抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响

【目的】构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒，探讨抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响。【方法】用RT-PCR技术从小鼠脂肪组织扩增抵抗素基因cDNA，A／T克隆于pGEM-T载体，再亚克隆于pcDNA3．1（＋）和pcDNA3．1（-）真核表达载体，构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒pcDNA3．1^（＋）resistin和pcDNA3．1^（-）-resistin^（-）。将pcDNA3．1^（-）resistin^（-）转染小鼠3T3-L1脂肪细胞，通过G418筛选稳定表达的细胞株。3T3-L1脂肪细胞分为对照、瞬时、载体和稳定4个细胞组（每组n=6），用^3H-2-脱氧葡萄糖进行非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取试验。【结果】插入pcDNA3．1^（＋）的DNA片段的核苷酸序列与小鼠抵抗素基因mRNA编码区序列完全一致．且方向正确：插入pcDNA3．10^（＋）的DNA片段的核苷酸序列与抵抗素基因mRNA编码区核苷酸序列完全一致，且方向相反。对照组、瞬时组、载体组和稳定组的3T3-L1脂肪细胞非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取率的无显著性差别（P〉O．05）。【结论】成功构建了载有抵抗素基因和载有抵抗素基因反义核酸的重组真核表达质粒。抵抗素对3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取均无明显影响。     

抵抗素对C2C12肌细胞株葡萄糖代谢的影响

【目的】 抵抗素(resistin)是一种与胰岛素抵抗(IR)密切相关的脂肪细胞因子｡本研究通过观察resistin对C2C12肌细胞株葡萄糖代谢的影响,以探讨resistin在骨骼肌IR发生中的作用｡【方法】构建含resistin基因的重组表达质粒pcDNA3.1-resistin,用于转染C2C12肌细胞株,使其表达resistin,用3H-2-脱氧葡萄糖进行葡萄糖摄取试验,用D-[14C(U)]葡萄糖进行葡萄糖氧化和糖原合成试验,RT-PCR检测肌细胞的葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)mRMA｡ 【结果】 pcDNA3.1-resistin转染的C2C12肌细胞株可表达resistin;resistin使肌细胞胰岛素刺激的葡萄糖摄取率减少约30%,并使GLUT4mRNA 表达降低28%,而对葡萄糖氧化和糖原合成无显著影响｡ 【结论】 resistin可能通过抑制骨骼肌GLUT4mRNA的表达而降低葡萄糖摄取,但对葡萄糖氧化和糖原合成影响较小,提示resistin在骨骼肌IR发生中的作用有限｡     

熊果酸对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型CAP表达的影响

目的：观察熊果酸对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗、摄取及细胞分化的影响,并探讨其作用机制。方法：将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞,用高糖、高胰岛素联合诱导胰岛素抵抗模型。使用葡萄糖氧化酶法检测3T3-L1细胞葡萄糖消耗量,氚标葡萄糖法检测其葡萄糖摄取量,以评价模型建立情况。用四唑盐（methylthiazolyltetrazolium,MTT）比色法检测不同浓度熊果酸对3T3-L1脂肪细胞活力的影响以确定实验药物浓度。加入不同浓度熊果酸分组干预,用氚标葡萄糖法检测脂肪细胞葡萄糖摄取量;用油红O色法检测3T3-L1脂肪细胞分化情况;用实时荧光定量聚合酶链反应法、蛋白质印迹法分别观察熊果酸对3T3-L1细胞胰岛素抵抗模型细胞分化相关蛋白脂肪细胞脂类结合蛋白、基质金属蛋白酶1和原癌基因Cbl相关蛋白（c-Cbl-associatedprotein,CAP）表达的影响。结果：在成功建立胰岛素抵抗模型的基础上,使用MTT法检测细胞活力。确定熊果酸的作用浓度在4～20μmol／L。与模型组相比,低、高剂量熊果酸组（10、20μmol／L）及罗格列酮组（5μmol／L．）葡萄糖摄取均明显升高（P〈0．01）;低、高剂量熊果酸组3T3-L1脂肪细胞分化程度低于对照组和罗格列酮组。熊果酸可明显上调3T3-I,1细胞胰岛素抵抗模型CAPmRNA及蛋白的表达（P〈0．01）。结论：熊果酸改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型糖代谢的同时可抑制其分化,这一机制可能与熊果酸上调脂肪细胞CAP的表达有关。     

麦冬多糖对脂肪细胞胰岛素敏感性的作用机制

【目的】研究麦冬多糖对3T3-L1细胞诱导分化的脂肪细胞胰岛素敏感性作用机制的研究。【方法】将实验分为5组：模型对照组、阳性对照罗格列酮组、麦冬多糖低、中、高剂量组。体外诱导分化3T3-L1细胞为脂肪细胞,ELISA法检测各实验组3T3-L1脂肪细胞上清液中肿瘤坏死因子-α的表达量;RT-PCR法检测各实验组3T3-L1脂肪细胞瘦素、脂联素、抵抗素mRNA的表达水平。【结果】与模型对照组相比：其他实验组肿瘤坏死因子-α表达量降低,且3T3-L1脂肪细胞肿瘤坏死因子-α表达量随着麦冬多糖剂量的增加而降低;瘦素、脂联素mRNA表达升高,且3T3-L1脂肪细胞瘦素、脂联素mRNA表达随着麦冬多糖剂量的增加而增高;抵抗素mRNA的表达量随着麦冬多糖剂量的增加而降低。【结论】麦冬多糖降糖作用的部分机制可能与促进脂肪细胞高表达瘦素、脂联素而抑制TNF-α、抵抗素的表达而增加胰岛素的敏感性有关。     

蒙药“通拉嘎-5”对脂肪细胞葡萄糖摄取的影响及其机制研究

目的探讨"通拉嘎-5"对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响及其作用机制。方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为脂肪细胞后,"通拉嘎-5"作用于3T3-L1脂肪细胞24 h,用3H标记的2-脱氧-葡萄糖([3H]2-DG)示踪检测胰岛素介导的3T3-L1脂肪细胞摄取葡萄糖的情况;"通拉嘎-5"作用3T3-L1脂肪细胞48 h后,用Real-time PCR检测PPARγ和LXRα的基因表达,用Western blot检测PPARγ和LXRα的蛋白表达。结果 "通拉嘎-5"能促进胰岛素介导的3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取(比阴性对照组高1.915倍,P<0.05);能明显上调3T3-L1脂肪细胞和LXRα基因(比阴性对照组高2.895倍,P<0.01)和蛋白(比阴性对照组高1.977倍,P<0.01)表达;而对PPARγ基因和蛋白表达无明显的影响。结论 "通拉嘎-5"可能通过提高3T3-L1脂肪细胞LXRα的基因和蛋白表达,促进胰岛素介导的葡萄糖摄取功能,改善胰岛素抵抗,可能为"通拉嘎-5"治疗非酒精性脂肪肝(NAFLD)的作用机制之一。     

MiRNA-27a对3T3-L1细胞胰岛素抵抗的作用及机制简

目的研究miRNA-27a对3T3-L1细胞葡萄糖摄取的影响,并初步探讨其作用机制。方法通过肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactoralpha,TNF-α）诱导建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的细胞模型,观察miRNA-27a对3T3-L1细胞葡萄糖摄取的影响,酶联免疫吸附（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELlSA）检测细胞培养上清中白细胞介素6（interleukin6,IL-6）的变化,Westernblot检测细胞内总Akt和磷酸化Akt的变化。结果miRNA-27a明显抑制3T3-L1细胞对胰岛素诱导的葡萄糖的摄取,miRNA-27a可促进炎症因子IL-6的产生并抑制Akt的磷酸化。结论miRNA-27a可促进脂肪细胞产生胰岛素抵抗,其作用可能通过抑制胰岛素信号通路P13K／Akt实现。     

肿瘤坏死因子α诱导胰岛素抵抗细胞模型的建立及鉴定

目的：建立胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞模型。方法：培养3T3-L1前脂肪细胞,诱导分化为脂肪细胞,用肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型,用液态闪烁仪测定胰岛素刺激的3 H-2-DG葡萄糖摄取,评价胰岛素抵抗模型。结果：异丁基甲基黄嘌呤、胰岛素和地塞米松能成功诱导3T3-L1细胞成为成熟脂肪细胞,经TNF-α诱导后,胰岛素刺激的3H-2-DG葡萄糖摄取显著降低。结论：T NF-α诱导成熟脂肪细胞产生胰岛素抵抗,从而建立细胞胰岛素抵抗模型。     

Retn基因表达对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响及其机制探讨

目的:观察Resistin蛋白对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响并探讨其引发胰岛素抗性的可能机制.方法:(1)采用放射免疫测定法检测低、正常及高表达Retn基因的3T3-L1脂肪细胞在基础状态及胰岛素刺激下的葡萄糖摄取水平.(2)采用RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR法测定低、正常和高表达Retn基因的3T3-L1脂肪细胞中几种葡萄糖转运信号蛋白,包括胰岛素受体底物1(IRS-1)、磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)、丝/苏氨酸激酶2(AKT-2)、葡萄糖转运子4(GLUT-4)、丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)及糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的表达.结果:(1)在基础状态及胰岛素刺激下,3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取随Retn基因表达的升高而降低.(2)PI-3K和AKT-2两个信号蛋白mRNA的表达随着细胞内Retn基因表达水平的升高而降低;GSK-3β和p38MAPK两个信号蛋白mRNA的表达随着细胞内Retn基因表达水平的升高而升高.结论:(1)Resistin蛋白可以导致脂肪细胞产生胰岛素抗性,其机制可能与胰岛素信号通路中的PI-3K和Ras通路中一些信号蛋白表达的变化有关.     

胰岛素、肿瘤坏死因子α和瘦素对抵抗素表达的影响

[目的]探讨胰岛素、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及瘦素对333-L1脂肪细胞resistin mRNA表达的影响.[方法]诱导3T3-L1前体脂肪细胞分化为脂肪细胞,用不同浓度的胰岛素、TNF-α及瘦素分别处理3T3-L1脂肪细胞24 h,RT-PCR的方法检测3T3-L1脂肪细胞resistin mRNA的表达.[结果]3T3-L1脂肪细胞被0、10、100及500 nmol/L的胰岛素处理后,resistin mRNA表达量分别是0.87±0.11、0.79±0.13、0.39±0.07和0.21±0.06(P<0.05,n=3),10、100及500 nmol/L胰岛素分别使resistin mRNA减少10%、55.2%和75.9%;3T3-L1脂肪细胞分别被0、10、100及500 ng/mL TNF-α处理后,resistin mRNA的表达量分别是0.68±0.12、0.59±0.08、0.25±0.07和0.12±0.04(P<0.05,n=3),10、100及500 ng/mLTNF-α分别使resistin mRNA减少13.1%、63.1%和82.4%;③3T3-L1脂肪细胞被0、10、100及500 ng/mL瘦素分别处理后,resistin mRNA表达量分别为0.73±0.11、0.79±0.16、0.69±0.08和0.70±0.09(P>0.05,n:3).[结论]胰岛素和TNF-α抑制3T3-L1脂肪细胞resistin mRNA表达,且抑制效应与剂量呈依赖关系,而瘦素对3T3-L1脂肪细胞resistin mRNA表达无明显影响.     

SMAF1基因的异位过表达对脂肪细胞3T3-L1增殖和凋亡的影响

目的观察一脂肪细胞特异性表达的新基因小脂肪细胞因子1（SMAF1）在小鼠脂肪前体细胞3T3-L1中的异位表达对脂肪细胞增殖和凋亡的影响。方法构建小鼠SMAF1真核表达载体并稳定转染3T3-L1脂肪前体细胞以获得永久异位表达SMAF1基因的细胞株,使用Westernblot证实SMAFl基因的表达。体外培养SMAF13T3-L1脂肪细胞,以MTT法检测SMAF13T3-L1脂肪细胞的增殖;用流式细胞仪对SMAFl3T3-L1脂肪细胞进行凋亡分析。结果与对照相比,SMAF13T3-L1脂肪细胞增殖明显降低,差异有统计学意义（P〈0．05）;而SMAF13T3-L1脂肪细胞凋亡分析结果与对照无显著性差异。结论SMAFl基因在3T3-L1中的异位性表达,对3T3L1前体脂肪细胞生长增殖有显著的抑制作用,而对细胞凋亡无影响,提示SMAF1在脂肪细胞增殖分化中发挥一定的作用。     

14-3-3基因真核表达载体的构建

目的克隆人14-3-3基因并构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3。方法从胎脑组织中提取总RNA,用RT-PCR方法获得人14-3-3基因的全长cDNA,将其插入pCUm-T载体中;序列测定后,重组携带14-3-3基因的表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3。结果经限制性内切酶酶切分析、PCR和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。结论成功构建了14-3-3真核表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3,为进一步研究14-3-3在帕金森病中的作用奠定了良好的基础。     

MAGE-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建MAGE-1基因重组真核表达质粒并在细胞系NIH-3T3中高效表达。方法用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌（HCC）组织全RNA中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）,构建pcDNA3．1-MAGE-1重组质粒．重组质耗用脂质体转染NIH-3T3细胞,经RT-PCR和Western-blot鉴定转化细胞中MAGE-1的表达。结果RT-PCR获得长度为927bp的MAGE-1基因,经T载体和pcDNA3．1（＋）真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实重组质粒构建正确,并存转化细胞中检测到了MAGE-1的表达。结论 真核表达质粒pcDNA3．1-MAGE-1构建成功,并建立了稳定表达人MAGE-1的NIH-3T3细胞株。     

Cyclin D3正、反义表达质粒在淋巴瘤细胞系Raji中的转染与鉴定

目的 :构建人类cyclinD3正义和反义真核表达质粒 ,分别转染到淋巴瘤细胞系Raji细胞中 ,为探讨cyclinD3基因对淋巴瘤细胞生物学行为的影响提供研究基础。方法 :以Raji细胞总RNA为模板 ,通过RT -PCR获取cyclinD3全长cDNA ,克隆入 pGEM -T载体 ,再亚克隆到真核表达载体pcDNA3 .1中 ,构成含cyclinD3的表达质粒 pcD NA3 -cyclinD3。再运用DNA重组技术将cyclinD3基因反向克隆到pcDNA3 .1中 ,构建成cyclinD3反义表达质粒pcDNA3 -ascyclinD3。用脂质体介导的基因转染方法 ,将cyclinD3正、反义表达质粒和空质粒分别导入Raji细胞 ,经G418筛选建立稳定转染细胞株 ,用WesternBlot方法鉴定cyclinD3基因的表达。结果 :酶切鉴定和测序分析证实 ,实验成功构建了cyclinD3正、反义表达质粒。与转染cyclinD3正义表达质粒和空质粒的细胞相比 ,转染cyclinD3反义表达质粒的Raji细胞中cyclinD3表达水平下降。 结论 :正、反义cyclinD3在淋巴瘤细胞中的转染和表达 ,为进一步研究cyclinD3在淋巴瘤细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡中的作用奠定了基础     

携带FLAG标签的人BTG2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达 

目的：构建人B细胞易位基因2（BTG2）真核表达载体,并在HeLa细胞中表达携带FLAG标签的BTG2蛋白,为阐明BTG2基因的功能提供实验工具。方法：利用PCR法获得全长BTG2片段,将扩增得到的片段插入真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点;然后按照FLAG序列设计并合成寡核苷酸片段,插入pcDNA3.1(+)-BTG2载体,构建pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2载体;将以上重组质粒转染HeLa细胞,将细胞分为转染pcDNA3.1(+)空载体组、转染pcDNA3.1(+)-BTG2组和转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组,采用抗FLAG抗体的Western blotting法,检测FLAG-BTG2融合蛋白在HeLa细胞中的表达水平。结果：将全长BTG2片段链接于pcDNA3.1(+)质粒,经限制性核酸内切酶BamH Ⅰ酶切分析及DNA测序证实载体序列准确;该载体转染HeLa细胞后用抗FLAG 抗体进行Western blotting法检测,在空载体组和pcDNA3.1(+)-BTG2组HeLa细胞中检测不到FLAG融合蛋白的表达,而在转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组中检测到FLAG-BTG2融合蛋白的表达。结论：成功构建了pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2真核表达载体,并能在HeLa细胞中有效表达携带FLAG标签的BTG2蛋白。     

人大肠癌线粒体DNA重组质粒的构建及对NIH3T3细胞的转染

目的: 构建pcDNA3. 1( )-mtDNA真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞.方法: 提取大肠癌细胞株(SW480,Lovo,HT29)mtDNA,扩增D-loop区,产物用DNA自动测序法进行序列分析.利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3. 1( ),并用脂质体法导入NIH3T3细胞.结果: 大肠癌细胞株SW480,Lovo,HT29细胞mtDNA D-loop分别有10,9,8个突变位点.成功克隆1119 kb的mtDNA D-loop区至表达质粒pcDNA3. 1( ),并导入NIH3T3细胞中.结论: 成功构建了pcDNA3. 1( )-mtDNA真核表达重组体,并成功导入NIH3T3细胞中.     

IκBα突变体的真核表达载体构建及表达

目的:构建NF-κB的抑制蛋白IκBα突变体(IκBαM)的真核表达载体,检测其在内皮细胞中的表达。方法:从克隆质粒pSP64TL-IκBαM中用限制性内切酶双酶切IκBαM cDNA片段,克隆到真核表达质粒pcDNA 3.1/myc-His A内构建pcDNA 3.1/myc-His A-IκBαM质粒,并酶切鉴定及测序分析。以脂质体法转染内皮细胞,观察其表达及活性。结果:pcDNA 3.1/myc-His A-IκBαM质粒含有大小正确的IκBαM cDNA碱基片段,其碱基序列为编码目的基因的正确序列。pcDNA 3.1/myc-His A-IκBαM质粒能在内皮细胞中表达,并抑制IL-6分泌。结论:真核表达质粒pcDNA 3.1/myc-His A-IκBαM构建成功,IκBαM蛋白在内皮细胞中表达,并具有良好的生物学活性。     

pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP真核表达质粒构建

目的:构建pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP与pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP真核表达质粒,并观察pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒在MCF-7和Bcap-37细胞中的表达。方法:①采用RT-PCR技术扩增CYP19 cDNA,插入pcDNA3.1(+)载体中,构建pcDNA3.1(+)-CYP19表达质粒;酶切pcDNA3.1(+)-CYP19(304bp BamHⅠ)-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19质粒,构建pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP表达质粒;②以pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒为模板,采用定点突变技术,构建pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP及pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP表达质粒;③pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒通过脂质体介导转染MCF-7和Bcap-37细胞,荧光显微镜观察其在细胞中的表达。...     

反义人DNMT1基因对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖和细胞周期的影响

目的 构建表达人DNMT1基因(DNA methyltransferase 1,DNMT1)反义RNA的真核表达质粒,观察其对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖的影响.方法 应用DNA重组技术,将人DNMT1基因的cDNA片段克隆至pcDNA3.1(-)载体中,构建DNMTl反义RNA真核表达质粒,测序验证,将其转染人人乳腺癌细胞系中,利用荧光定量PCR法检测转染前后细胞DN-MT1基因mRNA表达水平的变化;Western blot检测转染后DNMT1蛋白表达变化;应用MTT法检测细胞生长状况,绘制细胞生长曲线;流式细胞术分析细胞周期的变化.结果 成功构建出能够表达DNMT1反义RNA的真核表达质粒.转染该质粒后,与未转染组和转染正义质粒组相比,MDA-MB-435s细胞中DNMT1基因mRNA和DNMT1蛋白表达量均显著下降;细胞生长变慢;细胞周期分析可见S期明显减少,而G1/G0期细胞显著增加.结论 反义DNMT1能够特异性下调该基因的表达,并抑制乳腺癌细胞的增殖,为乳腺癌基因治疗提供了新的靶标.     

Granulysin真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出颗粒溶解素蛋白cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的相应酶切位点,将此重组质粒进行序列测定,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。结果:重组质粒插入基因序列测定证实为颗粒溶解素cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。结论:成功构建颗粒溶解素真核表达载体,为进一步研究其抗结核作用奠定了基础。