多药耐药相关基因及其蛋白在介导胰腺癌细胞原发性耐药中的作用及调控

目的 检测多药耐药相关基因（MDR1）及其蛋白（P-gP）在胰腺癌细胞株的表达,初步探讨胰腺癌发生先天性耐药的机理。方法 选择8株人胰腺癌细胞株,采用RT-PCR方法检测MDR1mRNA在胰腺癌细胞中的表达;通过免疫细胞化学方法检测P-gP的表达;以流式细胞仪检测胰腺癌细胞对罗丹明的外排情况,评价P-gP泵功能;最后通过P-gP抑制物维拉帕米与化疗药物联合应用,检测其对胰腺癌细胞的杀伤作用。结果 MDR1mRNA在胰腺癌细胞株SW1990中的表达最高,除PCT-2未检测到MDR1的表达外,其余6株细胞均有MDR1的微弱表达;免疫细胞化学染色结果证实P-gP在SW1990中的表达明显高于其他细胞株。57．9％±5．4％的SW1990细胞内有罗丹明蓄积,而在P-gP阴性对照细胞中,99．5％±3．3％的细胞内存在罗丹明的积聚,两者差异有统计学意义（P〈0．05）。P-gP抑制物维拉帕米与阿霉素或表阿霉素联合应用时可以部分逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。结论 MDR1及P-gP在人胰腺癌细胞中存在一定量的表达;维拉帕米联合阿霉素可以明显抑制P-gP阳性细胞的生长。     

胰腺癌阿霉素耐药细胞株SW1990/ADM的建立及其耐药机理研究

目的　建立人胰腺癌阿霉素 (ADM )耐药细胞株SW 1990 /ADM ,探讨其耐药机理。方法　采用ADM体外浓度梯度倍增法诱导培养人胰腺癌细胞株SW 1990 10个月 ,获得耐药细胞株SW 1990 /ADM ,脱药培养 2个月后检测其生物学性状、药物敏感性及多药耐药基因mdr1的功能及表达情况。结果　与亲本细胞株SW 1990相比 ,SW1990 /ADM在形态学上发生了一系列变化 ;对包括ADM在内的多种化疗药物均表现出一定的耐药性 ,其对ADM、丝裂霉素、氟尿嘧啶和健择的耐药指数分别达到 4 9.6 0、7.2 5、3.80和 1.2 5 ;其mdr1mRNA的表达亦明显高于亲本细胞株SW 1990 (P<0 .0 1)。结论　体外浓度梯度倍增法可建立稳定传代的人胰腺癌耐药细胞株SW1990 /ADM。其耐药性与mdr1的表达呈正相关。     

利用新型载体运转MDR1 siRNA以逆转胰腺癌化疗耐药性的研究

目的:以新型载体运转MDR1 siRNA导入胰腺癌细胞株后,观察其多药物耐药基因(MDR1)的表达及其对胰腺癌化疗耐药性的影响。方法:采用RNA干扰技术,构建可用于包装成自我复制rAAV病毒载体的质粒,以运转不同长度的MDR1 siRNA。采用实时PCR检测MDR1 mRNA的表达,Western印迹法检测总P-糖基化蛋白(P-gp)的表达水平,用流式细胞仪检测细胞表面的P-gp表达,并从不同层面检测胰腺癌细胞株P-gp表达的抑制率,从而筛选出最佳的质粒载体。采用MTT检测IC50值,进行各载体逆转胰腺癌细胞株化疗耐药性的研究。结果:拟用于构建自我复制rAAV病毒载体的25-mer MDR1 siRNA质粒能有效地将目的基因MDR1 siRNA导入胰腺癌细胞株,并予稳定的表达,发挥作用。导入胰腺癌细胞株的MDR1 siRNA能有效地在mRNA水平上沉默MDR1基因,显著抑制其表达,使其蛋白产物P-gp的表达明显减少,及其在细胞膜上的数量显著降低。结果能有效、显著地逆转胰腺癌细胞株的化疗耐药性,转染前SW1990/ADM细胞对ADM的IC50值约是转染后的50倍。结论:采用可用于构建新型sc-rAAV载体的质粒作为投递siRNA的工具,并选择MDR1为研究靶点,通过实验证实该策略在逆转胰腺癌化疗耐药性中的有效性。     

胰腺癌耐药细胞株SW1990/Fu产生获得性耐药机制的研究

目的探讨胰腺癌耐药细胞株SW1990/Fu产生获得性耐药的可能机制。方法以体外诱导建立的人胰腺癌耐药株SW1990/Fu为模型,通过逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学(ICC)方法测定耐药相关基因在SW1990/Fu产生获得性耐药前后的变化;罗丹明外排实验检测SW1990/Fu细胞膜上的P-gp泵功能。结果RT-PCR结果显示多药耐药基因1(MDR)和肺耐药相关蛋白基因(LRP)在SW1990/Fu中的表达率分别为0.97±0.23和0.95±0.34,而在SW1990中的表达率仅分别为0.67±0.19和0.53±0.16,两者差异有统计学意义(P<0.05);多药耐药相关基因(MRP)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST-π)在2株细胞中的表达水平无明显变化。ICC与RT-PCR的结果一致。在罗丹明浓度为0.5mg/L时,只检测到(11.4±2.5)%的SW1990/Fu细胞内有荧光染科积蓄,在亲本细胞中罗丹明阳性细胞为(57.9±5.4)%,而在P-gp阴性的HL60细胞中,(99.5±3.3)%的细胞内存在罗丹明的积聚。当罗丹明浓度增加时,其在SW1990/Fu细胞内的积聚也明显增加。结论耐药基因MDR1和LRP表达增强可能是胰腺癌耐药细胞株SW1990/Fu产生获得性耐药的主要机制。     

葡萄糖神经酰胺合成酶基因在人胰腺癌细胞SW1990及其耐药亚株中的表达和意义

目的探讨葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase,GCS）基因在人胰腺癌细胞SW1990及其耐药亚株中的表达和意义。方法体外培养人胰腺癌细胞SW1990和其耐药亚株SW1990／FU、SW1990／ADM、SW1990／GEM,以细胞活性测定（CCK-8法）检测耐药亚株的耐药指数,相对定量荧光实时PCR（RT—PCR）法检测GCS mRNA的表达,免疫印迹法检测GCS蛋白表达水平。结果与亲本株相比,SW1990／FU、SW1990／ADM、SW1990／GEM的耐药指数分别为339．7、11．9、56．6。RT—PCR和免疫印迹检测结果显示亲本株和耐药亚株均有GCS mRNA和蛋白的表达,GCS mRNA在3株耐药亚株中的表达均比亲本株有增高趋势,且SW1990／ADM、SW1990／GEM的GCS蛋白表达水平较亲本株升高,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论GCS基因在人胰腺癌细胞株SW1990和其3株耐药亚株中表达阳性,GCS蛋白在SW1990／ADM、SW1990／GEM中呈高表达,表明GCS可能参与胰腺癌耐药株细胞对ADM、GEM的耐药。     

胰腺癌细胞株耐药与凋亡相关基因的改变

目的探讨凋亡相关基因的改变与胰腺癌细胞耐药的关系。方法利用含有18000条人类基因的cDNA基因芯片对人胰腺癌细胞株SW1990及其耐药细胞亚株SW1990/FU和SW1990/ADM间的差异表达基因进行筛选。结果人胰腺癌细胞株SW1990与耐药细胞亚株SW1990/FU和SW1990/ADM间的共同差异表达基因有170条,其中6条与细胞凋亡相关。结论凋亡相关基因hSiah2、TIA1、CDC2、PDCD2、MAPK6及MAP4K3可能参与了胰腺癌耐药过程的发生,可能成为新的胰腺癌耐药相关基因。     

人结肠癌耐药细胞系SW480/ADM的建立及其生物学特性

目的　建立人结肠癌SW4 8 0耐阿霉素细胞系 (SW4 8 0 /ADM) ,研究其耐药机制及逆转。方法　应用人结肠癌细胞系SW4 8 0,以递增阿霉素 (ADM)浓度的方法,体外连续培养建成一株SW4 8 0 /ADM。观察该细胞生长规律。用MTT比色法检测该耐药细胞系的多药耐药性;以流式细胞术检测该耐药细胞的细胞周期分布、细胞表面多药耐药基因 (MDR)的表达产物P-糖蛋白 (P gp) 、多药耐药相关蛋白 (MRP)及谷胱甘肽硫转移系统 (GSH/GST)的表达;用高效液相色谱仪检测耐药细胞内阿霉素含量。结果　SW4 8 0 /ADM细胞与SW4 8 0细胞相比,生长缓慢,倍增时间延长,细胞周期分布发生改变;SW4 8 0 /ADM细胞较SW4 8 0的阿霉素半数抑制浓度 (IC50 )增大 1 3. 2 2倍,并对多种抗癌药物产生耐药性。SW4 8 0 /ADM细胞表面MDR的表达产物P gp,MRP和GSH/GST的表达均较SW4 8 0细胞显著升高 (P< 0. 0 1 )。SW4 8 0 /ADM细胞内阿霉素含量明显低于SW4 8 0细胞。结论　SW4 8 0 /ADM细胞对阿霉素的耐药是获得性的,并呈多药耐药性特征,可用于对人结肠癌耐药、逆转和MDR机制等方面的研究。     

DJ-1 shRNA靶向逆转人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADM的耐药性

目的探讨干扰癌基因DJ-1表达对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADM多药耐药性(multi-drug resistence,MDR)的影响。方法将构建的DJ-1 shRNA真核表达载体,用脂质体转染至人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADM;用RT-PCR和Western blot法分别检测细胞MDR 1 mRNA和P-糖蛋白(P-glycopro-tein,P-gp)的表达;MTT法检测细胞对化疗药物的敏感性。结果 DJ-1 shRNA靶向干预MCF-7/ADM细胞DJ-1表达后,DJ-1 shRNA组细胞MDR 1 mRNA和P-gp表达水平较空白与阴性对照组明显下降(P0.0 1);细胞内Adriamycin浓度明显增加;细胞对Adriamycin的敏感性增强2.6 8倍。结论 DJ-1shRNA可降低乳腺癌MCF-7/ADM细胞的MDR,为研究逆转乳腺癌化疗耐药提供了新方法。     

耐药胰腺癌细胞株对放射敏感性影响的初步探讨

目的初步探讨耐药胰腺癌细胞株的耐药性对其放射敏感性的影响。方法选取人胰腺癌细胞株SW1990经氟尿嘧啶（5-FU）、阿霉素和吉西他滨诱导后建立三株耐药细胞亚株（SW1990／FIL1、SW1990／ADM、SW1990／GZ）,通过流式细胞仪及直线加速器照射后进行细胞周期及放射生物学相关参数检测。结果细胞周期分析显示,与亲本株SW1990相比,SW1990／FU与SW1990／Gz的Go／G。期比例增高,G2／M期比例明显降低;SW1990／ADM各细胞周期百分比变化不大。集落实验结果表明,与亲本株SW1990相比,SW1990／FU及SW1990／GZ的存活分数（sir2）分别升高26．9％（P＜0．01）和14．4％（P＜0．01）,差异有统计学意义;SW1990／ADM的sir2升高1．1％,差异不明显。结论耐药胰腺癌细胞株的耐药性对其放射敏感性具有一定影响,胰腺癌耐药细胞株放射敏感周期G2／M期比例降低,从而导致其放射敏感性降低,耐放射性增加。     

胰腺癌多药耐药细胞株BxPC-3/ADM的建立及耐药机制的初步探讨

目的 构建胰腺癌多药耐药细胞株BxPC-3/ADM,通过动态监测诱导耐药过程,探讨其耐药的可能机制.方法 逐步增加阿霉素浓度对BxPC-3细胞进行诱导,在不同的阿霉素诱导浓度,MTT法检测细胞对多种化疗药物的耐药指数,RT-PCR和Western印迹法检测细胞MDR1和MRP mRNA和蛋白的表达.结果 成功构建多药耐药细胞株BxPC-3/ADM;在0.05 μg/ml至8 μg/ml阿霉素诱导浓度,细胞对5-Fu、MMC和Gem的耐药指数无明显增加;在16 μg/ml浓度3种化疗药物的耐药指数有较明显上升,同时伴有MDR1 mRNA表达的明显增加;至32 μg/ml 5-Fu和Gem的耐药指数未再有继续上升,而MMC的耐药指数则继续上升,同时MDR1 mRNA表达未再增加,而MRP mRNA表达则明显增加.Western印迹实验显示MDR1和MRP蛋白表达变化与mRNA表达变化趋势一致.结论 MDR1基因在诱导早期的耐药中起主导作用,在后期则和MRP基因协同发挥作用.     

人膀胱癌多重抗药性逆转的实验研究

为探讨膀胱癌多重抗药性逆转机理，应用阿霉素（ＡＤＭ）大剂量短暂冲击结合低浓度持续递增法，获得了具有多重抗药性的ＢＩＵ８７Ｒ／ＡＤＭ细胞。通过测定细胞内ＡＤＭ聚积量和钙离子浓度，发现ＢＩＵ８７Ｒ／ＡＤＭ细胞内ＡＤＭ聚积量显著低于ＢＩＵ８７细胞（Ｐ＜００５）；维拉帕米（ＶＰＬ）、奎宁能使ＢＩＵ８７Ｒ／ＡＤＭ细胞内ＡＤＭ聚积量增加（Ｐ＜００５），两者协同应用基本上可逆转ＢＩＵ８７Ｒ／ＡＤＭ细胞的抗药性。结果表明：（１）细胞内ＡＤＭ聚积量减少是抗药细胞的重要变化，在细胞抗药性发生机理中可能起主导作用，（２）ＶＰＬ、奎宁能逆转ＢＩＵ８７Ｒ／ＡＤＭ细胞的抗药性，可能与增加细胞内ＡＤＭ聚积量有关，与钙通道无关。     

肝细胞癌SMC7721体内外多药耐药模型的建立及其耐药机制

目的 建立肝细胞癌SMC7721体内外多药耐药细胞株并探讨其耐药机制.方法 通过阿霉素浓度递增筛选出SMC7721/ADM肝癌多药耐药细胞株并建立裸鼠移植瘤模型;噻唑蓝(MTr)检测各组移植瘤对化疗药物的耐药性;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测MDR1和BCRP在各组移植瘤中的表达.结果 SMC7721/ADM对阿霉素,丝裂霉素,5-Fu的耐药性均较亲本细胞明显降低(P<0.01);其移植瘤对3种化疗药物的IC50.均明显低于亲本细胞(P<0.05);SMC7721/ADM细胞中MDR1 mRNA表达是亲本细胞的40.13倍(P<0.01);BCRP mRNA表达与亲本细胞差异无统计学意义(P>0.05).其移植瘤中BCRP mRNA表达是亲本细胞移植瘤的3.69倍(P<0.01);而MDR1 mRNA表达与亲本细胞差异无统计学意义(P>0.05);SMC7721/ADM细胞株中两种蛋白表达显著高于亲本细胞株(P<0.01);SMC7721/ADM移植瘤中BCRP蛋白表达显著高于亲本移植瘤(P<0.01),而两者中MDR1表达差异无统计学意义(JP>0.05).结论 MDR1和BCRP在SMC7721/ADM多药耐药的不同阶段起作用并介导肝细胞癌对不同药物的耐药性.     

槐耳清膏体外逆转人肝癌细胞HepG2/ADM多药耐药性

目的探讨槐耳清膏体外逆转人肝癌细胞多药耐药性的作用及可能的机制。方法MTT法检测槐耳清膏的细胞毒作用和处理前后耐药细胞对化疗药物的敏感性;流式细胞仪检测细胞内阿霉素浓度;RT-RCR检测MDR1基因的表达。结果槐耳清膏在0.01g/L以下剂量时对HepG2和HepG2/ADM耐药细胞株的抑制率均<10%,半数抑制率(IC_(50))分别为0.917 g/L和1.66 g/L,无细胞毒剂量即0.008 g/L的槐耳清膏能部分逆转HepG2/ADM细胞的耐药性,与之合用使耐药肝癌细胞对阿霉素、顺铂、丝裂霉素、氟尿嘧啶的相对逆转效率分别为79%、73.5%、97.4%和86.7%,HepG2/ADM细胞内阿霉素浓度明显增加,MDR1表达下降了33.7%。结论槐耳清膏具有体外逆转人肝癌细胞多药耐药性的作用,可能与下调MDR1表达、增加细胞内化疗药物积累有关。     

人肝癌HepG2多药耐药细胞系的部分生物学性状研究

目的　研究人肝癌多药耐药 (MDR)的机制 ,建立HepG2多药耐药细胞系并研究其部分生物学性状。方法　应用HepG2细胞系 ,通过培养液中阿霉素 (ADM )的浓度梯度增加法 ,得到肝癌多药耐药株HepG2 /ADM。Westernblot增强化学发光法 (ECL)检测细胞株表面多药耐药基因(MDR1)的表达产物P 糖蛋白 (P 170 )、多药耐药相关蛋白 (MRP)及肺耐药蛋白 (LRP)的表达水平。结果　耐药细胞的倍增时间延长 2 .0 5倍。该耐药模型的P 170表达水平较亲本细胞升高3 .90倍 (P <0 .0 1) ,但MRP及LRP无明显变化。结论　HepG2 /ADM同其亲本细胞相比 ,其耐药性、倍增时间有明显改变 ;多药耐药性主要与MDR1的高表达有关。     

乙型肝炎病毒X蛋白上调肝癌多药耐药相关基因表达的研究

目的　研究乙型肝炎病毒 X蛋白 (HBX)对肝癌耐药相关基因 MDRI,MRP1 ,MRP2 3,MRP3,L RP的影响从而探讨 HBX基因影响肝癌多药耐药性状的分子机制。方法　应用脂质体介导技术对人肝癌细胞株 Hep G2瞬时转染 HBX基因 ,然后用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)和 Westernblot技术分别检测转染后多药耐药相关基因和蛋白水平的表达情况。再使用 MTT检测阿霉素及丝裂霉素诱导后细胞存活率的变化。结果　转染前后相比 ,转染 HBX基因的 Hep G2细胞多药耐药相关基因和蛋白表达水平比转染前均明显上调 (P<0 .0 5 )转染后 PRP1基因表达量与转染前比为 3.1 1 ,PRP2为 1 .6 9,L RP3为 1 .4 6 ,MDR1为 3.6 4 ,L RP为 1 .90。 Westernblot显示转染后 L DR1蛋白水平上升 1 .1 0倍 ,MRP1蛋白上升 1 .2 8倍 ,L RP蛋白上升 1 .0 8倍。MTT结果显示阿霉素和丝裂霉素 IC50 转染组明显高于对照组。结论　乙型肝炎病毒 X蛋白可能促进肝癌多药耐药的产生     

单基因人肝癌耐药细胞株(HepG2/MRP1)的构建及其生物学意义

目的 对抗肿瘤药的天然耐药和化疗过程中产生的继发性耐药是肝癌化疗敏感性差的重要原因之一,为探讨体外逆转肝癌多药耐药(muhidrug resistance,MDR)的新方法,笔者建立了单因素人肝癌细胞多药耐药模型HepG2/mrp1,并研究其牛物学特性.方法 双酶切克隆质粒pGEMmrp1获得人全长多药耐药相关蛋白基因(mrp1),并将其插入哺乳动物表达载体pCI-neo的多克隆位点,构建重组载体,利用质脂体法将重组载体转入人肝癌细胞HepG2,建立单基因耐药细胞株HepG2/mrp1.观察细胞的生长规律;MTT法检测其多药耐药性;流式细胞仪检测细胞表面多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)的表达;RT-PCR检测MRP1 mRNA表达量.结果 与HepG2细胞相比较,HepG2/mrp1细胞的倍增时间延长30.86 h.该细胞对多种抗肿瘤药耐药,HepG2/mrp1对阿霉素和柔红霉素的耐药指数比亲本细胞增加了11.4倍和8倍,细胞表面MRPl的表达明显增加,mrp1 mRNA明显增加.结论 HepG2/mrp1细胞稳定高表达MRP1,具有多药耐药性,为进一步研究肝癌的多药耐药构建了一个技术平台.