黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的构建糖类标记载体筛选克隆。方法以pPIC9K-βGl2为模板,通过PCR扩增得到全长的Bgl2基因片段,克隆至pET-28a载体,转化E.coli BL21(DE3),Cel-M9培养基筛选阳性克隆,经DNA测序分析,成功构建pET28a-Bgl2表达载体。SDS-PAGE显示,重组菌经IPTG诱导后表达了目的蛋白,其相对分子质量与预期结果相符。结果 PCR扩增得到Bgl2基因片段,SDS-PAGE显示蛋白以包涵体形式表达,克隆可用Cel-M9培养基筛选。结论用Cel-M9培养基筛选出阳性克隆为构建食品级载体奠定基础。     

黑曲霉产纤维素酶系中内切酶的纯化和性质

目的从黑曲霉产纤维素酶系中分离纯化一种内切酶,并对其性质进行研究。方法硫酸铵盐析、Sephadex G100脱盐、DEAE FF弱阴离子交换柱层析,再经SDS-PAGE电泳标定其纯度及分子量。结果从黑曲霉发酵粉中分离纯化出了一种电泳纯的内切β-葡聚糖苷酶,SDS-PAGE分析该内切酶的分子量为26.4kD。结论实验采用的分离纯化方案稳定可行,酶学性质表明,该酶的最适反应温度是55℃,最适pH为4.8。     

转几丁质酶和β-1,3葡聚糖基因玉米的致突变性检测

<正>转基因食品的毒理学安全性评价是对毒理学新的挑战,国内关于转基因食品安全性的文章已有不少,但讨论其毒理学安全性评价的文章较少[1]。几丁质酶是植物体内的一种次生水解酶,它能水解N-乙酰-D葡萄糖胺的β-1,4-糖苷键。     

TEM-1型β-内酰胺酶基因的克隆、表达及酶的纯化

开发专一性β-内酰胺酶抑制剂,对解决细菌耐药性问题具有重要意义.这项研究需要用到纯度较高的β-内酰胺酶.我们将TEM-1型β-内酰胺酶基因克隆到一个高表达载体中,研究了该酶在大肠杆菌中的高表达条件及分离纯化方法,最终获得的酶纯度大于90%.     

大蒜蒜氨酸酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

提取大蒜总RNA,经RT-PCR扩增出1 348 bp的成熟蒜氨酸酶基因,克隆到pET-28a(+)载体中,构建带有寡聚组氨酸纯化标签的融合蛋白表达质粒.将重组质粒转化入大肠杆菌,经IPTG诱导后的表达产物大部分为包含体,SDS-PAGE电泳和western blotting结果表明目标蛋白的相对分子质量约5.3×104,占菌体总蛋白的45.1%.含6 mol/L盐酸胍的溶液,经镍亲和色谱纯化和透析复性,每升摇瓶发酵液可得蛋白143.3 mg,得率为13.6%,纯度为97%,蒜氨酸酶的比活力为388 u/mg.     

不同分化程度肝癌组织中β-葡萄糖醛酸酶mRNA的表达及意义

为探讨不同分化程度肝癌组织中β-葡萄糖醛酸酶(β-G)mRNA的表达及其意义,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对10例正常肝脏及38例不同分化程度肝癌组织中β-GmRNA的表达进行对比研究。结果表明,β-GmRNA在正常肝和肝癌组织中均有表达,且表达产物大小一致,为422bp;正常肝组织半定量相对表达含量为1·71±0·32,与高分化肝癌(2·17±1·07)比较,差异无统计学意义(P>0·05),而与中分化肝癌(3·67±1·27)和低分化肝癌(5·63±1·62)比较,差异有统计学意义(分别为P<0·05和P<0·01)。结论:随着肝癌恶性程度的增加β-GmRNA表达量呈递增趋势,提示β-GmRNA可能参与了肝细胞的癌变过程。     

噬琼胶卵链菌β-琼胶酶基因YM01-5的克隆表达及其酶学性质的研究

目的 从青岛近海海水中分离鉴定了1株能够降解琼胶的海洋新菌—嗜琼胶卵链菌（Catenovulumagarivoransgen. nov. sp. nov.）YM01T,并对其进行了全基因组测序。本文对该菌的1个β-琼胶酶基因YM01-5进行了克隆表达,并对重组琼胶酶的酶学性质进行了研究。方法 利用镍柱亲和层析对重组琼胶酶进行了分离纯化,采用DNS法测定重组酶的酶学性质,薄层层析(TLC)和质谱(MS)法对AgaYM01-5的酶解产物进行分析。结果 β-琼胶酶基因YM01-5全长2 412 bp,编码803个氨基酸,预测分子量为91.6 kDa,其催化模块属于糖苷水解酶GH50家族。重组琼胶酶YM01-5酶学性质的研究结果表明,该酶的最适温度为40 ℃,最适pH为9.0。在35 ℃以下具有良好的热稳定性,pH 6～10之间保持较高的稳定性,在该范围的pH缓冲液中放置12 h后,YM01-5仍能保持80%以上的酶活力。此外,该重组琼胶酶降解琼脂糖的Km、Vmax值分别为15.6 mg/mL和188 U/mg, 对降解产物的薄层层析及质谱分析结果表明,β-琼胶酶基因YM01-5以外切酶的形式作用于琼脂糖产生新琼二糖作为终产物。结论 该酶降解产物单一,有利于琼胶寡糖的制备,具有较高的工业应用潜力,它的发现也为研究菌株YM01中琼脂糖的代谢通路提供了参考。     

阴沟肠杆菌超广谱β-内酰胺酶、AmpC酶基因检测及耐药性分析

目的了解阴沟肠杆菌超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和AmpC酶的产生情况，研究β-内酰胺酶的基因型别，并分析产酶特性和耐药表型的相关性。方法用酶提取三维试验检测ESBLs和AmpC酶，聚合酶链反应（PCR）扩增β-内酰胺酶的基因；VITEK全自动药敏分析系统和KB法检测细菌耐药性。结果101株阴沟肠杆菌中，检出ESBLs阳性株39株，高产AmpC酶阳性株53株，其中16株ESBLs和AmpC酶均阳性，非产酶菌25株；12株AmpC酶阳性菌中，7株扩增出blaDHA。基因，8株扩增出6laMIR基因，其中5株同时携带blaDBA．和blaMIR基因，1株同时携带blaMIR和blaFOX基因，4株三维试验阴性菌株blaMIR基因阳性；16株ESBLs阳性菌中，8株扩增出blaTEM基因，2株ESBLs三维试验阴性菌株blaTEM基因阳性，未检出blaSHV基因。阴沟肠杆菌对多种抗生素高度耐药，产酶菌株的耐药性明显高于非产酶株。结论阴沟肠杆菌中ESBLs和AmpC酶检出率均很高，AmpC酶以blaDHA、blaMIR基因型为主。产ESBLs和AmpC酶是阴沟肠杆菌耐药的主要原因。     

新型甘露聚糖酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

构建土壤基因组文库,通过功能筛选得到一水解底物魔芋粉的阳性克隆,测序后,序列分析表明:该基因全长为1 530 bp,包含一个糖基水解家族26结构域,编码510个氨基酸,相对分子质量为56 438。此基因推导的氨基酸序列与Cellulomonas fimi的Man26A和Cellvibrio japonicus的mannanase A氨基酸序列同源性分别为64.3%、38%。将此基因的成熟肽的编码序列克隆到表达载体pHBM905上,得到重组质粒pHBM730,将pHBM730经SalI酶切线性化后转化3株毕赤酵母GS115、KM71、SMD1168,该甘露聚糖酶基因在这3种毕赤酵母中均实现分泌表达。将此3种重组毕赤酵母GS115(pHBM730)、KM71(pHBM730)、SMD1168(pHBM730)诱导产酶,对这3种重组酶进行相关的酶学性质研究。分析表明,在KM71中表达量最高,其最适反应pH值均约为6.6,最适反应温度均约为45℃。在最适反应条件下测得其酶活力为19.64 U。此结果为瓜尔豆胶降解产物的工业化应用提供了参考。     

β-烯醇化酶及其mRNA在COPD下肢骨骼肌表达水平的研究

目的探讨两种不同临床表型（骨骼肌萎缩组和非萎缩组）COPD,其下肢骨骼肌β-烯醇化酶蛋白及m RNA表达情况。方法收集昆明医科大学第一附属医院骨科手术诊疗的37例病人股四头肌标本,正常对照组11例、COPD患者26例,根据患者体质指数（BMI）、去脂肪指数结果,将COPD患者分为骨骼肌萎缩组（萎缩组）和骨骼肌非萎缩组（非萎缩组）,萎缩组12例：男7例,女5例,平均（71.6±11.6）岁;非萎缩组14例：男6例,女8例,平均（72.4±8.8）岁。对照组男6例,女5例,平均（71.0±4.0）岁。利用蛋白质印迹法定量测定病人股四头肌β-烯醇化酶蛋白浓度,然后利用荧光定量PCR法检测病人股四头肌β-烯醇化酶m RNA转录水平,分析比较三组病人股四头肌中β-烯醇化酶m RNA转录水平及蛋白表达差异。结果萎缩组、非萎缩组、正常对照组中β-烯醇化酶蛋白及m RNA表达均具有统计学意义（P〈0.05）,非萎缩组β-烯醇化酶蛋白表达高于正常对照组（1.000±0.072）（P值0.0005）,萎缩组β-烯醇化酶蛋白表达（1.200±0.078）高于非萎缩组（1.030±0.075）（P值0.0001）。非萎缩组β-烯醇化酶m RNA表达高于正常对照组（1.000±0.115）（P值0.0087）,萎缩组β-烯醇化酶m RNA表达（2.600±0.947）高于非萎缩组（1.39±0.529）（P值0.0001）。萎缩组及非萎缩组中β-烯醇化酶蛋白浓度及β-烯醇化酶m RNA表达水平一致升高,但两组中β-烯醇化酶蛋白浓度与β-烯醇化酶m RNA表达比例关系不一致。结论 COPD骨骼肌萎缩组和COPD骨骼肌非萎缩组,其下肢骨骼肌β-烯醇化酶的表达存在差异。     

鱼腥藻N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的从鱼腥藻7120(Anabaenasp.PCC 7120)中克隆N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶(N-acyl--Dglucosamine 2-epimerase,AGE)基因,并在大肠杆菌中表达。方法利用PCR技术从鱼腥藻染色体组扩增AGE基因,通过基因工程方法构建表达质粒pLY-11,在大肠杆菌中表达,并利用Ni-NTA柱分离纯化。利用柱前衍生化的方法,通过HPLC检测表达产物转化N-乙酰-D-甘露糖胺(N-acyl-D-mannosamine,ManNAc)的活性,并联合N-乙酰神经氨酸裂合酶(N-acetylneuraminatelyases,NAL),进行双酶转化生成N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)实验。结果AGE基因在大肠杆菌中表达,可溶性产物蛋白占总可溶性蛋白质量的18%,经纯化后得到1.6 g.L-1产物蛋白。双酶转化实验中,转化终产物Neu5Ac质量浓度为14.8 g.L-1。结论鱼腥藻7120 AGE基因在大肠杆菌中的表达产物具有活性,为双酶转化制备Neu5Ac进行了初步的探索。     

DLK1及c-FLIP基因在AML中的表达

目的 探讨急性髓细胞白血病(AML)患者c-FLIPL、c-FLIPS及DLKl基因的表达水平及临床意义.方法 应用逆转录-PCR半定量检测8例AML(AML组)及3例非恶性血液病患者(对照组)骨髓单个核细胞中c-FLIPL、c-FLIPS及DLKl mRNA的表达水平.结果 AML组患者DLKl mRNA、c-FLIPL mRNA、c-FLIPS mRNA表达均明显高于对照组(P＜0.05),且AML各FAB亚型间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 DLKl、c-FLIPL及c-FLIPS基因在AML患者中表达异常增高,可能在白血病细胞逃脱凋亡、无限增殖中发挥作用.     

瘦素、OB-R和IL-β在病理性瘢痕组织中的表达水平及临床意义

目的 探讨瘦素、肥胖基因受体(OB-R)和白介素-β(IL-β)在病理性瘢痕组织中的表达水平及临床意义.方法 收集2010年10月-2015年9月整形外科的110例组织标本,分为病理性瘢痕组50例(包括瘢痕疙瘩组27例和增生性瘢痕组23例)、非病理性瘢痕组30例和正常皮肤组30例.并用免疫组织化学方法测定,且比较各组瘦素、OB-R和IL-β的表达水平,并分析其临床意义.结果 病理性瘢痕组和非病理性瘢痕组的瘦素、OB-R和IL-β表达水平均高于正常皮肤组(P＜0.01),且病理性瘢痕组高于非病理性瘢痕组(P＜0.01).瘢痕疙瘩组瘦素、OB-R和IL-β表达水平高于增生性瘢痕组及非病理性瘢痕组(P＜0.05),且增生性瘢痕组高于非病理性瘢痕组(P＜0.05).结论 瘦素、OB-R和IL-β在瘢痕组织中表达异常增多,而其表达水平与瘢痕的纤维化程度相关,表明瘦素、OB-R和IL-β参与了病理性瘢痕组织的病变过程.     

联合检测血清及肺泡灌洗液(1,3)-β-D-葡聚糖在诊断侵袭性肺真菌病中的应用研究

目的 探讨联合检测血清及肺泡灌洗液(1,3)-β-D-葡聚糖在侵袭性肺真菌病中诊断价值.方法 选取2020年1月～2020年9月诊治为侵袭性肺真菌病患者40例进行研究,按照《肺真菌病诊断和治疗专家共识》标准进行抗真菌治疗,治疗期间均取患者血液和支气管肺泡灌洗液进行(1,3)-β-D-葡聚糖检测、真菌培养和药敏检查,根据...     

Carba plus纸片法测定CRE的碳青霉烯酶的能力评估及与β-内酰胺酶耐药基因的关系

目的 探讨Carba plus纸片法检测耐药肠杆菌科细菌的碳青霉烯酶类型的评估能力及与β-内酰胺酶耐药基因的关系.方法 收集医院2018年6月-2020年6月临床分离的65株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌为研究组,另选取同期分离的68株碳青霉烯类敏感肠杆菌科细菌为对照组.两组均行Carba plus纸片法检测和耐药基因检测,...     

β-连环蛋白、上皮钙粘蛋白及Wnt-1在喉癌中的表达及意义

目的检测喉癌组织中β-连环蛋白（β-catenin）、上皮钙粘蛋白（E—cadherin）及Wnt-1的表达情况,在探讨此3种蛋白在喉癌发生、发展及转移过程中的作用及相关性。方法应用免疫组织化学SP法检测β-catenin、E—cadherin及Wnt—1在35例喉癌及27例喉正常黏膜的异常表达情况;分析它们在不同组织中的相互关系及与喉癌临床病理指征的关系。结果喉癌中β-catenin的异常表达率高于正常喉黏膜（P〈0．01）。低分化喉癌中β-catenin的异常表达率高于高分化喉癌（P〈0,05）。喉癌中E—cadherin的异常表达率高于正常喉黏膜（P〈0．01）。低分化喉癌中E-cadherin的异常表达率高于高分化喉癌（P〈0．01）。伴有淋巴结转移的喉癌中E-cadherin异常表达率高于无淋巴结转移的喉癌（P〈0．01）。Ⅲ、Ⅳ期喉癌E—cadherin的异常表达率高于I、Ⅱ期喉癌（P〈0．05）。喉癌中Wnt-1的异常表达率高于正常喉黏膜（P〈0．01）。β-catenin的异常表达与E-cadherin的异常表达呈正相关（r=0．457,P〈0．01）。结论β-catenin、E—cadherin及Wnt-1在喉癌发生、分化程度、浸润及转移过程中的起重要作用。β-catenin、E—cadherin的协同作用可能影响喉癌的浸润及转移。     

人体β-防御素-3突变基因的构建及在大肠埃希菌中的融合表达

目的从人正常皮肤组织中提取β-防御索-3基因进行定点突变后在E．coli中融合表达。方法从人正常皮肤组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到编码β-防御素-3成熟肽的cDNA序列，测序正确后，寻找合适的突变位点，设计含突变位点的引物，用PCR重叠延伸法对β-防御素-3成熟肽cDNA序列进行定点突变，将突变产物克隆至pUC18进行序列测定及在E．coli中融合表达。结果测序结果表明，经RT—PCR所得的β-防御素-3成熟肽序列与GeneBank中报道的编码人β-防御索-3成熟肽的cDNA序列完全-致。经过突变β-防御素-3成熟肽第29位谷氨酰胺密码子由CAG突变为精氨酸密码子CGA，其余核苷酸序列均未发生变化。将突变β-防御素-3基因在E．coli中诱导表达3～5h后可见突变β-防御素-3蛋白表达。结论成功构建并表达了β-防御素-3突变体基因，为进-步对突变体进行真核表达、生物活性研究奠定了基础。     

转化生长因子-β1及其受体TβRⅠ、Ⅱ在鼠牙髓炎组织中的表达及意义

目的 观察转化生长因子（TGF）-β1及其受体TβRⅠ、TβRⅡ在大鼠可复性牙髓炎模型中不同时间的动态表达及定位情况,探讨TGF-β1及其受体TβRⅠ、TβRⅡ在大鼠牙髓炎症发展过程中可能的作用机制及在牙髓损伤修复中的意义.方法 通过对大鼠上颌第1磨牙进行机械性不喷水均匀磨除釉质,后用酸蚀剂处理暴露的牙本质,建立实验性大鼠可复性牙髓炎模型.然后对牙髓炎组织连续切片采用免疫组化法分析,并进行单因素方差分析（ANOVA）、Tukey检验.结果 在炎症牙髓中TGF-β1及其受体TβRⅠ、TβRⅡ的表达明显增强,且随时间呈动态变化趋势;TGF-β1在5 d达到高峰,之后明显下降.TβRⅠ、TβRⅡ在3 d达到最高,之后略有下降.在0～3 d TGF-β1及TβRⅠ、TβRⅡ均呈上升趋势,但不成正比例关系.结论 TGF-β1通过与受体TβRⅠ、TβRⅡ结合,参与牙髓组织损伤修复并发挥重要作用,TGF-β1可上调TβRⅠ、TβRⅡ表达,但不成正比例关系.     

来自肺炎克雷伯菌的SHV型β-内酰胺酶基因的克隆、表达与纯化

为研究先前筛得的可抑制TEM-1型β-内酰胺酶的多肽SIPIS-04-01对SHV型β-内酰胺酶的结合能力,从一株临床耐β-内酰胺类抗生素的肺炎克雷伯菌10032克隆了SHV型β-内酰胺酶基因,并替换质粒pUC18上原有的bla基因,转化大肠杆菌DH5α后表明该基因使宿主菌具有抗氨苄青霉素的能力。进一步将其克隆到一个高效表达载体pLY-5中,优化表达和纯化条件获得了SHV型β-内酰胺酶。体外试验证明该酶能降解氨苄青霉素,重组多肽SIPIS-04-01对此降解有所抑制。