超顺磁性氧化铁标记间充质干细胞心肌移植的磁共振成像研究

目的探讨应用磁共振（MR）进行干细胞活体心肌内成像的可行性。方法从猪骨髓抽取、分离、培养间充质干细胞（MSC）,用含超顺磁性氧化铁纳米颗粒（铁羧葡胺）的DMEM培养液孵育24h,并用二脒基苯基吲哚（DAPI）和PKH。进行荧光标记。然后将MSC经心外膜直接注入猪急性梗死心肌内,每头猪注射3点。根据每注射点细胞数量以及细胞是否铁标记,12头猪随机分成4组：2×10^6标记细胞组（n=3）、1×10^6标记细胞组（n=3）、5×10^5标记细胞组（n=3）和1×10^6未标记细胞组（n=3）。细胞移植后20—24h行猪心脏1．5TMR成像,1h后处死并根据MR成像图像切取心肌组织行普鲁士蓝染色和免疫荧光检查。结果（1）体外标记：普鲁士蓝染色见标记MSC内大量蓝色颗粒,标记率为100％,电镜证实含铁囊泡位于胞质内。（2）MR成像：注射铁标记细胞的三组（9头猪）进行活体心脏快速小角度翻转梯度回波（T2·WI—Flash 2d）序列成像,发现移植部位均呈明显的低信号,而且注射点信号缺失区的面积大小与回波时间和移植细胞数量有关;而快速自旋回波（T2WI—FSE）序列成像仅隐约可见低信号区甚至难以辨认,但显示梗死病灶和猪心脏结构比T2·WI-Flash 2d序列清晰。未标记细胞组（3头猪）的9个注射点心肌壁均未显示MR低信号区。（3）组织学检查：MR成像低信号区心肌病理学检查见普鲁士蓝染色、DAPI和PKH26三重阳性细胞存在。结论应用磁共振对超顺磁性氧化铁标记的干细胞进行活体心肌内成像是可行的。     

细胞磁共振成像不能区分磁标细胞的存活状态

目的探讨不同状态下磁标记间充质干细胞(MSCs)的体内外磁共振(MR)成像特点,明确MR对细胞存活状态是否有鉴别诊断价值。方法分离培养猪骨髓MSCs,用超顺磁性铁纳米颗粒(SPIO)标记细胞24h。对未标记MSCs、存活的SPIO-MSCs、死亡的SPIO-MSCs、单纯SPIO进行体外凝胶内1.5TMR成像;开胸结扎前降支建立猪心肌梗死模型,于梗死交界区心肌内直接注射未标记MSCs、存活的SPIO-MSCs、死亡的SPIO-MSCs和单纯SPIO,然后进行体内T2*WI-flash序列MR成像。结果存活的SPIO-MSCs、死亡的SPIO-MSCs和单纯SPIO在体内外T2*WI-flash序列MR图像上均显示为低信号区,单凭图像无法区分。结论细胞MR成像无法区分组织磁标细胞、游离铁和含铁病变,因此对长期细胞示踪结果的解读应该慎重。     

菲立磁标记猪骨髓间充质干细胞自体肝内移植的MR成像

目的:探索标记细胞肝内移植后磁共振威像技术.方法:获取猪自体骨髓间充质干细胞,分离、培养.应用菲立磁(Feridex)标记细胞,普鲁士蓝染色鉴定,标记细胞组n=6)和未标记细胞组(n=4)行经门静脉行肝内移植,分别于移植前,移植后6h、3 d、7d行磁共振T1WI,T2WI,T2*WI序列成像,同时行组织切片普鲁士蓝染色结果:普鲁士蓝染色表明MSCs的标记率达接近100%,磁标记MSCs肝内移植后行磁共振T2*WI序列呈明显低信号改变,并持续至细胞移植后7 d,组织切片普鲁士蓝染色显示7 d后肝内仍有移植的磁标记细胞存在于肝实质及肝血窦中.结论:利用Feridex可以在体外成功标记猪骨髓间充质干细胞,肝脏移植后行磁共振可以对标记细胞进行活体成像.     

磁共振成像R2*map示踪超顺磁性氧化铁标记的内皮祖细胞

目的 探讨R2*map在超顺磁性氧化铁(SPIO)标记内皮祖细胞(EPCs)定量检测中的价值.方法 分离和培养Balb/c小鼠后肢骨髓来源的EPCs,培养7 d,用细胞膜红色荧光探针标记的乙酰低密度脂蛋白和异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素-1双阳性染色法,以及异硫氰酸荧光素标记干细胞抗原1和藻红素标记的血管内皮细胞生长因子受体2的方法上流式细胞仪进行鉴定.用50 μg/ml SPIO及6 μl/ml lipofectamine 2000与EPCs共孵育进行标记后透射电子显微镜观察;制成不同细胞浓度(0～2.0×106/ml)标记及未标记SPIO的细胞琼脂糖模型,进行3.0T磁共振扫描,包括T2*map和T2map扫描,得到R2*map和R2map图像.结果 培养7d后细胞呈现内皮祖细胞特征.SPIO标记的EPCs细胞结构与未标记细胞相比较,无明显改变.R2*和R2值与标记SPIO的细胞浓度呈线性相关(r值分别为0.955,0.922,P值均<0.05);R2*效应明显高于R2效应(t=23.23,P<0.05).结论 磁共振成像R2*map扫描可准确定量示踪SPIO标记的EPCs.     

超顺磁性氧化铁活体动态示踪小型猪骨髓间充质干细胞的转归

目的探讨磁共振(MRI)下活体动态示踪小型猪骨髓间充质干细胞(MSCs)经冠脉移植治疗心肌梗死的可行性及移植后8周MSCs的转归。方法采用密度梯度离心法获取小型猪自体骨髓MSCs,用携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体转染MSCs,并用超顺磁性氧化铁(SPIO)体外标记MSCs-GFP。采用经皮球囊封堵法制备急性心肌梗死(AMI)模型,随机分为2组,MSCs移植组(n=8),经冠脉移植双标记的MSCs到小型猪心肌梗死区域,对照组(n=5),移植等量生理盐水,移植后24 h、3周、8周在MRI下进行活体动态示踪。8周后离体组织学观察大体形态学改变及移植细胞存留情况。结果普鲁士蓝染色显示25μg Fe/mL SPIO与0.8μl/mL阳离子脂质体联合对MSCs的标记率达95%～100%,标记后细胞活力和增值能力较前改变无统计学差异(P>0.05),对GFP的表达无影响,双标记细胞仍具备成骨、成脂及成心肌分化能力,心肌细胞表面标记物α-MHC和actinin表达阳性。双标记MSCs经冠脉移植后24 h,3周,8周MRI成像均可见梗死区域的室间隔有明显区别于周边组织的低信号,信号强度(SI)改变分别为52.98%±10.74%,21.53%±5.40%,6.23%±2.01%(P<0.05),对照组无可见低信号区域。组织学检查示MSCs移植组心梗瘢痕面积明显缩小(P<0.05),HE染色见心梗区域心内膜下出现再生心肌,普鲁士蓝染色可见有蓝色颗粒聚集,荧光显微镜下同一切片GFP表达阳性,CD68(单核巨噬细胞表面标记物)表达阴性。每高倍镜视野下心梗边缘区和梗死区的蓝色颗粒数分别为36.2±3.8和9.7±2.1(P<0.05)。对照组普鲁士蓝染色阴性。结论 GFP/SPIO双标记MSCs是安全的,且不改变干细胞的生物学特性。经冠脉移植双标记MSCs可在MRI成像下表现出理想的信号强度,示踪时间长达8周,MSCs移植可减小心梗瘢痕面积,促进心肌再生,8周后SPIO主要定居于心梗边缘区,仍存在于MSCs中,SPIO活体动态示踪小型猪骨髓MSCs?     

Resovist标记大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死的磁共振成像监测

目的探讨MRI监测Resovist体外标记大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗脑梗死后在脑内的分布及迁移。方法 16只大鼠随机分为对照组8只和移植组8只。BMSCs传至P3代后,Resovist体外标记BMSCs。采用改良Longa法制作大鼠脑梗死模型,移植组缺血对侧顸叶脑皮质移植Resovist标记的BMSCs,对照组不移植。2组大鼠均于移植后1 d和1、2、4周行MRI动态观察。移植后4周行脑组织HE染色及普鲁氏蓝染色。结果移植组大鼠移植后1 d和1、2、4周MRI序列上,均可显示缺血对侧半球移植的Resovist标记BMSCs所致的低信号,移植后2周可见沿胼胝体腹侧走行的线状低信号影,移植后4周细胞所致的彗星状改变更为明显,彗星尾向缺血侧延伸。脑组织普鲁氏蓝染色显示,移植组大鼠胼胝体内迁移的蓝染细胞呈条带状排列。结论临床应用型MRI可获得满意图像质量及实验数据,不仅可显示移植位点BMSCs所致的低信号,还可明确显示BMSCs经由胼胝体的迁移。     

间充质干细胞对大鼠心脏移植免疫的调节作用

目的:观察骨髓间充质干细胞(MSC)对大鼠心脏移植的免疫调节作用.方法:实验共分3组,同种同系移植组(Ⅰ组),供受体均为SD大鼠;同种异系非给药组(Ⅱ组),供体为Wistar大鼠,受体为SD大鼠;同种异系给药组(Ⅲ组),供体为Wistar大鼠,受体为SD大鼠.建立大鼠心脏移植动物模型,贴壁法分离培养大鼠MSC,由Ⅲ组受体颈外静脉注入.观察3组移植后大鼠的存活时间,苏木精-伊红染色观察移植心脏淋巴细胞浸润程度.结果:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的平均存活时间分别为(20.8±4.8)d、(6.6±0.9)d、(7.0±1.2)d,Ⅱ组、Ⅲ组与Ⅰ组比较,均差异有统计学意义(P<0.05);但Ⅱ组与Ⅲ组间比较差异无统计学意义.Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组移植心脏病理学分级评分分别为(0.24±0.27)、(3.10±0.55)、(3.00±0.61),Ⅱ组、Ⅲ组与Ⅰ组比较,均差异有统计学意义(P<0.05);但Ⅱ组与Ⅲ组间比较差异无统计学意义.结论:MSC在体外混合淋巴细胞反应中能够抑制T细胞增殖,但是在体内实验中对移植物的存活时间无明显的延长及对移植物的淋巴细胞浸润无明显抑制作用.     

间充质干细胞与神经细胞移植

间充质干细胞具有跨胚层分化潜能，在适宜条件下可以转化为神经细胞，并对脑缺血，脑外伤和脊髓损伤等疾病的神经功能缺损有改善作用，是神经细胞移植的理想供体，文章就间充质干细胞在神经细胞移植中的研究进展作了综述。     

磁共振成像示踪观察脑缺血大鼠脑室内移植神经干细胞的实验研究

目的探讨MRI示踪观察脑缺血大鼠脑室内移植的标记神经干细胞的分布和迁移的可行性。方法选取16只雄性SD大鼠制做脑梗死模型,随机分为标记组和未标记组,每组8只,分别于脑梗死对侧侧脑室内立体定向移植超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记和未经标记的神经干细胞。移植细胞后,不同时间点分别进行MRI连续成像观察,之后进行大鼠脑组织冷冻切片的普鲁士蓝染色。结果标记组移植后即刻的MRI即可观察到大鼠侧脑室内的移植标记细胞,移植后7天脑梗死皮质下即可见到低信号影,各对应时间点组织切片的普鲁士蓝染色与MRI结果相符。结论MRI能够在活体内连续无创的示踪观察大鼠侧脑室移植的标记神经干细胞的迁移及分布情况。     

间充质干细胞在肝脏的分化机制研究进展

间充质干细胞可通过旁分泌营养机制和分化为肝实质细胞等修复肝组织,移植间充质干细胞将成为临床治疗肝病的一种重要方法。本文介绍了间充质干细胞在微环境下,分化为肝实质细胞的可能机制以及影响其分化的相关因素。     

Magnetically labeled mesenchymal stem cells after autologous transplantation into acutely injured liver

AIM:To evaluate tracking of magnetically labeled mesenchymal stem cells(MSCs) after intraportal transplantation.METHODS:Mononuclear cells were isolated from bone marrow aspirates of pigs by density gradient centrifugation,cultured and expanded,after which,they were incubated with super paramagnetic iron oxide(SPIO).Prussian blue staining was performed to highlight intracellular iron.To establish swine models of acute liver injury,0.5 g/kg D-galactosamine was administrated to 10 pigs,six of which were inject...     

MRI of magnetically labeled mesenchymal stem cells in hepatic failure model

AIM:To track intravascularly transplanted mesenchymal stem cells (MSCs) labeled with superparamagnetic iron oxide (SPIO) by using magnetic resonance imaging (MRI) in an experimental rabbit model of hepatic failure.METHODS:Human MSCs labeled with FDA-approved SPIO particles (Feridex) were transplanted via the mes-enteric vein into rabbits (n=16) with carbon tetrachloride-induced hepatic failure.Magnetic resonance (MR) examinations were performed with a 3.0 T clinical scanner immediately before and 2 h and 1,...     

Imaging of stem cells using MRI

The administration of exogenous stem cells offers promise to regenerate many damaged organs. However, failures of these cellular therapies could be related to many issues, such as the type of stem cell, the dose of cellular therapeutic, dosing regime, and mode of delivery. The recent ability to directly label stem cells with magnetic resonance (MR) contrast agents provides a simple, straight-forward manner to monitor accurate cell delivery and track stem cells non-invasively in a serial manner. Provided here is an overview of the currently available MR-labeling methods, including direct non-specific labeling with contrast agents, indirect specific labeling with contrast agents, labeling with MRI reporter genes, and fluorine hot spot labeling. Several of these approaches have now been applied successfully in preclinical animal models of cardiovascular disease. Once properly implemented, future clinical trials may benefit greatly from imaging stem cells with MRI.     

磁共振评价磁探针标记的骨髓单个核及骨髓间充质干细胞移植治疗猪急性心肌梗死的疗效

目的 骨髓单个核细胞(BM-MNC)及骨髓间质干细胞(MSC)经磁探针标记后,应用磁共振成像(MRI)观察磁探针标记的BM-MNC(MR-MNC)及MSC(MR-MSC)治疗猪急性心肌梗死(AMI)的疗效.方法 24头小型家猪经皮冠状动脉介入法成功制备AMI模型19头,随机分为MR-MSC组(n=7)、MR-MNC组(n=6)和AMI对照组(n=6),分别经冠状动脉途径植入MR-MSC、MR-MNC(细胞总数1×107)和含菲立磁标记物的磷酸盐缓冲液,MRI爪踪移植细胞并观察8周后不同细胞类型移植对梗死心肌面积及心功能的影响,最后行组织学检查鉴定移植细胞及其功能.结果 MRI示MR-MSC组、MR-MNC组均见呈低信号的标记细胞归巢至呈高信号的梗死心肌区周边或梗死心肌内.与移植前相比,8周后MRI测定梗死心肌而积在标记细胞移植组均明显缩小(MR-MSC组8.5%±0.5%比24.7%±3.1%,P＜0.05;MR-MNC组12.3%±1.5%比26.1%±1.5%,P＜0.05);左室射血分数(LVEF)均有明显提高(MR-MSC组56.9%±1.3%比40.7%±2.0%,P＜0.05;MR-MNC组52.8%±1.4%比41.9%±3.3%,P＜0.05),但MR-MSC组LVEF改善程度优于MR-MNC组(16.2%±1.2%比10.9%±3.0%,P＜0.05).普鲁士蓝染色证实标记细胞分布与MRI所见低信号区分布基本一致.Western blot分析显示心肌再生指标肌球蛋白重链表达在MR-MSC组(100.3±5.5)及MR-MNC组(95.5±4.2)均高于AMI对照组(75.7±5.7);心肌特异性肌钙蛋白T在MR-MSC组(124.0±5.8)及MR-MNC组(118.4±4.4)均高于AMI组(93.3±3.9);心肌重构指标基质金属蛋白酶2(MMP2)/MMP抑制剂1(TIMP1)在MR-MSC组(0.6±0.1)及MR-MNC组(0.6±0.1)低于AMI对照组(4.2±0.2).结论 MR-MSC及MR-MNC可在体分化成表达心肌特异性蛋白的心肌样细胞,延缓心室重构,缩小梗死心肌面积,改善整体心窒收缩功能,且MR-MSC对心功能改善程度优于MR-MNC.     

小型猪骨髓间充质干细胞超顺磁氧化铁、增强型绿色荧光蛋白双标记及体外磁共振成像示踪的研究

目的 探讨超顺磁氧化铁(SPIO)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)体外双标记、磁共振成像(MRI)示踪1型糖尿病(T1DM)小型猪骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可行性和标记方法.方法 采集T1DM小型猪骨髓,密度梯度离心和贴壁培养法分离BMSCs.选用携带EGFP慢病毒(LV)颗粒转染BMSCs.选用SPIO和左旋多聚赖氨酸(PLL)复合物标记LV-EGFP转染的BMSCs.对SPIO标记细胞进行普鲁士蓝染色、透射电镜观察和体外MRI.结果 LV-EGFP与BMSCs转染复数(MOI)为30∶1转染后96 h荧光表达最强,阳性转染率43.2%.Fe3+标记浓度为25 mg/L BMSCs阳性标记率93.1%.透射电镜检测发现,SPIO粒子密集于BMSCs细胞质,次级溶酶体内多见.MRI显示,Fe3+标记浓度为25 mg/L、1×104/ml细胞浓度标记后3周和6周在快速自旋回波序列(TSE)T1WI、TSET2WI及快速小角度激发成像(FLASH)T2*WI信号强度变化率(△SI)依次为12%、41%、63%和7%、28%、46%,均为后二者大于前者(分别P＜0.01和P＜0.05),提示SPIO该标记浓度和细胞密度标记后3周和6周在T2WI及T2*WI呈现较明显的信号变化.结论 采用体外EGFP和SPIO双重标记的方法,结合MRI和细胞化学染色法可以稳定地对T1DM小型猪BMSCs进行体外示踪.

Abstract：

Objectives To track bone marrow stem cells (BMSCs) labeled by enhanced green fluorescent protein (EGFP) and superparamagnetic iron oxide ( SPIO ) -poly-L-lysine (PLL) compound by MRI in vitro for autotransplantation into pancreas of type 1 diabetes miniature pigs. Methods The BMSCs were isolated by density gradient centrifugation and attachment culture from type 1 diabetes minipigs' bone marrow. Expressional intensity of EGFP in BMSCs transfected lentivirus-EGFP with a multiplicity of infection Different magnetic resonance scanning protocols were carried out on various density BMSCs labeled by different concentration of SPIO in various time-point in vitro. Results When SPIO concentration was 25mg/L (count in Fe3 + ), the positive Fe3+ -labeling rate of BMSCs was 93. 1%. Most of SPIO particles in BMSCs' cytoplasm were observed in secondary lysosomes, but they were not detected in important organelle as cell nucleus. Comparing with gelatin the MRI of BMSCs labeled with SPIO in the condition with 1 ×104/ml cells density and 25 mg/L Fe3+ concentration in vitro, the signal intensity changes (△SI) after BMSCs labeled with SPIO 3 weeks and 6 weeks in TSE T1WI, TSE T2WI and FLASH T2 * WI sequences were 12%, 41%, 63% and 7%, 28%, 46% respectively (P ＜ 0.01 and P ＜ 0.05, respectively).Conclusions The data showed that the porcine BMSCs labeled with SPIO and EGFP could be traced successfully in vitro by MRI in the suitable sequences.     

间充质干细胞分化为肝样细胞的研究进展

肝炎后肝硬化等慢性进展性肝病、急性肝功能衰竭、肝脏代谢性疾病及肝脏恶性肿瘤等终末期肝病的发病率日益上升,美国贝塞斯达回忆宣布肝移植是目前治疗终末期肝病最有效的方法,但由于肝源有限、移植后的免疫排斥反应以及高额费用等限制了这种治疗方法的开展。近年来,随着对干细胞研究的深入,发现间充质干细胞(MSCs)具有向肝样细胞分化的潜能,且安全性、可行性及疗效均显示了较好的应用前景,为终末期肝病的治疗提供了新的途径。本文就MSCs不同组织来源分化特点、体内外分化为肝样细胞研究、分化后的肝样细胞的生物学特性及MSCs分化为肝样细胞的机制、MSCs应用的一些问题作一概述。     

骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的研究

骨髓间充质干细胞(MSC)是一类具有自我增殖和分化潜能的细胞.在特定条件诱导下可向多系细胞分化.近年来,MSC向肝系细胞分化的研究越来越受到人们的关注.一系列实验证明MSC在一定条件下可向肝细胞分化.其向肝细胞分化的机理以及诱导分化条件的优化还在进一步研究之中.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及向心肌样细胞转化的条件。方法获取成年大鼠胫骨干骨髓,采用贴壁法进行间充质干细胞的培养、传代,观察经5-氮胞苷诱导后骨髓间充质干细胞的生长和分化。结果大鼠骨髓基质细胞贴壁呈集落生长,5-氮胞苷诱导骨髓基质细胞转化为心肌样细胞。结论骨髓基质细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞,为自体心肌细胞移植提供了一种良好的来源。