多房棘球绦虫pBCG-Em14-3-3重组质粒的构建及其在BCG中的表达

目的构建多房棘球绦虫重组质粒pBCG-Em14-3-3,并转化BCG进行表达。方法超声粉碎泡球蚴组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增Em14-3-3抗原编码基因;将该扩增产物定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG,构建重组质粒pBCG-Em14-3-3;电穿孔法转化BCG,构建多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3。免疫印迹分析pBCG-Em14-3-3的表达产物。结果RT-PCR成功扩增出779bp的Em14-3-3抗原编码基因;双酶切证实Em14-3-3抗原编码基因成功插入pBCG中;PCR证实rBCG-Em14-3-3构建成功;免疫印迹分析发现pBCG-Em14-3-3的表达产物在相对分子质量(Mr)约为27×103处有明显的目的蛋白表达条带,且能被活动性泡球蚴病鼠血清特异识别。结论成功构建了多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3。     

多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗构建及其表达效率

目的构建多房棘球绦虫(Em)重组卡介苗(BCG-EmⅡ/3)疫苗,分析EmⅡ/3分子在该疫苗中的表达效率。方法超声粉碎泡球蚴组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增EmⅡ/3的抗原编码基因；将该基因定向克隆到大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG,构建重组质粒pBCG-EmⅡ/3；电穿孔法转化BCG,构建多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗。免疫印迹分析重组BCG-EmⅡ/3疫苗的表达产物。结果RT-PCR成功扩增出1 680 bp的EmⅡ/3抗原编码基因；双酶切证实EmⅡ/3抗原编码基因成功插入pBCG中；PCR证实rBCG-EmⅡ/3疫苗构建成功：免疫印迹分析发现重组BCG-EmⅡ/3疫苗的表达产物在相对分子质量(Mr)约为65×10~3处有明显的目的蛋白表达条带,且能被活动性泡球蚴病鼠血清特异识别。结论成功构建了多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗,为疫苗的开发和利用打下了坚实的理论基础。     

多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗的构建及鉴定

目的构建和鉴定多房棘球绦虫(Em)重组双歧杆菌(Bb)-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗。方法通过PCR扩增EmⅡ/3和Em14-3-3抗原编码基因,然后采用基因拼接法(geneSOEing)剪接EmⅡ/3和Em14-3-3,得到EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因;将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3;用电穿孔法将该质粒导入Bb,构建多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗。结果PCR成功扩增出2554bp的EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因;双酶切证实EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗构建成功。结论成功构建了多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗,为该疫苗的开发和利用打下了坚实的实验基础。     

多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗对小鼠脾细胞凋亡的影响

目的检测多房棘球绦虫重组双歧杆菌(Bb)-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗对原头蚴攻击小鼠脾细胞凋亡的影响。方法用重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗分别通过皮下注射、肌肉注射、鼻腔粘膜接种以及口服接种免疫BALB/c小鼠12周后,用50个多房棘球绦虫原头蚴腹腔注射进行攻击,攻击感染后18周剖杀小鼠,检获泡球蚴组织,称取重量,计算减蚴率;分离脾细胞,用ConA刺激培养16~18h,然后用流式细胞仪检测脾细胞凋亡。结果疫苗免疫组小鼠检获泡球蚴质量均明显低于PBS对照组;小鼠脾细胞原液组和ConA刺激组细胞凋亡发生率均显著低于PBS对照组(P<0.05或P<0.01),每个ConA刺激组脾细胞凋亡发生率显著高于相应的原液组(P<0.05或P<0.01),皮下注射组脾细胞凋亡发生率最低。结论多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗可抑制感染小鼠脾细胞发生凋亡,增加CD4+T细胞亚群的数量,诱导宿主产生一定的保护力,对抗Em原头节攻击。     

多房棘球绦虫重组质粒pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3在大肠埃希菌BL21(DE3)表达效率的研究

目的研究多房棘球绦虫(Em)重组质粒pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达效率。方法通过PCR扩增EmⅡ/3和Em14-3-3抗原编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)剪接EmⅡ/3和Em14-3-3,得到EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因;将该融合基因定向克隆于含有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因的高效原核表达载体pGEX-1λT,经酶切鉴定后以IPTG诱导表达EmⅡ/3-Em14-3-3/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定。结果PCR成功扩增出2 554 bp的EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因;双酶切证实EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因插入pGEX-1λT中,成功构建了pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3重组质粒;SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒转化宿主菌在IPTG诱导下高效表达了能被活动性泡球蚴病鼠血清识别的EmⅡ/3-Em14-3-3/GST融合蛋白,分子质量单位119 ku。结论多房棘球绦虫EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因在大肠埃希菌中获得了高效融合表达,表达出的EmⅡ/3-Em14-3-3重组蛋白具有特异的抗原性。     

多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗对小鼠脾细胞凋亡的影响

目的检测多房棘球绦虫(Em)重组BCG-Em14-3-3疫苗对原头蚴攻击小鼠脾细胞凋亡的影响。方法用重组BCG-Em14-3-3疫苗免疫Balb/c小鼠8周后,用50个多房棘球绦虫原头蚴腹腔注射进行攻击,攻击感染后18周剖杀小鼠,分离脾细胞,用刀豆素A(ConA)刺激培养16～18h,然后用Annexin V-FITC染色法检测脾细胞凋亡。结果小鼠脾细胞原液组和ConA刺激组细胞凋亡发生率均显著低于磷酸缓冲液(PBS)对照组(P<0.05或<0.01);鼻腔黏膜接种组脾细胞凋亡率显著低于皮下注射组(P<0.01);重组BCG疫苗组脾细胞凋亡率显著低于pCD-Em10 DNA疫苗肌肉注射组(P<0.01)。结论多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗可抑制感染鼠脾细胞发生凋亡,增加CD4~ T细胞亚群的数量,加强宿主抗多房棘球绦虫感染的保护性免疫反应。     

多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗诱导小鼠脾细胞凋亡的研究

目的探讨多房棘球绦虫（Em）重组卡介苗（BCG—EmⅡ／3）疫苗免疫对Em原头节攻击小鼠脾细胞凋亡的影响。方法Balb／c小鼠随机分为疫苗皮下注射组、鼻腔接种组、空载体对照组、卡介苗（BCG）对照组和PBS对照组。免疫8周时用Em原头节攻击感染，感染后18周剖杀小鼠，计算减蚴率；取脾分离脾细胞，流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率。结果与PBS对照组相比，疫苗皮下注射组和鼻腔内接种组小鼠检获泡球蚴质量均降低（q=2．65、3．68，P〈0．05或P〈0．01），疫苗鼻腔内接种组与皮下注射组比较，检获泡球蚴质量明显降低（q=2．78，P〈0．05），疫苗接种组的减蚴率为63．23％-74．70％；疫苗接种组的脾细胞凋亡发生率明显低于PBS对照组（P〈0．01）；皮下注射组的脾细胞凋亡发生率明显低于鼻腔内接种组（P〈0．01）。结论泡球蚴感染可引起小鼠脾细胞发生凋亡，多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ／3疫苗接种可抑制感染鼠脾细胞凋亡。     

多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗诱导BALB/c小鼠的保护力观察

目的 探讨多房棘球绦虫(Em)重组BCG-Em14-3-3疫苗免疫后对受攻击感染BALB/c小鼠的囊重和抗体及其亚类的影响. 方法 将5×106克隆形成单位(CFU)和5×105CFU疫苗分别采用皮下注射和鼻腔内接种免疫BALB/c鼠1次,免疫后8周每鼠用50个Em原头节攻击感染,感染后18周剖杀小鼠,分离泡球蚴并称重,计算囊重抑制率;收集鼻腔内接种组鼠血清,测定IgG及其亚类和IgE水平.试验设有空载体、卡介苗(BCG)和磷酸盐缓冲液(PBS)对照组. 结果 疫苗皮下注射和鼻腔内接种组小鼠的囊重抑制率分别为82.35%和59.41%;疫苗鼻腔内接种组攻击后18周的鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b和IgE水平均较接种前高(P＜0.05或P＜0.01),吸光度(A490)值分别为0.090±0.006、0.026±0.002、0.024±0.003和0.031±0.019,IgG1和IgG3水平低于接种前(P＜0.05或P＜0.01),A490值分别为0.042±0.011和0.156±0.004. 结论 多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗可诱导小鼠产生较强的保护力,表现为血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgE水平升高和棘球蚴生长受抑制.     

多房棘球绦虫Em14-3-3抗原编码基因研究进展

本文介绍了多房棘球绦虫Em14-3-3蛋白，并对Em14-3-3抗原编码基因的研究进展进行了综述。     

细粒棘球蚴重组14-3-3基因的表达、纯化及免疫学鉴定

目的 构建细粒棘球蚴14-3—3基因的重组质粒并原核表达、纯化该重组蛋白，对其免疫学特性进行初步鉴定。方法 从重组质粒pGEM—T／Eg14-3—3中获取14—3—3基因，亚克隆于表达载体pET28a构建基因丁程菌株，并表达、纯化重组蛋白，经Westernblot、ELISA对该蛋白的免疫学特性进行初步研究。结果 成功构建含目的片段14—33的基因工程菌株；ELISA检测显示，用表达、纯化的重组蛋白免疫小鼠，诱导产生了特异性抗体，Westernblot鉴定该抗体能识别重组抗原及原头蚴、囊液、囊壁抗原。结论构建的pET28a／Eg14—3—3菌株能高效表达14—3—3蛋白，初步鉴定该重组蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3疫苗免疫保护性的观察

目的　研究日本血吸虫(中国大陆株)重组信号蛋白1433(rSj1433)作为血吸虫病疫苗分子的潜能,并探讨rSj1433、rSjGST两种重组蛋白作为疫苗的协同作用及结核杆菌低分子量耐热多肽(Mtb)激活的γδT细胞在抗血吸虫病中的作用。　方法　用SDSPAGE、电洗脱和透析的方法制备rSj1433和rSjGST抗原,将两种抗原(分别用福氏佐剂和Mtb为佐剂)分别免疫BALB/c小鼠后,进行尾蚴攻击感染实验。在攻击感染6wk后,剖杀小鼠计算各组的减虫率。　结果　各组的减虫率为rSj1433+福氏佐剂组32.20%,rSj1433+rSjGST+福氏佐剂组31.10%,rSj1433+Mtb佐剂组27.96%,rSj1433+rSjGST+Mtb佐剂组26.00%,rSjGST+Mtb佐剂组27.10%;各组的减卵率分别为(按以上组序)50.40%、53.30%、51.10%、58.60%和51.30%。　结论　rSj1433具有一定的抗血吸虫潜能,有可能成为抗日本血吸虫疫苗,但未见rSj1433和rSjGST的协同作用;Mtb激活扩增的γδT细胞在抗血吸虫免疫中的效果与福氏佐剂产生的免疫作用类似。     

rSj14-3-3和rSj14-3-3/SjGST对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响

目的　探讨日本血吸虫信号蛋白 14 - 3- 3基因重组蛋白 (rSj14 - 3- 3)及其与谷胱甘肽S转移酶融合蛋白(rSj14 - 3- 3/SjGST)对宿主肝虫卵肉芽肿形成的影响。 方法　用rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST免疫雌性BALB/c小鼠 ,末次免疫后 5d ,各组小鼠均感染日本血吸虫尾蚴 4 0± 1条 /鼠 ,6周后 ,剖杀 ,取肝组织计数肝表面虫卵结节密度和肝切片上单个虫卵肉芽肿直径大小。结果　免疫组 (14 - 3- 3组和 14 - 3- 3/GST组 )和对照组肝表面虫卵结节数分别为 6 72±1 14、5 89± 1 0 3和 2 1 0 5± 1 2 6 ,前两者比后者分别减少了 6 8 0 8%和 72 0 2 % ;肝肉芽肿平均直径免疫组为 178 12±32 18μm和 14 8 13± 2 9 6 5 μm ,与对照组 2 75 0 0± 38 2 1μm相比分别减少了 35 2 3%和 4 6 13%。结论　重组抗原rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST对日本血吸虫具有较好的抗病效果。     

Discovery and structural characterization of a small molecule 14-3-3 protein-protein interaction inhibitor

The 14-3-3 family of phosphoserine/threonine-recognition proteins engage multiple nodes in signaling networks that control diverse physiological and pathophysiological functions and have emerged as promising therapeutic targets for such diseases as cancer and neurodegenerative disorders. Thus, small molecule modulators of 14-3-3 are much needed agents for chemical biology investigations and therapeutic development. To analyze 14-3-3 function and modulate its activity, we conducted a chemical screen and identified 4-[(2Z)-2-[4-formyl-6-methyl-5-oxo-3-(phosphonatooxymethyl)pyridin-2-ylidene]hydrazinyl]benzoate as a 14-3-3 inhibitor, which we termed FOBISIN (FOurteen-three-three BInding Small molecule INhibitor) 101. FOBISIN101 effectively blocked the binding of 14-3-3 with Raf-1 and proline-rich AKT substrate, 40 kD(a) and neutralized the ability of 14-3-3 to activate exoenzyme S ADP-ribosyltransferase. To provide a mechanistic basis for 14-3-3 inhibition, the crystal structure of 14-3-3ζ in complex with FOBISIN101 was solved. Unexpectedly, the double bond linking the pyridoxal-phosphate and benzoate moieties was reduced by X-rays to create a covalent linkage of the pyridoxal-phosphate moiety to lysine 120 in the binding groove of 14-3-3, leading to persistent 14-3-3 inactivation. We suggest that FOBISIN101-like molecules could be developed as an entirely unique class of 14-3-3 inhibitors, which may serve as radiation-triggered therapeutic agents for the treatment of 14-3-3-mediated diseases, such as cancer.     

Association of 14-3-3 Proteins with Centrosomes

ABSTRACT: The 14-3-3 proteins are involved in diverse signal transduction pathways and interact physically with a wide variety of proteins. Here, we report the partial sequence analysis of a human spleen 14-3-3 protein, which was identified as a variant form of the ? isoform. A peptide antibody generated to the variant 14-3-3 localizes in the centrosome and spindle apparatus of mouse leukemic FDCP cells by immunofluorescence microscopy. Immunoblots of centrosomes isolated by sucrose density gradient centrifugation of cell lysates disclose only the ? and γ isoforms, while total cellular lysates contain the ?, γ, β and ζ isoforms of 14-3-3. These data suggest that a subset of total cellular 14-3-3 proteins are localized in the centrosomes and spindle apparatus. A differential localization of the centrosomal 14-3-3 was observed in mouse 3T3 cells. Serum-starved (quiescent) cells lack the centrosomal 14-3-3, but upon serum-stimulation of these quiescent cells, the centrosomal 14-3-3 reappears. We propose that a subset of intracellular 14-3-3 proteins are localized in the centrosome and spindle apparatus, and may in fact, link mitogenic signaling, the cell cycle, and perhaps the centrosome duplication cycle as well.     

日本血吸虫Sj14-3-3疫苗研究进展

日本血吸虫病是由日本血吸虫引起的一类严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,研制疫苗防治该病是目前的研究热点.Sj14-3-3蛋白是一种有效的疫苗分子,该文就Sj14-3-3蛋白疫苗和核酸疫苗的研究进展进行综述.     

14-3-3蛋白在心肌细胞缺氧预处理中的表达及意义

目的:研究14-3-3蛋白在心肌细胞缺氧预处理中的表达及意义。方法:实验用SD新生大鼠(1～3d龄),雌雄不拘,无菌取出乳鼠心脏,经分离附着组织,胰蛋白酶消化,纯化制成心肌细胞。在培养的第4天随机分为3组:正常对照组、缺氧/复氧(A/R)组、缺氧预处理(APC)组。各组分别进行以下指标观察:①心肌细胞搏动频率;②细胞存活率(MTT法);③培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;④透射电镜观察细胞超微结构;⑤Western Blotting法检测14-3-3蛋白的表达变化。RT-PCR法检测14-3-3蛋白η、σmRNA的表达变化。结果:A/R组和APC组的14-3-3蛋白表达均上调,分别是正常对照组的(3.61±0.37)倍和(5.52±0.49)倍,A/R组和APC组与正常对照组比较、A/R组与APC组比较,均P<0.01。A/R组、APC组心肌细胞14-3-3η亚型mRNA分别为正常对照组的(1.82±0.30)倍、(2.93±0.52)倍,差异均有统计学意义(P<0.01);APC组与A/R组比较,差异亦有统计学意义(P<0.01)。A/R组、APC组心肌细胞14-3-3σ亚型mRNA表达量分别为正常对照组的...     

肝癌组织中14-3-3基因差异表达的意义

目的:检测肝癌组织中,4-3-3基因家族成员表达差异的临床意义.方法:用TRIzol一步法提取肝癌组织、硬化肝组织及正常肝组织的总RNA并纯化mRNA.逆转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记的cDNA探针与含有14-3-3基因家族成员的基因芯片杂交,用GenePix Pro3.0图像分析软件分析不同病变肝组织中该基因家族成员的表达差异,行半定量RT-PCR对结果进行验证并探讨差异表达基因的临床意义.结果:在肝癌组织中14-3-3基因家族成员呈差异表达,其中14-3-3γ在肝癌组织中明显下调,与肿瘤包膜的完整性相关.14-3-3η在肝癌组织中明显上调,与肿瘤患者的临床分期相关.14-3-3γ与14-3-3ηmRNA的表达强度呈负相关(γ=-0.403,P<0.05).结论:14-3-3基因家族调控机制的紊乱参与肝癌的发生、发展,其中14-3-3γ和14-3-3η与肝癌的关系最为密切.     

日本血吸虫14-3-3抗原编码基因的扩增和克隆

目的克隆日本血吸虫14-3-3抗原的编码基因,以研究其用于血吸虫病免疫诊断和免疫预防效果.方法以日本血吸虫成虫RAN为模板逆转录合成cDNA链,设计合成引物,用PCR法扩增14-3-3抗原基因编码序列,将其克隆入pGEM-T载体,并用双酶切和以质粒为模板的PCR进行鉴定.结果RT-PCR扩增出一条约780bp大小的特异性条带,重组质粒的双酶切和以质粒为模板的PCR均获得了一条与RT-PCR扩增出大小相同带.结论日本血吸虫14-3-3抗原重组pGEM-T克隆载体的成功构建,为进一步的研究提供了条件.     

日本血吸虫重组抗原rSj14-3-3免疫保护作用的初步研究

目的　初步探讨重组信号蛋白 14 3 3及 14 3 3与GST融合蛋白抗日本血吸虫尾蚴感染和抗血吸虫病的免疫保护作用。　方法　用rSj14 3 3和rSj14 3 3 /SjGST免疫BALB/c小鼠 ,日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤攻击感染 ,收集实验组与对照组成虫和虫卵 ,计算减虫率和减卵率 ;间接ELISA法测定实验组与对照组小鼠免疫前、后血清中特异性IgG抗体水平的变化 ;显微镜下测量并比较实验组与对照组肝脏切片上单个虫卵肉芽肿大小 ,观察两种重组抗原对小鼠肝脏肉芽肿形成的影响。　结果　上述两种重组抗原在尾蚴攻击感染后的减虫率分别为 3 1.93 %和 3 4.3 9% ;每克肝组织减卵率分别为 5 3 .2 4%和 60 .0 6% ,每对成虫减卵率分别为 3 3 .3 9%和 40 .48% ;免疫前各组血清IgG抗体A值差异无显著性 ,免疫后实验组血清IgG抗体A值明显高于对照组 ;实验组小鼠肝脏虫卵肉芽肿平均直径比对照组分别下降3 5 .2 3 %和 46.13 %。　结论　信号蛋白 14 3 3在抗感染和抗病免疫中具有保护作用 ,复合多价疫苗的免疫保护作用可能优于单价疫苗。