基因重组人血红蛋白的纯化

目的 :探索重组人血红蛋白的纯化方法。方法 :将α、β珠蛋白串联基因克隆进 pBV2 2 0表达载体 ,获得了高效表达 ,表达产物达细菌总蛋白的 2 0 %左右。该表达产物以包涵体形式存在 ,包涵体经洗涤后 ,用 8mol/L尿素溶解 ,先用Q SepharoseFastFlow阴离子交换纯化后 ,又经Sephacryl 10 0凝胶过滤纯化。 结果 :经两步纯化后重组人血红蛋白的纯度达 90 %左右。纯化产物经复性 ,具有与氧结合的能力。结论 :成功地得到人重组血红蛋白的纯化方法     

CTB-Aβ42融合蛋白的原核表达条件优化及鉴定

目的探索融合基因CTB-Aβ42在大肠杆菌中表达的最适条件,并纯化得融合蛋白。方法设置不同的诱导温度、诱导时间、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度,在大肠杆菌中表达融合基因CTB-Aβ42,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定表达产物,GST亲和色谱柱纯化目的蛋白,Western blot鉴定目的蛋白免疫原性。结果 SDS-PAGE结果显示,GST-CTB-Aβ42融合蛋白分子质量约为45 kD,与预期结果一致;Western blot结果表明,纯化得到的目的蛋白具有免疫原性。在诱导条件为30℃,0.1 mmol/L IPTG诱导2 h表达的可溶性蛋白所占比例最高;在37℃,0.1mmol/L IPTG诱导4 h表达的融合蛋白总量最高,小部分可溶性表达,大部分以包涵体的形式存在。结论本实验对CTB-Aβ42融合蛋白的原核表达条件进行了优化,经GST亲和色谱柱纯化获得具有免疫原性的融合蛋白。     

一个通用的TNFHis温度诱导融合表达载体的构建

以pBVTNF为起始质粒,设计合成了2个DNA片段一个含有起始码、TNF起始码后的2个氨基酸序列和6个组氨酸序列;另一个含有Thrombin和hydroxylamine裂解位点序列.将上述2个合成DNA片段分别与pBVTNF载体重组,获得了一个通用的TNFHis表达载体.在该表达载体中,含有6×His的纯化标签和Thrombin和hydroxylamine融合蛋白裂解位点.分别将IFN﹑ IL-11和TNF基因插入该表达载体的多克隆位点,42℃诱导表达后,经SDS-PAGE分析,结果表明,所有插入基因都获得了较高水平的表达.薄层扫描结果证实,所有融合表达蛋白的表达量均占菌体总蛋白的20%以上.Western blot 检测显示,所有融合表达蛋白均可与抗TNF-α单抗发生免疫反应,间接证明融合蛋白均获得了表达.TNFHisTNF和TNFHisIFN在温度诱导表达后,菌体裂解液经Ni-NTA Agarose Beads亲和柱纯化,纯化结果表明,TNFHis中的6×His序列可与Ni-NTA Agarose Beads结合.此种纯化方式为融合表达蛋白的分离纯化提供了方便.     

重组TGF β1在大肠杆菌中的表达、纯化

目的通过pET 43.1原核表达载体,表达重组人转化生长因子β1(human transform growth fac-tor,rhTGFβ1)。方法将人工整合了肠激酶作用位点的TGFβ1,插入到含有NusA蛋白的融合表达载体pET 43.1中。重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21(+)并用IPTG诱导表达。通过镍柱纯化重组蛋白,用Western blot杂交检测重组蛋白的免疫原性,用肠激酶酶切得到TGFβ1单体。结果 SDS-PAGE结果显示,相对分子质量约为70 000的融合蛋白大部分在上清中表达,目的融合蛋白量约占菌体总蛋白量的80%。取超声上清,通过His亲和色谱系统纯化目的融合蛋白,纯度质量分数为95%。肠激酶切割得到TGFβ1单体,经Western blot检测重组蛋白的免疫原性。结论人转化生长因子β1在大肠杆菌中实现了高效表达,获得了具有免疫原性的重组TGFβ1。     

人TNFβ缺失体融鸽主其产物一步纯化法研究

本文交ｈＴＮＦβＮ端缺失２３ａａ的缺失体基因克隆于ｐＥＴ－２８－Ｃ＾（＋）表达戴本,构建成Ｔ７ｌａｃ启动子控制下Ｈｉｓ６－ＴＮＦβ融合表达质粒,转化到Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）,经ＩＰＴＧ诱导表达,Ｈｉｓ６－ＴＮＦβ表达量约占总菌体蛋白的２５％,Ｍｒ２０５００。表达产物大部分以包涵体形式存在。包涵体经过洗涤,７０ｍｏｌ／Ｌ脲变性溶解,用Ｍｉ＾２＋亲和层析一步快速纯化,所得Ｈｉｓ６－ＴＮＦβ的纯     

突变型(α99,β82位Lys-Cys)人重组血红蛋白的纯化

将基因突变型（α９９,β８２位Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）血红蛋白在ｐＢＶ２２０载体中诱导表达,表达产物达细菌总蛋白的２０％左右。该表达产物以包涵体形式存在,包涵体经洗涤后,用８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解,先用Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ阴离子交换纯化,再经Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ－１００凝胶过滤纯化。纯化产物经复性,具有与氧结合的能力。     

重组人血管内皮抑素的阳离子交换色谱复性与纯化条件研究

对rhEndostatin包涵体蛋白的色谱复性条件进行研究,摸索出最佳的复性、纯化条件,解决其在大肠杆菌中表达提取时遇到的蛋白变性问题。按实验条件对表达的rhEndostatin包涵体蛋白进行提取、洗涤、变性;利用正交法设计重组蛋白的色谱复性、纯化实验;利用SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱对rhEndostatin包涵体蛋白进行了色谱复性、纯化。最佳复性条件为rhEndostatin上样浓度为2.5 mg/mL,洗脱体积流量为1/20床体积/min(3.5 mL/min),NaCl浓度0.1 mol/L,GSH/GSSG的浓度比为3/0.3 mmol/L。在此条件下纯度约97%,蛋白回收率为90%,重组蛋白的活性最高,IC50达到5μg/mL。     

融合MBP标签的重组人CD137L蛋白可溶性表达与纯化

本课题组前期构建了偶联有肿瘤抑素T7肽和人CD137L胞外域的重组融合蛋白(rhTCD),兼具抑制血管生成和刺激T细胞激活活性,但其在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在。本研究将rhTCD与麦芽糖结合蛋白(Maltose-binding protein, MBP)的基因融合共表达,以提高其可溶性表达并进行纯化。构建N端带有组氨酸(6×His)和MBP双标签的rhTCD重组表达载体,将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)后在18℃0.5 mmol/L IPTG条件下诱导表达18 h,经Ni-NTA亲和层析法初步纯化后烟草蚀纹病毒蛋白酶(Tobacco etch virus, TEV)切割标签,再应用MBP亲和层析法纯化目的蛋白,通过银染和非变性凝胶电泳检测蛋白纯度、存在形式以及产量。SDS-PAGE电泳结果显示,融合His-MBP标签后目的蛋白rhTCD的可溶性表达量显著提高,以92.64%±4.24%的可溶性水平表达于上清中。Ni-NTA亲和层析纯化后,TEV蛋白酶高效切除了His-MBP标签。经MBP亲和层析纯化后,SDS-PAGE银染显示目的蛋白rhTCD纯度约为82.60%±0.63...     

海蛇丝氨酸蛋白酶Harobin的原核表达及其活性测定

本文利用原核系统表达海蛇丝氨酸蛋白酶Harobin,并纯化和鉴定其活性。首先PCR法从模板分别扩增SUMO以及Harobin基因,再重叠PCR方法获得SUMO-Harobin融合基因,经NdeI、BamHI双酶切后,连入pET3C质粒,构建pET3C-SUMO/Harobin重组质粒。重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导菌体表达,收集菌体分析发现大部分目的蛋白为包涵体。将获得的包涵体经尿素变性,用Ni-NTA亲和层析后,梯度透析复性融合蛋白。复性好的蛋白用Benzamidin Sepharose亲和层析纯化,得到高纯度的融合蛋白。进一步采用降解纤维蛋白原法测定融合蛋白活性。结果成功构建了pET3C-SUMO/Harobin重组载体,融合蛋白Harobin在原核系统中是以包涵体的形式存在。融合蛋白经过变性复性,并结合两步纯化法获得了90%纯度的融合蛋白;经过测定纤维蛋白原降解能力,显示融合蛋白具有降解纤维蛋白原的活性。     

脂多糖应激新分子融合蛋白的高表达及纯化

目的在原核表达系统中表达脂多糖应激新分子编码的蛋白质。方法PCR扩增HlrgcDNA编码区,克隆入表达载体pcTAT中,构建成融合6His的表达载体pcTAT-lrg,转化E.coli BL21(DE3),以IPTG诱导。表达产物用SDS-PAGE及凝胶光密度扫描分析,用Ni-NTA亲和层析柱纯化。结果经过IPTG诱导4 h,表达出相对分子质量(Mr)约25 000的蛋白,占菌体总蛋白的51%。表达产物为可溶性的,用Ni-NTA亲和层析柱纯化的表达蛋白达到电泳纯。加入培养液中的纯化蛋白,可在30 min内进入HEK293细胞。结论在E.coli中成功地高表达人Lrg融合蛋白,并对其进行初步纯化,为人Lrg功能的研究打下基础。     

天蚕素A截短肽在大肠埃希菌中的高效表达及活性分析

将构建好的含抗菌肽天蚕素A(cecropin A,CA)截短肽CA19(36、210)1～5倍串连体的pET-31b(+)载体进行诱导表达,其表达量比单体表达明显提高.将融合蛋白用亲和层析法将其纯化,其纯度达到90%以上.纯化融合蛋白免疫BALB/c小鼠,制备了其特异的多克隆抗体.纯化串连融合蛋白用溴化氰切割成单体检测其活性,发现均具有抑菌活性.本研究为抗菌肽的基因工程制备提供了新途径.     

阿尔采末病Aβ多肽基因的高效表达及纯化研究

目的　通过对Aβ多肽基因进行重组克隆 ,构建质粒和高效表达的菌株 ,并研究表达产物快速高效的纯化回收方法。方法　采用IMPACT TWIN表达系统构建Intein Aβ重组基因表达质粒 ,将该质粒转化至BL2 1(DE3) ,筛选高效表达菌株 ;表达产物经ChitinBeads亲和层析柱分离纯化 ;SDS PAGE电泳 ,毛细管区带电泳及免疫印迹法等鉴定。结果　重组的Intein Aβ基因在BL2 1中获得高效表达 ,筛选出稳定高效表达的BL2 1(DE3)细胞株 ;融合蛋白表达量可达全菌蛋白的 6 0 % ;表达产物经ChitinBeads亲和层析纯化后 ,其纯度可达 98%以上 ,并具有与Aβ多肽相同的分子量及免疫学活性。结论　Aβ多肽基因在IMPACT TWIN系统中可获得高效表达 ,利用ChitinBeads亲和层析方法可将表达的Aβ多肽进行快速、简便、无酶化的高效分离纯化。     

新型抗菌蛋白天蚕素-人溶菌酶在大肠杆菌中的表达条件优化及纯化

目的探讨重组家蝇天蚕素-人溶菌酶(Mdc-hly)在大肠杆菌中的表达条件及纯化。方法利用SDS-PAGE电泳和BandScan凝胶电泳图像分析系统研究诱导温度、诱导时机、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度和诱导时间对融合蛋白表达的影响。融合蛋白经His琼脂糖柱亲和色谱纯化后,Western blot鉴定。结果在起始菌浓度为A600=0.6时加入浓度为1.0 mmol/L的IPTG,37℃诱导6 h,融合蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的39.1%。纯化后融合蛋白纯度可达95%,Western blot鉴定为目的蛋白。结论确定了重组融合蛋白的最佳表达条件,并纯化了目的蛋白。     

(His)6-Arg-Arg-人胰岛素原在大肠杆菌中的高效表达

为了提高胰岛素原的表达量，用pQE-40质粒构建了(His)6-Arg-Arg-人胰岛素原[(His)6-Arg-Arg- human Proinsulin，RRhPI]的大肠杆菌表达系统。通过培养条件的优化，在摇瓶培养的条件下，目标产物：RRhPI以包涵体形式获得了高效表达，每升培养基收获湿菌体约27g，包涵体6g(干重1．8g)，RRhPI约540mg。该水平已超过现有文献报道的摇瓶培养的最高水平。     

APPβ分泌酶切割位点特异性单链抗体的制备和鉴定

目的制备针对人淀粉样蛋白前体(APP)β分泌酶切割位点的特异性单链抗体(ScFv),并进行鉴定。方法设计扩增单克隆抗体细胞株重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗人APPβ分泌酶切割位点单克隆抗体细胞株中扩增出VH和VL基因片段,然后通过重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成ScFv基因片段,再将其亚克隆入原核表达载体pET-28a中,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,目的蛋白经镍柱纯化和复性后,用SDS-PAGE、ELISA和Western blot等方法对其检测分析。结果成功从一株抗人APPβ位点单克隆抗体细胞株2H10中扩增出VH和VL并拼接成ScFv片段,片段长744 bp,编码248个氨基酸。PCR、酶切和测序表明表达载体构建成功,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导可以表达出约29 ku的目的蛋白,主要为包涵体形式,经镍柱纯化和复性后,获得纯度达90%以上的ScFv蛋白,ELISA和Western blot检测表明可溶性ScFv可以与人APPβ分泌酶切割位点序列短肽和全长APP结合。结论成功构建并表达人APPβ分泌酶切割位点的特异性单链抗体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。     

超抗原VEGF-SEA融合基因的克隆与表达

目的:构建血管内皮生长因子-葡萄球菌肠毒素A(VEGF-SEA)基因的原核表达质粒,获得VEGF-SEA融合蛋白。方法:制备VEGF-SEA基因片段,插入pET40b构建重组质粒pET40b-VEGF-SEA,经序列分析正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达蛋白。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达蛋白的相对分子质量及表达形式,并对产物采用His·Bind Buffer kit试剂盒纯化。结果:获得VEGF-SEA基因片段长1130bp,经序列分析与预期完全一致,其表达出目的蛋白的大小约为66.2ku,以包涵体形式表达,经纯化,纯度达到90%以上。结论:表达载体pET40b-VEGF-SEA构建成功,VEGF-SEA融合蛋白获得高效表达,本实验为进一步研究VEGF-SEA蛋白的活性及其功能,探讨超抗原抑制肿瘤生长作用奠定了基础。     

重组人源白介素-1β发酵条件的优化及其产品的纯化

目的初步建立重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母的培养体系;进一步优化大规模培养重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母的条件;探讨大规模纯化重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母表达产物的条件;鉴定酵母表达产物及纯化样品。方法在菌体湿重达190g.L-1左右时开始甲醇诱导表达;选用了SP Sepharose XL阳离子交换层析和反相疏水柱层析进行纯化。结果在pH4.5的含0.5%蛋白胨的FM21培养基中发酵时,放罐时间在30h较为适宜;经过纯化蛋白纯度即可达95%以上。结论最终经过鉴定,表达和纯化的样品就是我们想要得到的IL-1β。     

侵袭性大肠埃希菌IpaC的表达和纯化与检验学研究

目的研究分析侵袭性大肠埃希茵的发病机制,表达和纯化侵袭性大肠埃希茵毒力蛋白IpaC与临床意义。方法将含有ipaC基因的pET32a-ipaC表达质粒载体转化大肠杆菌BL21(λDE3),在异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导下表达,对诱导后的表达产物进行SDS-PAGE鉴定,并采用QIAexpressionitsTM蛋白纯化系统纯化目的蛋白。结果诱导后的表达产物经SDS-PAGE发现有一相对分子量约为63 kD的条带,其含量约占总蛋白量的13%,对目的蛋白进行纯化后发现,以400 mmol/L咪唑洗脱液洗脱时效果最为理想,纯度可达90%以上。结论 pET32a-ipaC重组表达质粒转化大肠杆菌B121(λDE3),可稳定、高效地表达目的蛋白;QIAexpressionistTM蛋白纯化系统是一种简便、高效的纯化系统,可获得高纯度的目的蛋白。     

心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)原核表达、纯化及多克隆抗体制备研究

目的构建H-FABP高效原核表达载体,并实现H-FABP的高效原核表达、纯化及多克隆抗体的制备。方法通过RT-PCR扩增人H-FABP的基因序列,将目的基因克隆入质粒pET28a构建原核表达重组质粒pET28a-H-FABP。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导H-FABP的表达,采用Q Sepharose F.F.阴离子层析柱等方法建立H-FABP的纯化工艺。用免疫胶体金法和Western blot鉴定纯化后重组蛋白免疫特异性,用重组表达蛋白制备兔抗H-FABP多克隆抗体。结果成功构建人H-FABP重组蛋白原核表达载体,重组蛋白以包涵体形式表达,其相对分子质量为15kD,与预期一致。亲和层析纯化产物的SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明获得纯度>95%的目的重组蛋白。制备的抗H-FABP多克隆抗体的抗血清ELISA效价可达1∶512000。结论本研究在原核系统中成功表达了H-FABP重组蛋白,并制备多克隆抗体,为H-FABP的结构和功能研究及开发临床诊断试剂盒打下了基础。     

重组人白细胞介素-6包涵体精制工艺研究

目的 建立重组人白细胞介素-6(recombinant human interleukin-6,rhIL-6)包涵体精制工艺,获取高纯度的包涵体蛋白.方法 采用超声破碎法和生物酶解法破碎细胞;摸索洗涤缓冲液中尿素的适当浓度,经多次洗涤获取高纯度的包涵体蛋白.结果 成功建立了rhIL-6包涵体蛋白的精制工艺,其中尿素浓度为2.0 mol/L,溶菌酶浓度达到0.8 mg/g菌体.包涵体蛋白洗涤后纯度达到90%以上.结论 建立合理的精制工艺,包涵体蛋白纯度达到90%以上.