表达轮状病毒VP7基因重组腺病毒载体的构建及免疫活性研究

目的 包装表达轮状病毒VP7基因的重组腺病毒,并检测其免疫活性.方法 RT-PCR扩增病毒结构蛋白VP7基因,定向克隆于腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV中,在细菌中与缺陷型腺病毒基因组pAdeasy-1进行同源重组,并用RT-PCR和Western blot检测.将包装好的腺病毒免疫小鼠,应用间接ELISA检测小鼠血清中特异性轮状病毒IgG抗体.结果 酶切和测序鉴定证实成功构建携带VP7基因的重组腺病毒表达载体,并在293细胞中成功包装病毒;RT-PCR和Western blot 均能特异检测VP7基因的表达;重组腺病毒免疫小鼠后可诱导针对轮状病毒的特异性免疫.结论 重组腺病毒的成功包装,为新型轮状病毒基因疫苗的研制提供了一种可行的途径.     

轮状病毒组特异性抗原VP6在重组腺病毒中的表达及其免疫学效果的研究

目的 构建可表达A组轮状病毒组特异性抗原VP6的非复制型重组腺病毒载体，并对其生物学和免疫学性质进行研究。方法 将人轮状病毒VP6基因插入腺病毒载体pShuttle-CMV中，通过细胞内同源重组方法获得重组腺病毒DNA，将其转染293细胞获得重组腺病毒。用聚合酶链反应（PCR）及Southern blot方法，检测目的基因在重组腺病毒中的整合，用Western blot检测VP6的表达。通过灌胃和滴鼻两种途径对小鼠进行免疫，并对免疫后小鼠体液和粘膜免疫进行分析。结果 得到了重组腺病毒rvAd-VP6,VP6基因整合于腺病毒基因且中，在293细胞中可稳定表达。2次免疫后灌胃和滴鼻两组小鼠均产生明显免疫应答，血清IgG抗体滴度分别为1：1000和1：10000－1：100000。除了血清IgG外，小鼠还产生了较强的针对轮状病毒的血清IgA，滴度为1：10－1：100。滴鼻组在肺灌洗液和肠匀浆液中均可检测到分泌型IgA(sIgA)，灌胃组仅在肠道检测到sIgA。滴鼻组的免疫学效果明显优于灌胃组。结论 人轮状病毒VP6基因重组腺病毒载体的成功构建及所取得的良好免疫学效果，为我国具有自主知识产权的新型轮状病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

腺病毒载体表达轮状病毒G1型外壳蛋白VP7及其诱导的免疫应答研究

构建表达地方流行株轮状病毒G1型外壳蛋白VP7的复制缺陷型重组腺病毒,免疫小鼠评价其体液及细胞免疫反应效果,探讨基因工程轮状病毒疫苗的实验基础及可行性。RT-PCR扩增轮状病毒VP7基因并克隆至pshuttle-CMV穿梭质粒,pshuttle-VP7与腺病毒骨架质粒同源重组后转染293细胞包装重组腺病毒rAd-VP7。RT-PCR、western blot检测rAdVP7在体外细胞中的转录及表达。rAd-VP7经肌注或滴鼻免疫小鼠后检测其血清IgG、肠道IgA及中和抗体效价;流式、ELISPOT检测淋巴细胞亚群变化及IFN-γ分泌情况。结果显示ELISA可检测到免疫小鼠血清IgG和滴鼻组肠道IgA抗体的产生;肌注和滴鼻免疫组中和抗体平均滴度分别为228和322.5;免疫小鼠脾细胞IFN-γ的分泌增加。表达轮状病毒VP7的重组腺病毒不但能够激发体液及细胞免疫反应,滴鼻免疫途径还可诱导粘膜免疫应答。     

密码子优化提高重组腺病毒中人轮状病毒G1VP7和G3VP7基因的表达量

目的 通过密码子优化提高重组腺病毒中人轮状病毒G1VP7和G3VP7基因的表达量.方法 人工合成按照人的优势密码子优化的人轮状病毒G1VP7和G3VP7基因,包装重组腺病毒后,与未优化的相同基因的重组腺病毒用Western Blot方法比较其表达量.结果 密码子优化的人轮状病毒G1VP7和G3VP7基因,与未优化的相同基因的重组腺病毒比较,其蛋白表达量大大提高.结论 密码子优化确实提高了重组腺病毒中人轮状病毒G1VP7和G3VP7基因的表达量,可望满足腺病毒载体疫苗的研发需要.     

轮状病毒抗原蛋白G3VP7基因在花生中遗传转化的研究

为提高外源蛋白的表达量和简化分离纯化过程,使用植物油体表达载体,以花生子叶节为转化受体,通过农杆菌介导将轮状病毒抗原蛋白G3VP7基因开展遗传转化的研究。从转化植株中随机选取11株表现Kan抗性植株进行PCR检测,结果有6株能扩增出特异性条带,阳性率为54.5%。对转基因植株进一步进行PCR-Southern杂交分析,发现转基因植株中有6株PCR反应呈阳性,其中有3株PCR-Southern杂交有特异性目标带出现。结果表明,外源基因已经整合到了花生基因组上。该研究为以植物为载体生产廉价、高效的植物口服疫苗奠定了基础。     

人轮状病毒抗原非复制型重组腺病毒黏膜免疫效果的研究

目的：对人轮状病毒抗原非复制型重组腺病毒诱导黏膜免疫的效果进行初步评价。方法：用表达轮状病毒VP7、VP6基因的3株重组腺病毒rvAdG1VP7(G)、rvAdG1VF7和rvAdVP6，分别通过灌胃和滴鼻两种途径对BALB／C小鼠进行2次免疫后，对肺灌洗液和肺、肠粘膜组织匀浆液中轮状病毒特异性的分泌型IgA(secretory IgA，SIgA)和local-IgG进行检测。结果：对肺灌洗液中特异性SIgA进行检测，发现滴鼻组的免疫学效果明显优于灌胃组。对肺、肠组织匀浆液中特异性IgA的分析表明，灌胃途径刺激异位粘膜组织产生免疫应答的能力较弱。对rvAdVP6滴鼻组小鼠肺灌洗液(1：20)特异性local-IgG和SIgA的阳转率进行比较，发现特异性local-IgG的应答水平明显高于特异性SIgA。结论：重组腺病毒可有效诱导针对轮状病毒的黏膜免疫。此研究为轮状病毒基因工程疫苗的免疫方案、免疫途径及免疫保护作用等的进一步研究莫定了基础。     

轮状病毒VP7基因的克隆与表达

目的构建轮状病毒VP7的重组表达质粒，在大肠杆菌中对其进行表达。方法克隆编码轮状病毒VP7的基因，并在原核表达系统中表达了带有6xHis标签的融合蛋白。结果经双酶切鉴定和基因测序证明成功重组了轮状病毒VP7基因的pQE-30重组质粒；蛋白质PAGE电泳表明，获得了分子量约为48000Mr的蛋白质。结论本研究获得了重组的轮状病毒VP7蛋白。     

G1型轮状病毒中和抗原VP7基因变异特点

目的 研究我国G1型轮状病毒主要中和抗原VP7基因的变异特点。方法 对1988-1998年收集自北京、沈阳、新乡、上海、深圳、广州、重庆等7个城市的23份G1型轮状病毒毒株VP7cDNA序列进行测定,并结合核酸电泳带型和G1型单抗的ELISA检测结果分析VP7基因的变异特点。结果 我国G1型轮状病毒VP7变异有一定规律,主要集中在aa41、49、57、65、68、74、94、97、147、170、217、218、268、281、291,即VR3-5、VR7-8以及多肽C端的部分区域内,各地区之间没有明显差别,虽然随时间不同个别氨基酸可能发生替换,但仍同属Jpn-417支系;aa91位可能参与构成G1型VP7的抗原表位,某些位点的氨基酸变异可能与核酸带型改变有关。结论 在研制疫苗时,应采用基因和抗原性具有代表性的近期毒株,同时定期监测抗原性的改变。     

汉滩病毒G2重组腺病毒的表达及其基因免疫的研究

目的:在VeroE6细胞中表达汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白G2重组腺病毒(AdenoG2),并探讨其诱导免疫应答特性。方法:以HTNVAdenoG2病毒原种(滴度约1×1013pfu/L)感染VeroE6细胞,用IFA法检测其表达产物。以表达产物免疫BALB/c小鼠后,用ELISA、微量细胞培养中和试验及淋巴细胞增殖试验检测体液及细胞免疫应答。结果:用HTNVAdenoG2感染VeroE6细胞后,可检测到HTNV糖蛋白G2的表达。用HTNVAdenoG2免疫小鼠后,可诱导产生抗HTNV糖蛋白G2的特异性抗体,抗体效价为1∶40。微量细胞培养中和试验的结果表明,HTNVAdenoG2还可刺激小鼠产生低水平的中和抗体;但淋巴细胞的增殖反应不明显。结论:在VeroE6细胞中成功地表达了HTNV糖蛋白G2。以HTNVAdenoG2免疫小鼠后,主要刺激小鼠产生特异性的抗HTNV体液免疫应答,而特异性的细胞免疫应答不明显。本研究结果为HTNV基因工程疫苗的研制提供了实验依据。     

密码子优化提高重组腺病毒中人轮状病毒VP6基因表达量的研究

目的 通过密码子优化提高重组腺病毒中人轮状病毒VP6基因的表达量.方法 人工合成按照人的优势密码子优化的人轮状病毒VP6基因,包装重组腺病毒后,与未优化的相同基因的重组腺病毒用免疫荧光和Western Blot方法比较其表达量.结果 密码子优化的人轮状病毒VP6基因,与未优化的相同基因的重组腺病毒比较,其蛋白表达量大大提高.结论 密码子优化确实提高了重组腺病毒中人轮状病毒VP6基因的表达量,可望满足腺病毒载体疫苗的研发需要.     

VP7 gene polymorphism of serotype G9 rotavirus strains and its impact on G genotype determination by PCR

Rotaviruses are the single most important etiologic agents of severe diarrhea of infants and young children worldwide. Surveillance of rotavirus serotypes/genotypes (both VP7[G] and VP4[P]) is in progress globally in which polymerase chain reaction (PCR) has been the assay of choice. We investigated polymorphism of the VP7 gene of serotype G9 rotavirus strains and its impact on the determination of VP7 gene genotype by PCR assay. By VP7 gene sequence analysis, we and others have previously shown that the G9 rotavirus strains belong to one of three VP7 gene lineages. By PCR assay using three different sets of commonly used primers specific for G1-4, 8 and 9, 23 Brazilian G9 strains and 5 well-characterized prototype G9 strains which collectively represented all three VP7 gene lineages were typed as: (i) G3; (ii) G4; (iii) G9; (iv) G3 and G9; or (v) G9 and G4 depending on a primer pool employed. This phenomenon appeared to be due to: (i) a VP7 gene lineage-specific polymorphism, more specifically mutation(s) in the primer binding region of the VP7 gene of G9 strain; and (ii) the magnitude of difference in nucleotide homology at respective primer binding site between homotypic (G9) and heterotypic (G3 or G4) primers present in a primer pool employed.     

中国部分城市A组轮状病毒感染状况调查及VP7血清型分析

目的 研究我国A组轮状病毒感染状况及VP7血清型分布。方法 利用PAGE电泳检测北京、沈阳、新乡、上海、深圳、广州六个城市1997和（或）1998年秋冬季婴幼儿腹泻A组轮状病毒的感染状况,并采用RT－PCR方法对4种主要的VP7血清型（G1、G2、G3和G4型）进行分型。结果 374份标本中有181份为轮状病毒阳性,检出率48．4％。各地标本的检出率为32％－63％之间,北京、上海地区两年的检出率基本近似。阳性标本经PCR分型方法鉴定G1、G2、G3和G4型的感染率分别为89．5％、6．1％、2．8％和0。有两例为G1和G2型混合感染,另有1例经测序证实为G9型。各地之间、每年之间RV的流行状况略有差异。结论 G1、G2、和G3型是我国A组轮状病毒感染的主要血清型。     

以Ad41为载体的轮状病毒VP6基因重组腺病毒的遗传稳定性研究

目的 对前期制备的以Ad41为载体的可表达A组轮状病毒VP6基因的非复制型重组腺病毒进行连续传代,观察其遗传稳定性,为进一步研发疫苗做准备.方法 在293TE7细胞上,对本室前期构建的重组腺病毒rvAd41-VP6 (o)连续传代14代,每隔2代通过PCR鉴定VP6(o)基因的插入,通过Western Blot技术鉴定目的蛋白的表达.结果 PCR分析表明,rvAd41-VP6(o)在连续传代的过程中,其基因组中都有特异性的VP6基因稳定整合;Western Blot证实了rvAd41-VP6 (o)可稳定表达VP6,这说明rvAd41-VP6(o)有较好的遗传稳定性.结论 重组腺病毒rvAd41-VP6 (o)在体外具有良好的生物学性质,可用于下一步动物免疫研究.     

Acrylamide concentration affects the relative position of VP7 gene of serotype G2 strains as determined by polyacrylamide gel electrophoresis

BACKGROUND: During the course of development and characterization of various rotavirus reassortants, we found that the relative position of the gene encoding neutralization and protective antigen VP7 of certain rotavirus strains in a PAGE gel was influenced by the concentration of acrylamide. OBJECTIVES: We investigated systematically various factors that affected the relative position of the rotavirus VP7 gene in a PAGE gel. STUDY DESIGN: We analyzed dsRNAs of selected rotavirus strains bearing G1, G2, G3 or G9 specificity by PAGE at varying concentrations of acrylamide. RESULTS: We demonstrated that the relative position of the VP7 gene of three G2 strains varied depending upon the concentration of acrylamide in a PAGE gel, which occurred not only in a homologous G2 virus gene background but also in a heterologous G3 virus gene background; and the VP7 gene bearing G1, G3, G4 or G9 specificity did not display this phenomenon when the PAGE running conditions were varied. CONCLUSIONS: The concentration of acrylamide in a PAGE gel was the major factor that influenced the relative position of the VP7 gene of G2 rotavirus strains (i.e., VP7 gene coding assignment by PAGE).     

The VP3 gene of human group C rotavirus

The complete nucleotide sequence of genome segment 4 from the human group C rotavirus (Bristol strain) was determined. Comparison of the nucleotide sequences of the genome termini with the consensus 5 and 3 terminal non-coding sequences of the human group C rotavirus genome revealed characteristic 5 and 3 sequence motifs. Human group C rotavirus genome segment 4 is 2, 166bp long and encodes a single open reading frame of 2,082 nucleotides (693 amino acids) starting at nucleotide 55 and terminating at nucleotide 2,136 giving a 3 untranslated region of 30 nucleotides. Alignment with the porcine group C VP3 equivalent gene showed the human gene is one amino acid longer, and that the proteins have 84.1% amino acid sequence identity. A conserved potential nucleotide binding motif shared with the porcine VP3 sequence was identified. Analogy with the group A rotaviruses suggested that the genome segment 4 encodes the group C rotavirus guanylyltransferase.