和转染TREM-1shRNA2质粒表达载体组(E组),48 h后观察转染细胞绿色荧光蛋白表达效果.转染24、48、72 h后,以A组为对照采用MTT法测定B、C、D、E组细胞的存活率.转染48 h后,通过荧光定量PCR检测各组TREM-1 mRNA的表达水平并与转染前相比较.结果 经酶切和测序鉴定证实,目的 TREM-1基因shRNA1和shRNA2片段已被克隆到pGCsi载体中.荧光显微镜下,B、C、D、E组A549细胞有明显的绿色荧光蛋白表达.各时间点B、C、D、E组细胞存活率均达90%以上.A、B、C 3组转染前后TREM-1mRNA的表达水平差异无统计学意义,D、E组转染的重组质粒均能有效抑制A549细胞的TREM-1mRNA的表达([(1.945±0.252)×105比(1.010±0.194)×105,(1.933±0.216)×105比(1.202±0.171)×105,均P＜0.05],抑制率分别为48.07%和37.82%.结论 成功构建了靶向TREM-1基因的shRNA质粒表达载体,可有效抑制细胞中TREM-1目的 基因的表达,为后续脓毒症的基因治疗提供了依据.     

Ubc9基因重组腺病毒的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的构建携带Ubc9基因的重组腺病毒质粒pAdEasy-1/Ubc9,制备含Ubc9基因的重组腺病毒Ad-Ubc9,并使Ubc9在HeLa细胞中高效表达。方法 PCR法扩增目的Ubc9基因;用pemI酶切将穿梭质粒pAdTrack-CMV-Ubc9线性化;将线性化的穿梭质粒pAdTrack-CMV-Ubc9与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在感受态BJ5183菌内进行同源重组,筛选阳性重组子pAdEasy-1/Ubc9;再用PacI酶切pAdEasy-1/Ubc9使之线性化,线性化的重组腺病毒质粒经脂质体转染HEK293细胞,进行重组腺病毒的包装和扩增。收集重组腺病毒,感染HeLa细胞,用Westernblot方法检测Ubc9在HeLa细胞中的表达。结果通过PacI酶切证实携带Ubc9基因的腺病毒载体构建成功,包装出携带Ubc9基因的腺病毒能有效感染HeLa细胞。结论利用细菌内同源重组方法成功地构建了携带Ubc9的重组腺病毒载体,并能在HeLa细胞中高效表达。     

HIV-1型中国株E、B亚型gag基因的克隆与表达

目的 克隆和表达人免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）Ⅰ型中国株Ｅ、Ｂ亚型代表株的结构基因ｇａｇ。方法 在分子流行病学调查的基础上，选择１份经部分ｇｐ１２０基因测序判定为Ｅ亚型和１份经部分ｇｐ１２０基因测序判定为Ｂ亚型的代表性样品。利用套式聚合酶链反应（ＰＣＲ），扩增外周血中的前病毒。获得了结构基因ｇａｇ全长片断，并先后克隆到ｐｌｉｎ８Ｐｒ５５和ｐＦａｓｔＢａｃｌ载体中，我们首次克隆到全长的中国株Ｅ亚型ｇａｇ基