三嵌段骨基质材料的体外生物学性能评价

目的 对自主研制的三嵌段骨基质材料——聚丙交酯／乙交酯／天冬氨酸聚乙二醇（PLGA-[ASP—PEG]）的体外生物相容性进行评价。方法 选用建系的L929成纤维细胞进行细胞毒性试验、溶血试验和热原试验；并以PLGA作为对照，计算细胞黏附率。结果 PLGA—EASP-PEG]的毒性评级为0～Ⅰ级；细胞在其表面生长旺盛、形态良好；溶血率为3．08%无热原反应。PLGA-[-ASP—PEG]的细胞黏附率高于PI．GA（P〈0．05）。结论 PLGA-[ASP—PEG]具有良好的生物相容性。     

雪旺细胞在PLGA多管道新型支架中的黏附及增殖的研究

目的考察大鼠血旺细胞SCs在聚丙交酣/乙交酣共聚物PLGA多管道支架管腔表面黏附、增殖的情况,为利用组织工程学修复神经损伤提供新的生物支架材料。方法接种第三代SCs到7孔多管道PLGA支架中,利用MTT法测量不同时间段雪旺细胞在生物材料中的增值能力并且做电镜扫描观察雪旺细胞在官腔表面的形态和黏附情况。结果雪旺细胞种植在PLGA多管道支架中后增殖旺盛,其增殖状态在3 d后明显优于培养板中的对照组。电镜观察雪旺细胞在官腔表面黏附良好,排列有序。结论 PLGA多管道支架材料和雪旺细胞具有良好的生物相容性,是修复神经损伤可以选择的新的理想支架材料。     

新型nHA/PLGA纳米复合微球对大鼠颅骨缺损的修复作用

目的 探讨新型纳米羟基磷灰石（nHA）/聚丙交酯-乙交酯（PLGA）纳米复合微球对大鼠颅骨缺损的修复作用,为该材料的临床应用提供依据。     

特种肽支架材料对骨髓基质干细胞黏附、增殖及成骨分化的影响

目的 探讨新型含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽K16RGDSPC修饰聚丙交酯-CO-乙交酯（PLGA）-[ASP-PEG]支架材料对骨髓基质干细胞（BMSCs）在其表面黏附、增殖及成骨分化的影响。方法 固相合成法合成K16GRGDSPC并通过质谱仪和高压液相色谱进行鉴定。用交联剂Sulfo-LC-SPDP将K16GRGDSPC接枝到PLGA-[ASP-PEG]支架材料上,通过XPS图谱检测接枝反应的发生。将改性后的PLGA-[ASP-PEG]支架材料与兔BMSCs在成骨诱导培养基中复合培养,以未改性的支架材料作对照。通过沉淀法、微管吮吸法、MTT法和考马斯亮蓝法分别检测BMSCs的黏附和增殖性能的变化;应用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测BMSCs的ALP表达水平并通过RT-PCR检测细胞ALP、骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（OPN）和Ⅰ型胶原的表达,通过免疫荧光染色检测核心结合因子a1（Cbfal）表达,观察BMSCs向成骨细胞方向分化的情况。结果 XPS图谱证实含RGD肽K16GRGDSPC被成功地接枝到PLGA-[ASP-PEG]表面。复合BMSCs培养结果表明,改性后的PLGA-[ASP-PEG]表面BMSCs的黏附性能和增殖能力明显提高,而且其成骨标志物（ALP、OCN、OPN、Ⅰ型胶原和Cfba1）的表达均显著高于对照组（P〈0．05）。结论 含RGD肽K16GRGDSPC能促进BMSCs在骨基质材料表面的黏附、增殖并诱导其向成骨方向分化。     

以PHBV-PLGA为载体的硫酸庆大霉素缓释微球

以生物可降解聚羟基丁酸酯和羟基戊酸酯的共聚物（PHBV）、乙交酯和丙交酯的无规共聚物（PLGA）两种高分子作为壁材,采用复乳溶剂挥发法,制备了包裹硫酸庆大霉素（GS）的载药微球。在扫描电镜下观察到所得微球表面呈多孔状,为球形或椭圆形,粒径在20～80 μm。分析结果表明,包封率在60％以上,在体外16～20 d内药物全部释放,90 d微球体外降解50%左右。     

聚乙交酯-聚丙交酯降解支架复合胎儿脐动脉细胞构建组织工程血管

目的：探讨改良聚乙交酯-聚丙交酯（PLGA）降解支架复合胎儿脐动脉细胞方法构建组织工程血管（TEBV）的可行性。方法：将胎儿脐动脉的平滑肌细胞,内皮细胞种植于国产PLGA血管上并进行培育,观察两种细胞生长情况、检测内皮细胞、平滑肌细胞并测定其功能。结果：培育2mo后,平滑肌细胞,内皮细胞在PLGA血管片上黏附良好,材料组织相容性好。结论：应用PLGA降解支架复合胎儿脐动脉细胞构建组织工程血管的体外培养方法是可行的,PLGA支架有利于细胞生长、分化及功能发挥,动态培养方法培养出的TEBV色泽光亮,厚度均匀,具有良好的弹性。     

骨髓基质细胞与壳聚糖-聚磷酸三钙复合材料的生物相容性

目的：研究壳聚糖-聚磷酸三钙复合材料对离体培养的骨髓基质细胞黏附及增殖的影响,探讨二者的生物相容性,为骨组织工程中生物材料的选择提供实验依据。 方法：采用冻干法制备壳聚糖-聚磷酸三钙复合材料,培养兔骨髓基质细胞,传代扩增后接种到材料表面,体外继续培养,用倒置光学显微镜、扫描电镜观察细胞的黏附和生长情况,用MTT方法检测种植后2、4、6及8 d细胞的增殖情况。 结果：种植2 d后细胞呈梭形纤维细胞样,平均每100倍视野下,有生物材料的实验组与无材料的对照组胞数分别为(360±20)个和(76±18)个,二者比较差异有显著性（P＜0.01）。MTT法检测结果显示,两组细胞均保持持续增殖。且实验组增殖最快,接种后2、4 、6及8 d光吸收值与对照组比较,差异均有显著性（P＜0.01）。扫描电镜下可见材料呈多孔网状结构,兔骨髓基质细胞紧密贴附在材料表面,细胞可沿材料的孔隙活跃生长。 结论：壳聚糖-聚磷酸三钙复合材料能促进骨髓基质细胞的增殖;兔骨髓基质细胞与复合材料具有良好的生物相容性,可作为骨髓基质细胞的载体应用于组织工程。     

再造组织工程化平滑肌组织的实验研究

目的采用组织工程技术,将培养扩增的膀胱平滑肌细胞与国产可降解的聚合聚乙交酯丙交酯（PLGA）支架材料复合构建并植入裸鼠体内进行培育,探讨再造组织工程化平滑肌组织的可行性。方法从幼兔取膀胱,机械分离与酶消化获取培养平滑肌细胞,传代扩增平滑肌细胞后将其接种到国产PLGA支架材料的表面作为实验组,未接种细胞的单纯支架材料作为对照组。分别将它们植入到裸鼠体内进行培育。经裸鼠体内培育4周、8周后取材并进行大体观察、组织学及免疫组织化学检测。结果实验组标本经HE和Masson染色显示在材料表面形成数层平滑肌细胞层,经抗平滑肌α-肌动蛋白免疫组织化学染色呈棕黄色阳性。随着培育时间的延长,支架材料降解明显,而平滑肌细胞层进一步增殖形成平滑肌组织。对照组经HE染色材料表面见有少量成纤维细胞沉积,Masson染色示兰色,经抗平滑肌α-肌动蛋白免疫组织化学染色为阴性。结论采用国产PLGA聚合物为支架材料可再造出组织工程化平滑肌组织,为多种含平滑肌组织空腔脏器的组织工程研究奠定基础。     

聚L-乳酸/聚L-乳酸接枝的羟基磷灰石复合材料的生物相容性

目的： 研究新型生物降解可吸收材料聚L-乳酸/聚L-乳酸接枝的羟基磷灰石复合物（PLLA/PLLA-gHAP）的生物相容性,为其应用提供生物学依据。方法： 将96孔板上培养的L929细胞分为PLLA/PLLA-gHAP组、PLLA组、阴性对照组（空白培养液）及阳性对照组（含苯酚培养液）4个组,不同组材料浸提液与细胞共培养24、48和72h,以MTT法检测材料对L929细胞活性的影响;将L929细胞接种于被覆PLLA/PLLA-gHAP材料的盖玻片表面上,于1、2和3 d用倒置显微镜观察细胞形态学改变;将PLLA/PLLA-gHAP材料浸提液对小鼠进行腹腔内注射,观察小鼠的急性毒性反应,计数鼠骨髓多染红细胞微核率以检测遗传毒性作用;将PLLA/PLLA-gHAP板植入兔皮下,于2周、3个月和6个月检测兔血液学指标改变,光镜观察植入物周围组织病理学变化。结果：PLLA/PLLA-gHAP材料浸提液对L929细胞的增殖率(RGR)和细胞毒性分级（CTS）的影响与阴性对照组比较差异无显著性（P>0.05）,细胞在材料表面生长良好;材料浸提液对小鼠无急性毒性及遗传毒性（微核率0.24%）;材料在动物体内埋植后,早期组织内有淋巴细胞、巨噬细胞浸润,纤维膜形成,6个月时纤维膜基本消失,炎症反应明显减轻。结论：PLLA/PLLA-gHAP材料具有良好的生物相容性。     

PLGA-(PEG-ASP)n共聚物的合成与性能研究

以辛酸亚锡[Sn(Oct)2]为催化剂,聚乙二醇／L-天冬氨酸预聚物[(PEG-ASP)n]为共引发剂,引发D,L—LA和GA开环共聚合成具有功能侧氨基的PLGA-(PEGASP)n共聚物。通过FTIR、^1H—NMR、DSC、表面接触角测定和细胞培养等方法研究共聚物的结构与性能。结果表明,共聚物为典型的非晶态聚合物;共聚物的亲水性以及对骨髓基质细胞的粘附能力和粘附效率均明显优于PLGA。     

Repair of Rabbit Femoral Defects with a Novel BMP2-derived Oligopeptide P24

In this study, the bioactivity of a novel BMP2-derived oligopeptide P24 was investigated by using the model of rabbit femoral defect after loaded in the biodegradable poly （lactic acid / glycolic acid / asparagic acid-co-polyethylene glycol） （PLGA-[ASP-PEG]）. A 1.5-cm unilateral segmental bone defect was created in the left femoral diaphysis in each of the 30 new zealand white rabbits. The defects of 18 legs filled with BMP2-derived peptide P24 combined with PLGA-[ASP-PEG] scaffold serves as the experimental group, and the defects in the rest 12 rabbits filled with （PLGA-[ASP-PEG]） without P24 as control group. The bone-repairing capability in the target region of the two group was grossly, radiologically, histopathologically and biomechanically evaluated 4, 8 and 12 weeks after the operation. Our results showed that in each group, primary healing of incision was achieved in the two groups. Radiographically, in experimental group, defects were filled with induced callus within 8 weeks, and a cortical bone-like structure was observed in some animals at the 12th week. According to the standardized stage of bone defect repair, 9 （64.28%） achieved grade-4 healing. In contrast, little bone formation was seen in the defects even 12 weeks after the operation, and 5 （62.50%） had grade 0 healing in this group. Histologically, tissue engineering material was mostly absorbed and cartilage was found around implants in the experimental group at the 4th week; 8 weeks after operation, the engineering material was completely absorbed, and formation of woven bone was observed and typical trabecular bone structure could be seen. In control group, 8 weeks after operation, the defect was filled with fibrous tissues, and no bone-like structure was observed. Statistical analysis showed very significant difference in biomechanical indicators between the two groups （P〈0.05）. It is concluded that new oligopeptide P24 can induce excellent bone regeneration and promote bone repair.     

Combined Use of RGD-peptide Modified PLGA and TGF-β1 Gene Transfected MSCs to Improve Cell Biobehaviors in vitro

In order to improve the surface properties of PLGA polymer for a better material/cell interface to modulate the cells behaviors, we prepared a novel three-block copolymer, PLGA-[ASP-PEG], and immobilized an RGD-containing peptide, Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys （GRGDSPC） on the surface of it. Transforming growth factor-β1 （TGF-β1） was transfected into bone marrow stromal cells （MSCs） employed as seeded cells. Cell adhesion, spreading, proliferation and differentiation on this material were investigated. The results showed that the cell adhesive ratio on RGD-modified materials was higher than on un-modified materials （P〈0.05）. The extent of cell spreading was also wider on RGD-modified materials than on un-modified materials. Cell proliferation indices of transfected MSCs were increased as compared with the un-transfected MSCs （P〈0.05）. The ALP activities in the MSCs cultured with RGD-modified materials were higher than on un-modified materials after 14 days （P〈0.05）, and those in transfected MSCs were higher than in un-transfected MSCs （P〈0.05）. It was suggested that the combined use of RGD-modification and TGF-β gene transfection could improve the interaction of biomaterial and cells.     

两种高分子生物材料的细胞粘附性比较

目的比较骨髓基质干细胞(MSC)在聚-DL-乳酸(PDLLA)材料和聚乳酸与聚羟乙酸的共聚物(PL-GA)材料上的粘附性，并探讨不同测量方法的准确性。方法抽取兔骨髓，离心提取骨髓基质干细胞，在培养皿中培养并传代，传至第3代后，分别接种在上述两种材料上培养24h，然后通过体视学计数法、MTT法以及扫描电镜观察来测量或评价两种材料粘附率。结果体视学计数法所测PDLLA的粘附率为59．09％，PLGA的粘附率为68．75％；MTT法所测粘附率分别为70．59％和78．36％；扫描电镜观察结果为PDLLA材料上的粘附细胞数少于PLGA材料上的粘附细胞数。结论PLGA的细胞粘附性要优于PDLLA的粘附性。     

人工生物可降解支架聚乳酸-聚乙醇酸种植人食管上皮细胞的实验研究

目的研究人食管上皮细胞在聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)三维支架上的贴附和生长情况,利用组织工程技术培养工程化人工食管.方法制作PLGA三维细胞支架;分离培养成人食管上皮细胞,体外扩增后种植到PLGA支架上.在体外和裸鼠体内分别培养食管上皮细胞-支架复合物,分期终止培养,进行组织学染色、扫描电镜、细胞角蛋白免疫组织化学检测.结果体外培养发现,人食管上皮细胞在支架材料上贴附生长良好,长期培养仍保持食管上皮细胞特性,裸鼠体内培养4周后可形成食管黏膜样组织.结论 PLGA支架适合食管上皮细胞黏附生长,可作为食管组织工程的细胞载体.利用组织工程的方法可获得适于移植的工程化人工い食管.     

RGD多肽修饰的改性PLGA仿生支架材料对骨髓间充质干细胞粘附性影响的研究

目的了解精氨酸甘氨酸天冬氨酸(RGD多肽)修饰是否能提高改性的PLGA仿生支架材料对骨髓间充质干细胞的粘附性。方法用异型双功能交联剂SulfoLCSPDP将GRGDSPC多肽共价结合到改性PLGA支架材料上,以未接多肽的改性PLGA材料做对照,取第三代MSC接种到材料上,培养4、12小时后沉淀法定量检测粘附的细胞数,培养24小时后摄光镜图像比较粘附细胞的数量和形态。结果培养4、12小时后实验组细胞粘附率分别为0.17±0.01、0.38±0.02,均极显著高于对照组的0.08±0.01、0.14±0.01(P<0.01),且24小时后细胞的粘附质量也较对照组为好。结论RGD多肽修饰的确能提高改性PLGA支架材料对骨髓间充质干细胞的粘附性。     

pH响应性PTEN/PLGA-(HE)10-MAP纳米粒的构建及体外评价

构建一种pH响应性细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides,CPPs）修饰的载抑癌基因第10号染色体同源缺失性磷酸酯酶-张力蛋白（PTEN）质粒DNA的纳米粒PTEN/PLGA-（HE）₁₀-MAP,探讨其基因递送和体外靶向抗肿瘤作用。采用双乳化-溶剂挥发法制备载PTEN质粒DNA的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒PTEN/PLGA;利用酰胺缩合反应将pH响应性组氨酸-谷氨酸（HE）重复寡肽与模型两亲性多肽（MAP）的重组体（HE）₁₀-MAP偶联至PLGA纳米粒表面,得到纳米粒PTEN/PLGA-（HE）₁₀-MAP。以粒径、Zeta电位以及包封率与载药量为指标对其进行表征分析;通过考察其细胞毒性、细胞摄取,以及靶向转染真核表达质粒和抗肿瘤细胞增殖的能力,分析其作为目的基因靶向递送系统的可行性。结果显示,制备的纳米粒粒径为（266.5 ± 2.86） nm,包封率为（80.6 ± 6.11）%,在pH 7.4、7.0和6.5条件下Zeta电位分别为-（6.7 ± 0.26） mV、 +（0.7 ± 0.22） mV和+（37.5 ± 0.85） mV;未载质粒DNA的空载体纳米粒PLGA-（HE）₁₀-MAP在肿瘤和正常细胞中的细胞毒性试验显示细胞存活率均在80%以上,制备的纳米粒可以被细胞摄取表达,且具有pH靶向抑制肿瘤细胞增殖的作用,在肿瘤的基因治疗中具有一定的应用前景。     

人脂肪干细胞与聚L-谷氨酸/海藻酸钠可注射水凝胶的生物相容性研究

天然高分子聚合物聚L-谷氨酸(PLGA)与氧化海藻酸钠(OAg)共价交联合成PLGA/OAg水凝胶,将人脂肪来源干细胞(hADSCs)接种于水凝胶内,倒置显微镜、扫描电镜观察细胞在支架中的存活、增殖、黏附情况,DNA定量法检测细胞的增殖。体外证实该水凝胶材料生物相容性良好,具有性能可控性和微创性等优势,对于进一步开发脂肪组织工程材料具有指导性意义。     

Reconstruction of segmental bone defects in the rabbit ulna using periosteum encapsulated mesenchymal stem cells-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) scaffolds

Background  Repair of large bone defects remains a challenge for clinicians. The present study investigated the ability of mesenchymal stem cells (MSCs) and/or periosteum-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) to promote new bone formation within rabbit ulnar segmental bone defects.

Methods  Rabbit bone marrow-derived MSCs (passage 3) were seeded onto porous PLGA scaffolds. Forty segmental bone defects, each 15 mm in length, were created in the rabbit ulna, from which periosteum was obtained. Bone defects were treated with either PLGA alone (group A), PLGA + MSCs (group B), periosteum-wrapped PLGA (group C) or periosteum-wrapped PLGA/MSCs (group D). At 6 and 12 weeks post-surgery, samples were detected by gross observation, radiological examination (X-ray and micro-CT) and histological analyses.

Results  Group D, comprising both periosteum and MSCs, showed better bone quality, higher X-ray scores and a greater amount of bone volume compared with the other three groups at each time point (P <0.05). No significant differences in radiological scores and amount of bone volume were found between groups B and C (P >0.05), both of which were significantly higher than group A (P <0.05). 

Conclusions  Implanted MSCs combined with periosteum have a synergistic effect on segmental bone regeneration and that periosteum plays a critical role in the process. Fabrication of angiogenic and osteogenic cellular constructs or tissue-engineered periosteum will have broad applications in bone tissue engineering.

     

PLGA经多巴胺改性后负载纤连蛋白对MC3T3-E1细胞黏附的影响

目的:建立以聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]为基底,经多巴胺(dopamine,DP)负载纤连蛋白(fibronectin,FN)的材料模型,研究FN对MC3T3-E1细胞黏附的影响。方法:使用红外光谱分析仪,接触角仪和石英晶体损耗检验微量天平测量样品表面基团、膜的亲水性和FN负载量;在磷酸盐缓冲液(PBS)环境中,分别接种MC3T3-E1细胞于各样品,使用延时照相系统每隔3 min观察细胞黏附情况,CCK-8法测量接种细胞后0.5、1.0、4.0、8.0 h黏附细胞的吸光度。结果:红外光谱分析显示DP成功结合于PLGA膜表面,接触角测量表明PLGA膜经DP处理后亲水性改善,石英晶体损耗检验微量天平测得FN的负载量为22.5 ng/cm2,延时照相系统和CCK-8检测结果显示负载FN的PLGA膜上细胞黏附比例和数量显著高于PLGA膜和PLGA的DP涂层膜(P<0.05)。结论:在PBS环境中,MC3T3-E1细胞可在负载FN的PLGA膜上正常黏附。