哇巴因诱导ECV304细胞凋亡与p120ctn mRNA的表达

目的研究哇巴因对ECV304细胞的作用及相关机制。方法应用MTT法检测哇巴因对细胞生长抑制作用,Hoechst33342/PI双荧光染色分析细胞死亡特征,透射电镜和光镜观察细胞形态结构变化,半定量RT-PCR法检测P120ctn 1A和P120ctn 3A mRNA的表达。结果哇巴因以浓度和作用时间依赖的方式抑制ECV304细胞生长;荧光显微镜下可见30%以上细胞为凋亡细胞,20%细胞为晚期凋亡细胞的形态学改变;透射电镜下可见核染色质凝集、边移、凋亡小体形成等细胞形态学变化;RT-PCR结果显示P120ctn 1A mRNA表达较对照组明显降低,P120ctn 3A mRNA表达较对照组明显增强。结论哇巴因能抑制ECV304细胞增殖和诱导其凋亡,并下调P120ctn 1A和上调P120ctn3A mRNA表达。     

血小板对ECV304细胞PTA1表达和PDGF释放的影响

目的:探讨血小板对妊高征患者血清刺激下的ECV304细胞(ECV304)表达人血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)和释放血小板衍生生长因子(PDGF)的影响。方法①用间接免疫荧光染色结合流式细胞仪分析观察血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PTA1的表达②用ELISA方法检测血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PDGF的量。结果:①血小板与妊高征患者血清刺激(24h、48h)的ECV304细胞孵育后PTA1表达的百分率(6.32%、4.13%)明显低于对照组(15.51%、5.64%)(P<0.05)。②妊高征患者血清刺激ECV304细胞8h、24h、48h释放PDGF的量(1593、2625、2175ng/L)明显高于正常孕妇组(235、405、133.5ng/L)差异显著(P<0.01)。③血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育后,24h、48h细胞培养上清液中PDGF-B的量又进一步增加(3266、2360ng/L),与对照组比差异显著(P<0.05)。结论:ECV304细胞与血小板之间的黏附可能是通过PTA1分子发挥作用的,同时导致了PDGF的进一步释放。     

血管内皮细胞(ECV304)表达的HLA-G1对NK细胞杀伤活性的抑制作用

目的:证实HLA-G1分子能够抑制NK细胞对同种血管内皮细胞系的杀伤作用。方法:采用脂质体介导的DNA转染技术,以构建的真核表达质粒pcDNA3-HLA-G1转染人脐静脉内皮细胞系ECV304,再用免疫荧光法检测表达的HLA-G1分子。并用MTT比色法检测HLA-G1对NK细胞杀伤活性的影响。结果:ECV304细胞上可稳定表达HLA-G1。NK细胞对空质粒pcDNA3转染的ECV304细胞的杀伤率为(50.6±18.1)%;而对pcDNA3-HLA-G1转染的ECV304细胞的杀伤率为(29.7±11.4)%,两者差异具有显著意义(P<0.01)。结论:HLA-G1分子可明显抑制NK细胞对同种血管内皮细胞的杀伤效应。     

反式脂肪酸对ECV304细胞HNP-1mRNA表达和氧自由基的作用

目的:探讨反式脂肪酸(TFAs)对ECV304细胞氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的作用及其机制。方法:按常规方法传代培养ECV304细胞,用实时荧光定量PCR检测不同浓度TEAs刺激(TFA处理组)后ECV304细胞中HNP-1的表达;采用流式细胞仪检测ECV304细胞中氧自由基(ROS)的生成;用脂质氧化产物丙二醛(MDA)生成量描述ECV304细胞LDL氧化能力的变化。并与未行TFAs处理的ECV304细胞对照组比较其组间差异。结果:与对照组比较,TFAS处理组HNP-1mRNA表达水平显著升高(0.220±0.030vs 0.429±0.090,P0.05);与对照组比较,1mmol/L TFAS刺激ECV304细胞12h其ROS水平显著升高(11.30±1.67vs 66.70±6.53,P0.05),在加入不同钙离子拮抗剂后ROS水平明显下降(P0.05);与LDL处理组比较,1mmol/L TFAS+LDL处理组MDA水平也显著升高(0.134±0.027vs 0.155±0.025,P0.05)。结论:反式脂肪酸能促进HNP-1的表达,提高钙离子依赖的自由基水平,从而提高ECV304细胞氧化LDL的能力。     

尿酸对ECV304细胞的NO-NOS通路及ADMA-DDAH系统的影响

目的：观察尿酸（uric acid，UA）对ECV304细胞的NO-NOS通路及ADMA-DDAH系统的影响。 方法： ①浓度依赖性分组：对照组、UA 200 μmol/L（UA2）组、UA 400 μmol/L（UA4）组、UA 600 μmol/L（UA6）组与ECV304细胞共同孵育24 h。②时间依赖性：UA6组分别观察1、3、5、7 d。检测培养液NO2-/NO3-浓度、NOS活性、非对称二甲基精氨酸（ADMA）浓度、二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）活性以及SOD活性和Ang Ⅱ浓度，细胞裂解液DDAH表达。 结果： ① 3种浓度UA组NO2-/NO3-明显高于对照组，NOS、DDAH、SOD活性则在UA4、UA6两组明显高于对照组，而ADMA浓度在UA4、UA6两组降低，Ang Ⅱ浓度和DDAH表达则无显著差异。② UA6组各时段NO2-/NO3-浓度和NOS、DDAH、SOD活性均高于相应对照组，而ADMA浓度低于对照组；Ang Ⅱ浓度、DDAH表达则无明显差异。除NOS活性在第7 d明显下降外，其余指标在不同时段组没有明显的差异。 结论： ① 短期UA刺激使ECV304细胞分泌NO2-/NO3-增多，且呈浓度依赖，无时间依赖。② UA通过增加DDAH活性、加速ADMA的降解,使NOS活性增加而致NO2-/NO3-生成增多。③尿酸使SOD活性增加而不增加AngⅡ浓度。     

杭白菊总黄酮对ECV304细胞内钙信号的影响

目的 :杭白菊是我国传统的栽培药用植物。药物分析表明 ,杭白菊内含黄酮类、菊甙及多种维生素和微量元素。我们的前期研究表明 ,杭白菊总黄酮 (FDM)可以增加大鼠心脏的收缩力和冠脉流量 ,并且能对抗由缺血 /复灌引起的心脏收缩力下降和冠脉流量的下降。血管环实验证明FDM具有舒张大鼠胸主动脉环的作用 ,但是尚无直接证据表明FDM可直接影响细胞内钙水平。本实验观察了FDM对人脐静脉内皮细胞株ECV30 4细胞内钙的影响。方法 :将人脐静脉内皮细胞株ECV30 4细胞接种于含有 1mLDMEM培养基的培养板内的盖玻片上。用Fura - 2 /AM(1μmol/…     

活性氧对ECV304细胞生长和凋亡的相关基因表达谱研究

目的： 探讨活性氧（ROS）对ECV304细胞生长和凋亡作用的相关基因表达谱。 方法： 采用MTT法分别观察不同浓度AngⅡ在4 h、12 h和24 h时对ECV304细胞生长率和ROS生成量的影响。应用基因芯片技术和光镜分别检测0.0625和1 μmol/L AngⅡ作用12 h时ECV304细胞生长作用的相关基因表达谱和细胞形态学变化。 结果： 一定浓度的AngⅡ作用12 h时ECV304细胞生长率明显增加（P<0.05）；基因芯片技术分析显示，在0.0625 μmol/L AngⅡ作用ECV304细胞12 h时，与细胞生长相关的ERK、CDK、CCN、PCNA等25个基因普遍上调，而与细胞凋亡相关的DR6、caspase-6、BAK1、PDCD8等12个基因普遍下调，在1 μmol/L AngⅡ作用12 h时，呈相反结果。 结论： AngⅡ是ECV304细胞产生ROS(·OH)的诱导剂，可引起多种与ECV304细胞生长和凋亡的靶基因表达；N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）可以明显抑制AngⅡ对ECV304细胞的生长作用；ROS(·OH)可能是AngⅡ诱导ECV304细胞生长和凋亡的主要信号转导分子和基因表达调节分子。     

碱性成纤维细胞成长因子对ECV304细胞迁移的影响

目的：观察不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养中划痕损伤后ECV304细胞迁移的影响。方法： 在体外细胞划痕损伤模型中应用显微电视电脑图像处理系统定量测定不同浓度(0、5、10、15 μg/L)bFGF引起的ECV304细胞迁移的变化，用光镜与扫描电镜观察bFGF引起的迁移细胞的形态变化。结果： 与不加bFGF的对照组比较，低浓度(5 μg/L)时bFGF对ECV304细胞的迁移呈促进作用；高浓度时(15 μg/L)呈抑制作用。迁移细胞表面有众多丝状伪足。结论： bFGF对体外培养的ECV304细胞的迁移有双相调节作用，低浓度时(5 μg/L)促进细胞迁移，高浓度时(15 μg/L)抑制细胞迁移。迁移细胞表面伪足丰富，以丝状伪足为主。     

接触抑制下调CD112和CD155在ECV304细胞上的表达伴有对NK细胞杀伤的抵抗

目的：研究细胞培养接触抑制条件下，ECV304细胞表面CD112和CD155表达的变化及其对NK细胞杀伤敏感性的变化。方法：以ECV304细胞接触抑制为模型，应用免疫荧光染色和流式细胞术分析，观察CD112和CD155分子在对数生长状态和发生接触抑制状态ECV304细胞上表达情况的变化；采用51Cr-4h释放试验，观察NK细胞对2种状态ECV304细胞杀伤活性的改变。结果：CD112和CD155分子在ECV304细胞发生接触抑制时表达水平明显低于对数生长期细胞。NK细胞对发生接触抑制的ECV304细胞的杀伤率比对数生长期的细胞有所下降。结论：接触抑制会使ECV304细胞对NK细胞杀伤有一定抵抗，同时伴有CD112和CD155分子表达的下调，两者间是否存在因果关系值得进一步深入探讨。     

高糖时细胞间相互作用对共培养ECV304细胞的影响及茶多酚的干预作用

目的：研究高糖时系膜细胞对体外共培养的ECV304细胞产生活性氧和转化生长因子β1（TGF-β1）的影响以及茶多酚的干预作用。 方法： 建立体外ECV304细胞和系膜细胞不直接接触共培养体系，分为正常对照组、高糖组、茶多酚组、茶多酚干预组，并与两种细胞分别单独培养进行比较，培养36 h后，分光光度比色法测定细胞上清液超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，RT-PCR法测定培养ECV304细胞内TGF-β1 mRNA的表达。 结果： 在共培养模型中，高糖抑制SOD活性，促进MDA产生，上调共培养模型中ECV304细胞TGF-β1 mRNA表达，其作用显著高于单独培养的ECV304细胞，茶多酚干预可拮抗高糖时ECV304细胞的上述改变。 结论： （1）高糖环境下系膜细胞和ECV304细胞间存在相互作用，这种作用能促进共培养的ECV304细胞产生活性氧和上调TGF-β1的表达。（2）茶多酚通过干预这种细胞间相互作用，保护ECV304细胞。     

抑制ECV304细胞内EOLA1基因表达后效应观察

目的观察抑制人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞内内皮高表达脂多糖相关因子1（endothe-lial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1）基因表达后细胞生长的变化。方法构建EGFP-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2/EOLA1,转染ECV304细胞,G418压力筛选获得稳定表达株;设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamHⅠ和HindⅢ酶切线性化的pSlincer3.1/H1质粒上。转染重组质粒到稳定表达EGFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞,检测靶基因的抑制情况,观察EOLA1表达被抑制后细胞生长的改变。结果抑制EOLA1表达后ECV304细胞生长明显减慢。结论EOLA1基因在细胞内参与了细胞生长的调控。     

核酶抑制内皮素-1mRNA的表达

目的:从设计针对人内皮素-1mRNA的核酶DNA片段中,筛选能显著抑制ET-1mRNA表达的核酶。方法:应用锤头状核酶设计原理,将计算机设计人工合成的核酶片段亚克隆到真核表达载体pEGFP中,经脂质体转染入ECV304细胞后,用RT-PCR方法测定转染核酶的细胞内ET-1mRNA的相对含量,并用空载体作对照。结果:设计的核酶R145降低ECV304细胞ET-1mRNA的表达。结论:与对照组相比,核酶R145能显著抑制ECV304细胞ET-1mRNA的表达。     

氧化高密度脂蛋白通过MAPKs信号转导途径诱导ECV304细胞表达组织因子

目的： 探讨氧化高密度脂蛋白(oxHDL)对人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞表达组织因子(TF)的影响及其机制。方法：实验分为阴性对照组、阳性对照组（加组胺）、HDL、oxHDL 4组, ECV304细胞经不同浓度oxHDL、HDL（10-120 mg/L）和组胺(1×10-9-1×10-4 mol/L)处理不同时间(2-8 h)后,采用实时定量PCR (RQ-PCR)和Western bloting方法检测TF表达。同时,分别应用SP600125［c-Jun氨基端激酶(JNK) 特异性抑制剂］、SB203580［p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK) 特异性抑制剂］、 PD98059［细胞外信号调节激酶(ERK1/2) 特异性抑制剂］,观察其对oxHDL和组胺诱导的ECV304细胞表达TF的影响。 结果：正常ECV304细胞未检测到TF,经组胺处理1 h后TF mRNA表达明显增加,在1×10-5 mol/L时最高,约为1×10-9 mol/L时的4.8倍。oxHDL以时间和浓度依赖性方式诱导ECV304细胞TF mRNA表达,在oxHDL 20 mg/L时最高,为10 mg/L时的1.8倍,在第6 h时TF mRNA表达水平为第2 h的5.3倍（P<0.05）,并在20 mg/L时显著刺激ECV304细胞TF蛋白表达,为40 mg/L时的1.5倍,而HDL没有此效应。 MAPKs（JNK、p38 MAPK、ERK1/2）抑制剂可部分解除oxHDL诱导ECV304细胞TF表达的效应,TF分别下调表达至原来的19.0%、5.0%和13.0%（P<0.05)。结论：oxHDL能以浓度和时间依赖性方式诱导ECV304细胞产生TF,其机制可能通过JNK、p38 MAPK和ERK1/2所介导。     

人体内皮细胞系细胞株ECV304细胞低氧模型的制备

目的 研究人体内皮细胞系细胞株(ECV304)细胞低氧模型的建立条件及其形态学特点.方法 培养ECV304细胞,将培养箱内通入5%CO:-95%N2混合气体(氧分压为18.3 mmHg)并培养ECV304细胞12h、24h,使用MTT法、酸脱氢酶试剂盒(LDH)活力测定及细胞骨架染色对低氧细胞模型鉴定.结果 与正常对照...     

汉滩病毒感染HUVEC细胞系炎症介质表达的检测

目的 检测汉滩病毒陈株感染HUVEC细胞系ECV304中炎症介质的表达。方法 用汉滩病毒陈株感染HUVEC细胞系ECV304,取感染后不同时间的细胞提取细胞总RNA,用半定量RT－PCR检测感染细胞中ICAM－1、eNOS和IL－6基因的表达,并将扩增的ICAM－1和eNOS基因克隆,测定核苷酸序列。结果LACM－1的表达产物在病毒感染后较未感染细胞有明显升高,序列分析结果表明扩增的基因为特异性扩增产物;用扩增eNOS的引物从病毒感染细胞可扩增出表达产物,从未感染细胞不能扩增出任何产物,但序列分析结果表明扩增的基因与一新基因高度同源。结论 汉滩病毒陈株感染ECV304细胞可上调炎症某些介质的表达。     

脱氢表雄酮对抗LDL和OX-LDL所致ECV304细胞的损伤

目的：观察脱氢表雄酮（DHEA）对抗LDL及OX-LDL所致ECV304细胞的损伤作用，探讨DHEA可能的抗AS作用机制。 方法: 采用培养的ECV304细胞, 应用硝酸还原酶、放免及SABC免疫组化等方法观察经DHEA预处理及与LDL或OX-LDL混合作用后的细胞培养液中NO2-/NO3-、ET-1水平及细胞表面ICAM-1的表达。 结果: LDL可明显地减少培养液中NO2-/NO3-的含量，增加细胞ICAM-1的表达，但不影响ET-1的分泌；OX-LDL可明显减少培养液中NO2-/NO3-的含量、升高ET-1的水平，同时上调细胞表面ICAM-1的表达； 在预处理条件下，DHEA可升高LDL作用后细胞培养液中NO2-/NO3-的含量、下调ICAM-1的表达，但在混合培养条件下无此作用；在预处理及混合培养条件下，DHEA均可升高OX-LDL作用后细胞培养液中NO2-/NO3-的含量、减少细胞ET-1分泌以及下调ICAM-1的表达。 结论: LDL和OX-LDL对ECV304细胞具有明显的毒性作用，两者作用机制不尽相同。DHEA可能通过对ECV304细胞内部结构和功能的调节或通过其对OX-LDL分子的直接作用而发挥保护作用。     

海洋放线菌素X2对CVB3感染ECV304细胞VCAM-1表达的影响

目的研究柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CVB3)感染ECV304细胞后,血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesionmolecule,VCAM-1)的表达变化及海洋放线菌素X2对CVB3感染ECV304细胞VCAM-1表达的影响。方法采用MTT法检测不同浓度的海洋放线菌素X2作用病毒后的抑制情况;采用RT-PCR和FCM分别测定CVB3感染的ECV304细胞在海洋放线菌素X2作用前后不同时间点的VCAM-1的mRNA和蛋白的表达水平。结果海洋放线菌素X2在病毒吸附前对CVB3的SI为63.88。正常状态下ECV304细胞基本无VCAM-1 mRNA表达,CVB3感染ECV304细胞促进VCAM-1 mRNA表达,感染12 h达到最高峰,6～54 h时VCAM-1 mRNA水平,与细胞对照组相比CVB3感染组差异有统计学意义(P<0.05)。CVB3感染ECV304细胞后,VCAM-1蛋白表达在12～48 h显著高于正常ECV304细胞对照组(P<0.05)。海洋放线菌素X2干预后,于12～54 h降低ECV304细胞VCAM-1 mRNA的水平,12～24 h降低VCAM-1蛋白的表达,与CVB3感染组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论海洋放线菌素X2在病毒吸附前对CVB3具有抗病毒作用,并可下调CVB3诱导的ECV304细胞VCAM-1的mRNA水平和蛋白的表达。