FGF2基因真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的研究真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-FGF2(成纤维细胞生长因子2)在骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达及其对MSCs的影响。方法基因克隆构建pcDNA3．1／V5-His-FGF2真核表达载体,利用FuGENETM6转染大鼠MSCs,RT-PCR、免疫荧光检测其表达情况,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测其对MSCs生物学活性的影响。结果构建了含FGF2基因的真核表达载体;RT-PCR证实外源FGF2基因可转染到MSCs;免疫荧光检测转染24 h即可在MSCs中表达;MTT法检测转染48、72 h后细胞吸光度值(0．3871±0．0433、0．4349±0．0319)明显高于空载体组(0．3457±0．0162、0．3881±0．0434)(t1=2．833、t2=2．313,P<0．05)和未转染组(0．3378±0．0215、0．3641±0．0365)(t1=3．227、t2=3．650,P<0．05),而空载体对细胞增殖无影响(P> 0．05)。结论构建了FGF2真核表达质粒,并在MSCs中成功表达,为FGF2基因治疗的研究奠定了坚实的基础。     

血管内皮细胞生长因子真核表达质粒的构建及其在心肌细胞中的表达

目的 :构建血管内皮细胞生长因子 （ VEGF1 65）真核表达质粒 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65,并通过转染心肌细胞来验证其生物活性。方法 :应用 DNA重组方法 ,将编码 h VEGF1 65全长 c DNA克隆于真核表达载体 pc DNA3 .1（ -）中 ,构建 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65真核表达质粒 ;应用阳性脂质体介导的基因转染技术 ,将真核表达质粒 pc D-NA3 .1（ -） /h VEGF1 65瞬时转染培养的大鼠心肌细胞中 ;采用 RT-PCR,ELISA,Western blot及免疫组化染色等方法检测 VEGF1 65基因在心肌细胞中的表达情况 ;应用 MTT法检测转染后细胞上清液中 VEGF1 65的生物活性。结果 :将构建好的真核表达质粒 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65转染心肌细胞后 ,VEGF m RNA及蛋白表达水平明显增高 ,转染后的心肌细胞培养上清液具有促使内皮细胞增殖的生物活性。结论 :成功构建了真核表达质粒 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65,其转染心肌细胞后可获得较高水平 VEGF蛋白的表达 ,所表达出 VEGF蛋白具有生物学活性     

bFGF真核表达载体的构建及其在MSCs中的稳定表达

目的 构建人碱性成纤维生长因子(bFGF)真核表达载体,观察其在人骨髓间充质干细胞(MSCs)内的表达.方法 应用RT-PCR从人胎盘组织中扩增出bFGF,并将其构建于pcDNA3.1真核表达载体上.利用脂质体将基因转染MSCs内,利用G418进行基因的表达筛选,通过RT-PCR和Western blot进行基因表达的检测.结果 扩增出人bFGF基因成功构建在bFGF-pcDNA3.1真核表达载体上.经G418筛选转染的MSCs存活十代以上.经RT-PCR及Western blot检测发现转染bFGF-pcDNA3.1真核表达载体的MSCs能够大量稳定表达bFGF.结论 构建的bFGF-pcDNA3.1真核表达载体可在MSCs内得到稳定的表达.     

人骨髓间充质干细胞体外向血管内皮细胞诱导分化的研究

目的 体外研究人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分化为血管内皮细胞的潜能,探讨作为血管组织工程种子细胞来源的应用前景.方法 用人淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离出成人骨髓单个核细胞,经贴壁法获取 MSCs ,体外扩增培养并进行鉴定.在内皮细胞生长培养基(DMEM)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF) 、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导 hMSCs 向血管内皮细胞分化,观察细胞形态学变化,扩增培养后经流式细胞仪进行细胞表型鉴定和超微结构观察.结果 形态学观察显示,培养的人骨髓间充质干细胞经 bFGF 、VEGF 诱导后的 hMSCs 可见类似内皮细胞样改变,向血管内皮诱导分化24 d后,经流式细胞仪检测, CD34 表达转为阳性,而CD106、HLA-DR 表达明显上调.结论 在血管内皮细胞生长因子及碱性成纤维细胞生长因子诱导作用下, hMSCs 具有向内皮细胞分化潜能,产生功能性内皮细胞.     

人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞的诱导分化

目的观察人骨髓间充质干细胞（HBMCs）的体外培养及向血管内皮细胞的诱导分化结果。方法利用密度梯度离心法将HBMCs从人骨髓中分离出来,体外扩增。将培养至第3代的HBMCs加入含血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（bFGF）的培养基定向诱导,使其向血管内皮细胞分化。用免疫细胞化学和流式细胞学方法检测诱导后的细胞表型。结果原代HBMCs培养3周后细胞呈梭形,诱导后第7天的细胞呈椭圆形或不规则形,第14天细胞大致呈＂铺路石＂样改变,细胞化学方法检测发现其CD31、CD34、vWF因子呈阳性,流式细胞仪测定CD31、vWF因子阳性细胞分别占87.5%、82.6%,CD31、vWF因子均阳性的细胞占71.2%。结论 HBMCs在VEGF、bFGF的诱导下向血管内皮细胞方向分化。     

剪应力和血管内皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化

目的 研究血管内皮生长因子与剪应力对骨髓间充质干细胞分化的作用.方法 分离成人骨髓单个核细胞,经贴壁法获取骨髓间充质干细胞.所获细胞用血管内皮生长因子、剪应力(8和15 dyn/cm2)、血管内皮生长因子联合剪应力分别作用7天、24 h、24 h,观察细胞形态变化,并进行内皮细胞标记物假性血友病因子定性间接免疫荧光染色,进行Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白摄取实验以鉴定内皮细胞功能.结果 在剪应力(8 dyn/cm2)、血管内皮生长因子分别作用24 h、7天后,骨髓间充质干细胞形态变得偏圆、呈多角形,血管内皮生长因子联合剪应力诱导组细胞平行于流体方向排列,假性血友病因子染色阳性,提示内皮细胞表型特征,同时Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白摄取实验阳性,提示具有内皮细胞功能.血管内皮生长因子诱导组、15 dyn/cm2剪应力组作用24 h的骨髓间充质干细胞,假性血友病因子染色与Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白摄取实验均阴性,提示未出现向内皮细胞分化.血管内皮生长因子和15 dyn/cm2剪应力共同作用24 h后,骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化.结论 剪应力可诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,且与力的大小有关.血管内皮生长因子可联合剪应力诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化.且诱导效果优于单独使用剪应力.     

骨髓间充质干细胞及其在缺血性脑血管病中的应用

骨髓间充质干细胞是骨髓中的一群非造血干细胞，具有较强的自我更新能力和多向分化潜能，在体外不同诱导条件下可分化为骨细胞、神经细胞和平滑肌细胞等多种细胞。骨髓间充质干细胞已应用于缺血性脑血管病的治疗研究。文章对骨髓间充质干细胞及其在缺血性脑血管病中的应用做了综述。     

骨髓间充质干细胞的研究进展及其应用前景

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞群体,最新的分类方法是根据其来源将其分为四类:成体干细胞、胎儿干细胞、胚胎干细胞和核移植干细胞。胚胎性干细胞和成体干细胞除了来源不同,其最大的区别在于增殖能力和分化潜能的不同:胚胎性干细胞可无限增殖,而成体干细胞的增殖能力则有限;胚胎性干细胞分化潜能要较成体干细胞宽。成体干细胞的可塑性已经成为研究热点,目前有越来越多的实验结果都证实成体干细胞确实具有分化为多种细胞类型的潜能,因此成体干细胞成为生物医学领域中一个很好的研究手段,同时具有广阔的临床应用前景。成体骨髓来…     

低氧对人骨髓间充质干细胞HIF-1α、SDF-1、VEGF mRNA表达的影响

目的 观察低氧对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)及血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响.方法 分别在1% O2及20% O2条件下培养hBMSCs,定量RT-PCR技术检测其HIF-1α、SDF-1及VEGF mRNA.结果 在1% O2条件下,hBMSCs 的HIF-1α、SDF-1、VEGF mRNA表达水平明显增高(P＜0.01).HIF-1α mRNA与SDF-1 mRNA及VEGF mRNA的表达密切相关(r分别为0.488、0.644,P均<0.01),但SDF-1 mRNA与VEGF mRNA的表达无明显关系(r=0.077,P>0.05). 结论 低氧可促进hBMSCs的 HIF-1α表达,并使SDF-1、VEGF mRNA表达增加.     

兔骨髓间充质干细胞体外成内皮细胞能力的研究

目的　探讨骨髓间充质干细胞体外扩增及其向内皮细胞定向分化能力。方法　无菌条件下采集兔骨髓 ,肝素抗凝 ,经淋巴细胞分层液密度梯度离心分离骨髓单个核细胞 ,通过贴壁培养法获得MSC ,然后在内皮细胞生长环境中进行诱导分化 ,最后对扩增的细胞特征进行鉴定 ,同时初步研究其体外成血管特性。结果　MSC每扩增一代 ,细胞数量增加 5～ 8倍 ,7.6 5× 10 3 个原代MSCs体外扩增 3代即获得 1.2 6× 10 8个细胞。在 70 %～80 %融合时呈现“铺路石”样形态 ,细胞免疫组化证实扩增细胞表达CD31和vonWillebrandfactor(vWF) ,具有吞噬ac LDL的功能 ,且扩增细胞在体外参与网状血管样结构形成。结论　MSC扩增能力强 ,在体外能诱导其向内皮细胞方向分化。     

血管内皮生长因子真核表达载体的构建及其在培养鼠心肌细胞中的表达

目的　构建血管内皮生长因子 (VEGF1 6 5)真核表达载体 ,并检测其在鼠心肌细胞中的表达。方法　应用DNA重组方法 ,将编码hVEGF1 6 5全长cDNA克隆于真核表达载体pCR3中 ,构建pCR3.hVEGF1 6 5真核表达载体 ,使用脂质体包裹的方法将真核表达载体pCR3.hVEGF1 6 5转染至培养鼠心肌细胞中 ,采用逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)、Southernblot、免疫组织化学染色、酶联免疫吸附测定法检测VEGF1 6 5基因在心肌细胞中的表达和分泌。结果　将构建好的真核表达载体pCR3.hVEGF1 6 5转染心肌细胞后 ,VEGFmRNA及蛋白水平明显增高。结论　成功构建了真核表达载体pCR3.hVEGF1 6 5,其转染心肌细胞后能够获得较高水平的VEGF蛋白。     

血小板衍生生长因子−C对体外培养血管内皮细胞及间充质干细胞的影响

目的 观察血小板衍生生长因子?C（PDGF-C）对体外培养的血管内皮细胞（VECs）及间充质干细胞（MSCs）的影响。方法　采用培养的大鼠主动脉内皮细胞和MSCs,应用细胞直接计数法、噻唑蓝比色法（MTT法）评价细胞的增殖情况,流式细胞术检测细胞周期,利用Transwell细胞迁移实验和细胞划痕实验测定细胞迁移能力。结果　PDGF-C能明显刺激VECs和MSCs的增殖,增加两种细胞S期细胞的比例,对VECs增殖呈剂量依赖关系,对MSCs的促增殖作用在20μg/L达高峰。同时,PDGF-C促进VECs和MSCs的迁移能力,对MSCs迁移作用强于VECs。结论　PDGF-C可促进培养的VECs、MSCs的增殖与迁移能力。     

VEGF165正反义表达载体的构建及其对人胃癌细胞VEGF表达的调节

目的构建VEGF165(vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子)正、反义表达载体,将其转染人胃癌细胞,观察其对胃癌细胞VEGF在mRNA和蛋白质水平表达的调节作用.方法用限制性内切酶将VEGF165 cDNA从pGEM-hVEGF165克隆载体上切下来,以正、反方向插入质粒pCDNA3中,构建VEGF165正、反义真核表达载体;用限制性内切酶和Sanger双脱氧终止DNA测序法证明VEGF165正、反义表达载体目的基因的序列和方向的正确性;用脂质体将VEGF165正、反义表达载体转染人胃癌细胞,用RNA斑点杂交及免疫荧光流式细胞仪检测VEGF mRNA和蛋白质的表达水平.结果酶谱分析及DNA测序表明VFGF165正、反义真核表达载体目的基因的序列及方向正确;转染正义表达载体后VEGF mRNA和蛋白质表达水平增加(蛋白免疫强度为75.4%;P＜0.05vs对照组,31.6%),转染反义表达载体后VEGF mRNA和蛋白表达水平降低(蛋白免疫强度为8.9%;P＜0.05vs对照组).结论成功地构建了VEGF165正、反义真核表达载体;构建的载体能在胃癌细胞内有效表达,调节血管内皮生长因子的水平.     

hSp17真核表达载体构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的构建人精子蛋白17（hSp17）基因的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/hSp17,为其临床应用奠定基础。方法用PCR方法获取hSp17基因片段,NheⅠ、KpnⅠ双酶切、粘端连接的方法构建含有hSp17基因的pcD-NA3.1（＋）/hSp17真核表达载体。将该载体行脂质体介导转染卵巢癌细胞HO8910,免疫细胞化学方法检测转染细胞hSp17蛋白表达,G418筛选稳定表达hSp17蛋白的细胞株。结果酶切和测序结果均证实pcDNA3.1（＋）/hSp17重组质粒的构建完全正确。免疫细胞化学方法证实外源性hSp17基因能够在卵巢癌HO8910细胞瞬时表达。经G418连续筛选,得到阳性克隆细胞株,并证实了外源性hSp17基因在卵巢癌HO8910细胞中稳定表达。结论成功构建了稳定表达外源性hSp17蛋白的卵巢癌细胞株;其可为卵巢癌的免疫治疗奠定基础。     

VEGF121和BMP2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及其在HEK293中的表达

目的构建人血管内皮生长因子121（VEGF121）与人骨形态发生蛋白2（BMP2）双基因共表达腺病毒载体Adv-BMP2-IRES-VEGF121,并观察其在人胚肾细胞株（HEK293）中的表达情况。方法对腺病毒质粒pShuttle-CMV-BMP2的目的基因BMP2进行PCR扩增。腺病毒质粒pShuttle-CMV-VEGF121-IRES-hrGFP-1经Kpn I/Xba I酶切后,将BMP2片段定向导入pShuttle-CMV-VEGF121-IRES,构建pShuttle-CMV-V EGF121-IRES-BMP2,并注入大肠杆菌DH5a中扩增,提取质粒。通过酶切分析、PCR检测和序列分析进行鉴定。将构建所得的质粒转染HEK293,采用RT-PCR法检测HEK293中的BMP2、VEGF121 mRNA,Western blot法检测其蛋白。结果成功构建了Adv-BMP2-IRES-VEGF121。酶切分析及DNA序列测定证实重组质粒构建正确。质粒转染后的HEK293 BMP2和VEGF121表达阳性。结论成功构建了Adv-BMP2-IRES-VEGF121,其转染HEK293后,VEGF121、BMP2在HEK293中共表达阳性。     

人ZEB1基因真核表达载体的构建及其对肝癌细胞株HepG2增殖凋亡的影响

目的：探讨ZEB1基因与肝癌的关系,进一步揭示ZEBl基因在肝癌发生发展过程中的作用。方法：利用基因重组技术构建pCI-neo-ZEB1真核表达载体：脂质体介导转染技术转染肝癌细胞系HepG2。采用WesternBlot技术检测重组质粒的转染效率,CCK8比色法测定重组质粒转染对HepG2细胞体外增殖能力的影响,流式细胞术检测重组质粒转染后HepG2细胞凋亡率。结果：重组质粒经Nhel和Xbal双酶切、测序与ZEBl基因序列一致;利用脂质体介导将pCI-neo-ZEB1重组质粒转染HepG2细胞株,经WesternBlot技术检测ZEB1基因在蛋白水平稳定高表达;与对照组比较,人HepG2细胞株转染pCI-neo-ZEB1真核表达载体后细胞增殖能力增强,细胞凋亡率明显降低。结论：成功构建重组质粒Pci-neo-ZEB1并转入肝癌细胞株HepG2后,细胞增殖能力增强,凋亡减少。     

MicroRNAs与骨质疏松症研究

MicroRNAs（miRNAs or miRs）为一种新的基因调控机制,MicroRNAs是由22个核苷酸组成的内源性非编码小分子RNA,调节蛋白翻译和mRNA的稳定。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）分化异常与骨质疏松症的发生有着密切关系。最近研究发现miRNAs在MSCs分化过程中发挥着重要的调控作用,但具体调控机制尚未完全阐明。进一步深入研究miRNAs在MSCs中的作用,全面了解MSCs分化的机制,对骨质疏松症的预防和治疗有重要意义。