胰岛素生长因子结合蛋白-2 siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建针对胰岛素生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)的小干扰RNA(siRNA)表达载体,研究载体介导的RNAi技术对人U251脑胶质瘤细胞株中IGFBP-2表达的抑制作用。方法根据GenBank提供的IGFBP-2基因(NM-000597)核苷酸序列及siRNA的设计原则,设计合成4对带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,筛选得到576⁵94 nt、908594 nt、908⁹26 nt、938926 nt、938⁹56 nt 3个19 bp片段靶序列,同时随机组合出一条无关序列,应用限制性内切酶酶切和测序技术鉴定重组克隆。用脂质体介导转染人U251胶质瘤细胞株,采用RT-PCR和Western印迹方法检测细胞IGFBP-2 mRNA和蛋白表达。结果酶切筛选得到4个目的片段的阳性克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致。RT-PCR和Western印迹检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低U251细胞中IGFBP-2 mRNA和蛋白表达水平。结论成功构建载体介导的IGFBP-2靶向RNA干扰重组体,并能有效抑制U251细胞中IGFBP-2基因的表达。     

沉默Bmi-1基因表达对胃癌细胞BGC823衰老和转移的作用

目的:研究靶向Bmi-1 siRNA对胃癌BGC823细胞衰老和转移的作用.方法:设计Bmi-1的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后重组入pRNAT-U6.2载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人胃癌BGC823细胞,采用RT-PCR和Western blot分别检测Bmi-1基因mRNA和蛋白表达的变化.SA-β-Gal染色检测和细胞体外侵袭实验检测分析对细胞衰老和侵袭、转移的影响.结果:靶向Bmi-1基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pRNAT-U6.2载体,经测序分析,插入片段正确:RT-PCR和Western blot检测显示,Bmi-1基因的表达水平明显降低,其中以1 104-1 122 nt(GGAGGAGGTGAATGATAAA)为靶序列的siRNA沉默作用最佳,Bmi-1mRNA和蛋白表达几乎完全抑制.转染siRNA组的衰老细胞百分率显著升高、穿透Matrigel的细胞数显著下降,与未转染和转染空载体组比较差异有显著性(P<0.01).结论:抑制胃癌BGC823细胞Bmi-1基因表达,可以增加细胞的衰老和降低细胞侵袭、转移的能力.     

靶向Akt2基因RNA干扰重组表达载体的构建和测序

目的 利用RNA干扰技术,以Akt2为靶基因,设计并构建重组表达载体,并进行测序鉴定.方法 利用GenBank中已知Akt2的mRNA基因序列设计具有短发夹结构的两条寡核甘酸序列,经退火形成互补双链,与pGEM-T Easy载体进行连接,经蓝白筛选后以T7和SP6为引物进行PCR鉴定,对表达载体pRNAT-U6.2及亚克隆产物进行双酶切,将得到的基因及线性化的表达载体再次连接,利用PCR方法进行重组体的筛选鉴定并进行测序分析.结果 将合成的DNA序列克隆到表达载体上,经PCR扩增筛选鉴定和测序鉴定证实为所需序列.结论 Akt2靶向RNA干扰重组表达载体构建成功.     

腺相关病毒介导的小干扰RNA对大鼠肝星状细胞金属蛋白酶组织抑制因子-1及基质金属蛋白酶13表达的影响

目的 观察以腺相关病毒(AAV)为载体含有针对金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1具有较强抑制作用的小干扰RNA(siRNA)感染大鼠星状细胞系HSC-T6后TIMP-1及基质金属蛋白酶13(MMP13)的表达情况.方法 将对大鼠TIMP-1基因具有最强抑制作用的一对siRNA,在体外构建为短发夹siRNA表达载体后,将其包装为重组AAV-rAAV/siRNA-TIMP-1/neo并感染HSC-T6,于感染后4周及12周应用荧光定量PCR方法及Western blot方法分别检测TIMP-1及MMP13 mRNA及蛋白质表达情况.结果 经PCR、酶切及序列测定证实抑制作用最强的1对siRNA在体外构建的shRNA表达载体成功克隆.将重组质粒包装成病毒后感染HSC-T6细胞,与对照组细胞相比,rAAV/siRNA-TIMP-1/neo感染组在感染后4周及12周细胞TIMP-1 mRNA及蛋白质表达水平明显降低(P＜0.01),而MMP13 mRNA及蛋白质表达水平明显增高(P＜0.01).结论 化学合成的siRNA在短时期内可有效地抑制TIMP-1基因的表达,重组病毒rAAV/siRNA-TIMP-1/neo可长期有效地抑制TIMP-1基因表达.     

survivin基因靶向RNAi慢病毒载体的构建及意义

利用sidirect设计干扰stirvivin基因靶序列,合成回文DNA序列退火后克隆至vshRNA载体,双酶切电泳鉴定和测序分析及阳性克隆质粒抽提,慢病毒质粒DNA再转染293T细胞产生病毒,测定病毒滴度.转染A549细胞株,采用逆转录RT-PCR测定不同分组A549细胞中survivin mRNA.vshRNA载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析,证实插入序列与原序列一致,位置正确.靶向survivin基因的siRNA可以有效抑制survivin基因的表达,RNAi抑制效率＞90%.认为survivin基因的表达siRNA慢病毒载体的构建成功,为研究肺癌分子病因和基因治疗提供依据,为研究高表达Buryivin的其他肿瘤构建了新的平台.     

FasL基因siRNA真核表达载体的构建及意义

目的构建针对细胞凋亡基因FasL的小干扰RNA（siRNA）表达载体,探讨载体介导的RNA干扰技术用于肺间质纤维化基因治疗的可行性。方法依据siRNA靶序列的设计原则,以FasL mRNA为靶基因,合成两对编码短发卡结构的两条DNA序列,经退火合成DNA双链,再克隆至siRNA表达载体pSilencer2．0中,转化后进行PCR鉴定和DNA序列测定。将构建的载体用脂质体介导转染入人肺腺癌A549细胞株,采用实时荧光定量PCR法检测细胞FasL mRNA水平变化。结果成功构建发卡样FasL siRNA真核表达载体;其转染人肺腺癌A549细胞后,细胞FasL mRNA的表达水平显著下降。结论FasL siRNA真核表达载体能显著抑制人肺腺癌A549细胞FasL mRNA的表达;本研究为肺间质纤维化的基因治疗奠定了基础。     

ROCK-Ⅱ基因shRNA质粒表达载体的构建与鉴定

目的 构建表达Rho激酶(ROCK)-Ⅱ特异性siRNA的重组质粒.方法 按照Elbashir等设计原则和siRNA表达载体的要求,利用Ambion公司在线siRNA Tatget finder软件,设计带有BamH I、Bbs I酶切黏性末端、终止识别序列和LOOP环的shRNA,并将其克隆入载体pGPU6/GFP/Neo,构建成ROCK-Ⅱ特异siRNA重组质粒,然后进行酶切鉴定及基因测序.结果 设计的shRNA成功克隆入载体pGPU6/GFP/Neo,构建成ROCK-Ⅱ特异siRNA重组质粒,酶切鉴定及基因测序表明设计序列完全相符,目的 基因序列准确无误.结论 重组质粒构建成功,为今后体外或体内研究ROCK基因在脊髓损伤后的功能修复提供了一种有效的方法.     

RNA干扰对喉鳞癌Hep-2细胞增殖及VEG-C mRNA表达的影响

目的 观察载体介导的RNA干扰(RNAi)技术对人喉鳞癌Hep-2细胞增殖及其血管内皮生长因子C(VEGF-C)mRNA表达的影响. 方法 选择针对人特异性VEGF-C的小RNAi(siRNA)靶序列mRNA,分别设计、合成含有19 nt干扰序列的寡核苷酸(同时随机组合出一条对照序列),将两两互补的寡核苷酸经退火后所形成的序列克隆到pSuper-neo载体中构建重组体.脂质体法转染重组体至喉鳞癌Hep-2细胞,经G418筛选获得阳性克隆.用流式细胞仪检测细胞周期,RT-PCR检测其VEGF-C mRNA. 结果 转染VEGF-C靶向siRNA载体的Hep-2细胞生长减慢,S期细胞显著减少,VEGF-C表达水平明显下降. 结论 VEGF-C靶向RNAi重组体可显著抑制Hep-2细胞增殖及其VEGF-C mRNA的表达.     

RNA干扰对喉鳞癌Hep-2细胞增殖及VEGF-C mRNA表达的影响

目的观察载体介导的RNA干扰（RNAi）技术对人喉鳞癌Hep-2细胞增殖及其血管内皮生长因子C（VEGF-C）mRNA表达的影响。方法选择针对人特异性VEGF-C的小RNAi（siRNA）靶序列mRNA,分别设计、合成含有19 nt干扰序列的寡核苷酸（同时随机组合出一条对照序列）,将两两互补的寡核苷酸经退火后所形成的序列克隆到pSuper-neo载体中构建重组体。脂质体法转染重组体至喉鳞癌Hep-2细胞,经G418筛选获得阳性克隆。用流式细胞仪检测细胞周期,RT-PCR检测其VEGF-C mRNA。结果转染VEGF-C靶向siRNA载体的Hep-2细胞生长减慢,S期细胞显著减少,VEGF-C表达水平明显下降。结论VEGF-C靶向RNAi重组体可显著抑制Hep-2细胞增殖及其VEGF-C mRNA的表达。     

抑制MDR1基因表达shRNA RNAi系统的构建

目的构建抑制多药耐药基因(MDR1)表达的短发夹RNA(sh RNA)真核表达载体系统.方法根据MDR1基因已知序列,设计两段21个碱基的MDR1特异性靶序列,合成两对62nt 并含有编码shRNA序列的寡核苷酸,双链退火后,克隆到经过BamH I和Xba I双酶切后线性 PG E-1载体的U6启动子下游,重组构建RNA干扰(RNAi)质粒.结果对重新构建的pshRNA-MDR1载体经P CR扩增后行电泳分析,并对含有插入基因片段行测序分析.结果表明,62个碱基均成功插入到预计位点,并且序列完全一致.结论载体的成功构建为研究其对MDR1 基因表达的抑制作用打下基础,同时使我们发展了在体内合成siRNA的方法.     

转化生长因子β1及基质金属蛋白酶抑制剂1、2siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 用RNA干扰技术,分别以转化生长因子(TGF)β 1、基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-1和TIMP-2为靶基因,设计并构建针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,并在体外检测其对大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)的TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因表达的抑制情况.方法 设计合成TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2的siRNA并与含绿色荧光蛋白的pGenesil-1载体连接,构建siRNA真核表达载体,并测序鉴定.体外转染HSC-T6细胞,观察转染效率,并用荧光定量PCR以及Western blot分析对目的 基因的抑制效率.组间比较用方差分析,两两比较用q检验.结果 成功构建了针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的siRNA真核表达载体.体外成功转染HSC-T6细胞,转染后的细胞TGF β 1、TIMP-1及TIMP-2 mRNA表达分别下调63.4%±8.0%,64.5%±9.0%,55.0%±17.0%(F值分别为17.55、128.42、210.36,P值均＜0.01),TGF β 1、TIMP-1及TIMP-2蛋白表达分别下降57.8%±3.0%,55.1%±5.0%,49.3%±1.0%(F值分别为130.75、159.09、35.72,P值均＜0.01).结论 成功构建了针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的siRNA真核表达载体;将重组载体成功转染入体外培养的HSC-T6细胞,并显著抑制了目的 基因的表达;为进一步研究其在体抑制表达提供了实验工具.

Abstract：

Objective To construct the siRNA eukaryotic expression vectors targeting on TGF β1,TIMP-1 and TIMP-2 and to investigate the inhibitory efficiency of target genes expression on rat hepatic stellate cell in vitro. Methods The siRNA cDNA sequences ofTGF β 1, TIMP-1 and TIMP-2 were designed,synthesized and inserted into plasmid pGenesil-1 respectively to generate eukaryotic expression plasmids.The plasmids were transfected into HSC T6 cells in vitro and the inhibitory efficiency of target genes expression was observed with real-time PCR and Western blot. Results The eukaryotic expression vectors were constructed successfully. The expressions of TGF β1 mRNA, TIMP-1 mRNA and TIMP-2mRNA in siRNAtransfected groups were decreased by 63.4% ± 8.0%, 64.5% ± 9.0% and 55.0% ± 17.0% respectively and the expressions of TGF β1 protein, TIMP-1 protein and TIMP-2 protein were decreased by 57.8% ± 3.0%,55.1% ± 5.0%, 49.3% ± 1.0% respectively as compared to the control groups. Conclusions The siRNA eukaryotic expression vectors constructed targeting on TGF β1, TIMP-1 and TIMP-2 could reduce the expressions of target genes and they might be able to used for the exploration of new anti-fibrosis drugs genetically.     

TRF2小干扰RNA载体的构建及表达

目的:构建TRF2小干扰RNA载体,观察其在胃癌细胞中的表达．方法:根据pSilencer3．1-H1载体要求设计两对小干扰RNA,退火后连接入载体相应位点．经双酶切及测序鉴定后分别转染多药耐药衍生胃癌细胞SGC7901／ADR和SGC7901/VCR． G418选择培养液培养2 mo选取转染组及对照组细胞克隆．MTT法检测转染对细胞生长增殖速度的影响．细胞用阿霉素和足叶乙甙处理 6h后Western blot法检测TRF2表达．结果:成功构建TRF2小干扰RNA载体,建立稳定转染细胞株,转染后TRF2表达明显降低,对细胞的生长增殖速度无明显影响(P>0．05)．结论:成功构建TRF2小干扰RNA载体及稳定转染细胞株．     

慢病毒载体介导的结缔组织生长因子基因沉默对下游基因的影响

目的利用RNA干扰技术,以慢病毒为载体,介导结缔组织生长因子(CTGF)基因沉默,并观察其对下游基因表达的影响。方法用构建的CTGF小干扰RNA(siRNA)慢病毒转移质粒与包装质粒、包膜蛋白质粒共转染293T细胞,包装成介导CTGF基因沉默的慢病毒载体;感染肝星状细胞系HSC-T6,应用Real-time PCR和Western免疫印迹法筛选基因沉默效率最高的慢病毒载体;再根据绿色荧光蛋白(GFP)表达水平检测感染效率;应用Real-time PCR法检测CTGF基因沉默后HSC-T6中金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、TIMP-2和I型胶原mRNA表达水平。结果包装的慢病毒载体感染HSC-T6细胞的效率高于50%;感染HSC-T6细胞后,CTGF的表达在mRNA和蛋白水平均受到明显抑制,其中TS1具有最佳的抑制效率;HSC-T6细胞CTGF基因沉默后,其TIMP-1、TIMP-2和I型胶原mRNA水平也显著降低。结论包装的慢病毒载体在HSC-T6中具有较好的感染效率和CTGF基因沉默效果,基因沉默后可进一步抑制HSC-T6细胞TIMP-1、TIMP-2和I型胶原的基因表达,这在抗纤维化的研究中具有积极的意义。     

应用表达载体介导siRNA抑制胰腺癌STAT3基因表达的研究

目的探讨表达载体介导小干扰RNA（siRNA）对人胰腺癌细胞系SW1990转录激活因子-3（STAT3）表达的抑制作用。方法设计合成3种可编码后形成小发夹结构针对STAT3基因的siRNA的DNA序列，将其连入pRNAT—U6．1／Neo质粒中，构建STAT3siRNA表达载体。表达载体进行PCR及测序鉴定，并分别转染SW1990细胞，实时定量PCR和Western blot观察SW1990细胞转染后STAT3 mRNA和蛋白表达的改变。结果PCR和DNA测序证实携带3种STAT3 siRNA表达载体构建成功，分别转染SW1990细胞后，STAT3基因的mRNA和蛋白表达量与空质粒转染相比均明显下降（P〈0．05），其中，第二种STAT3 siRNA作用明显，可使mRNA和蛋白表达水平分别下降63％和60％。结论本研究构建的STAT3．siRNA表达载体可有效抑制SW1990细胞STAT3的mRNA和蛋白表达，为下一步以STAT3为靶点的胰腺癌基因治疗实验研究奠定了基础．     

蛋白激酶C受体1过表达载体、干扰载体的构建及鉴定

目的：构建并鉴定蛋白激酶C受体1（ RACK1）过表达及干扰真核表达载体。方法采用逆转录聚合酶链反应（ RT-PCR）从人肝癌细胞系Huh-7．5．1中扩增RACK1全长cDNA系列,用巢式PCR扩增对应的CDS,并将其克隆到PIRES2-EGFP,PCR鉴定后进行测序分析。以人RACK1基因为靶基因,设计合成两对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴性对照序列,退火后与酶切后的载体RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen进行连接,并行酶切分析和测序鉴定。将构建好的过表达载体和干扰载体用脂质体转染HUVEC细胞系。结果两对引物PCR扩增的序列大小与预期结果一致,PIRES2-EGFP/RACK1载体954个碱基成功插入到预计位点,序列完全一致。 RNA干扰载体pRetroQ/RACK1-1、pRetroQ/RACK1-2和pRetroQ/HK插入序列均与预计相符。荧光显微镜观察,转染的HUVEC细胞均表达EGFP和GFP。结论成功构建RACK1过表达载体及其RNA干扰载体,并可被成功导入HU-VEC细胞系。     

化学合成经修饰抗TIMP-2小干扰RNA抑制胆总管结扎大鼠肝纤维化形成

目的研究化学合成经修饰抗金属蛋白酶组织抑制剂-2（tissue式分解inhibitor of metalloproleinase-2，TIMP-2）小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）对胆总管结扎大鼠肝纤维化形成的影响。方法30只雄性SD大鼠随机均分成5组：正常组、假手术组、模型组、阴性对照组、治疗组，行胆总管双重结扎和经肠系膜上静脉（superior mesenter vein，SMV）皮下置管手术，2周后给予治疗组0．05mg·kg^-1 siRNA经皮SMV注射，每3天1次。6周后取所有动物肝组织标本，经门静脉测压（portal vein pressure，PVP）和腹主动脉取血。常规HE染色和Van Gieson（VG）胶原染色，检测血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）和肝组织羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量。应用荧光实时定量PCR法检测TIMP-2、I型胶原纤维（collagen type I，COL I）和Ⅲ型胶原纤维（collagentype Ⅲ，COLⅢ）mRNA的表达。应用Western印迹检测TIMP-2蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle antibody，α-SMA）和结蛋白（Desmin）的表达。结果经抗TIMP-2 siRNA干预后，大鼠肝脏组织学病变减轻，PVP降低，血清ALT和AST水平下降，肝组织Hyp含量减少，且TIMP-2、COL I和COL Ⅲ mRNA的表达显著低于模型组，TIMP-2蛋白的表达也显著降低。同时肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）标记物α-SMA和Desmin蛋白的表达均显著低于模型组，尤以α-SMA蛋白表达减少更为明显。结论化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA能够抑制胆总管结扎大鼠肝纤维化形成，有可能成为肝纤维化治疗的新策略。     

反义及小干扰RNA对大鼠肝星状细胞金属蛋白酶组织抑制因子-1表达的抑制作用

目的观察以腺相关病毒（AAV）为载体，含有针对大鼠金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）-1的反义RNA及小干扰RNA（siRNA）的重组AAV（rAAV／ANTI-TIMP—1／neo及rAAV／siRNA—TIMP—1／neo）感染大鼠肝星状细胞系HSC—T6后，TIMP—1表达的受抑制情况。方法经聚合酶链反应（PCR）扩增及酶切后连接，将针对TIMP—1的反义RNA片段及甄RNA片段分别构建于AAV载体中并测序鉴定，将其包装成重组病毒后感染大鼠肝星状细胞系HSC—T6，同时设空白对照组。经G418以400ug／m1的浓度筛选30d后，分别应用荧光定量PCR技术及Westernblot检测重组病毒感染组及空白对照组HSC-T6 TIMP-1的基因转录及蛋白质表达水平。结果经PCR、酶切及序列测定证实，两种重组AAV载体质粒（pd16-95／ANTI—TIMP-1／neo和pd16—95／siRNA-TIMP-1／neo）克隆成功。将重组质粒包装成病毒感染HSC—T6细胞30d后，通过荧光定量PCR技术及Westernblot分析显示，重组病毒rAAV／siRNA-TIMP-1／neo组与对照组细胞相比，HSC—T6中的TIMP-1基因的转录被抑制（P〈0．01），且表达水平与对照组相比约下降60％。而rAAV／ANTI—TIMP—1／neo组及空载体组与对照组相比TIMP—1基因的转录及表达水平差异无统计学意义（P〉0．05）。结论通过AAV载体技术重组病毒rAAV／siRNA-TIMP—1／neo可有效地抑制TIMP-1基因的表达，而针对TIMP—1基因全长的重组病毒rAAV／ANTI—TIMP—1／neo对体外培养的HSC—T6细胞TIMP—1基因的转录与表达无明显抑制作用。     

干扰RNA靶向抑制埃兹蛋白对胃癌细胞增殖的影响

目的探讨埃兹蛋白(ezrin)对胃癌细胞生长和侵袭转移能力的影响。方法选取胃癌细胞系(AGS)作为研究材料,构建ezrin干扰载体,脂质体转染下调ezrin的表达,分别通过RT-PCR和Western blot法检测阻抑效应。以噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞增殖。结果RT-PCR和Western blot结果显示,脂质体转染对ezrin mRNA和蛋白表达水平均有显著下调作用。下调ezrin蛋白后,AGS细胞的增殖受到显著抑制,与干扰前比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论ezrin在胃癌生长过程中发挥重要作用,有可能成为抑制胃癌发生发展的新靶点。