尿酸辅助树突细胞诱导乙型肝炎病毒抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞效应的观察

近来研究提示,尿酸是免疫系统的一种重要的危险信号,它能刺激DC成熟,促进DC向T淋巴细胞呈递抗原．尿酸可能成为一种有效的免疫佐剂。本研究以尿酸辅助负载HBV表位肽S（28-39）的树突状细胞免疫接种小鼠,对其产生的HBV抗原特异性CTL免疫效应进行了报道。[第一段]     

树突状细胞HBsAg疫苗抗乙型肝炎病毒免疫的体外研究

目的 研究人单核细胞来源的树突状细胞（DC）激活的HBsAg特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对表达HBsAg的HepG2/S靶细胞的杀伤效应，以探索DC-HBsAg疫苗在抗乙型肝炎病毒（HBV）中的作用。方法 从健康外周血中分离邮单核细胞，在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素4（IL-4）的作用下培养7d诱导出DC，然后以DC为刺激细胞在体外诱导出HBsAg特异性CTL；将携有HBV-S基因的pLXSN/S重组质粒电击导入肝癌细胞系（HepG2)，建立表达HBsAg的靶细胞模型HepG2/S；用染色法检测HBsAg特异性CTL对HepG2/S靶细胞的杀伤效应。结果 DC激活的HBsAg特异性CTL对HepG2/S靶细胞具有较强的杀伤效应，不同浓度HBsAg(0μg/L，50μg/L和100μg/L）诱导的CTL的杀伤率分别为3.8%,69.5%和85.1%，而CTL对HepG2细胞无明显杀伤效应。结论 由DC激活的HBsAg特异性CTL具有较强制 特异性抗HBV作用。     

乙型肝炎病毒核心区基因变异与机体细胞免疫水平的关系

HBV所激发的免疫应答和免疫病理反应是乙型肝炎发病机制的关键。其中细胞毒性T淋巴细胞（CTL）是细胞免疫反应的主要执行者，而针对HBcAg的CTL应答决定病毒是否被清除。当HBV基因发生变异，可改变氨基酸分子的表达，尤其当CTL识别的重要表位发生变异会改变机体对病毒的免疫反应。     

胰腺癌细胞总RNA转染树突细胞诱导特异性CTL能力的体外研究

目的观察人胰腺癌Mia Pa Ca-2细胞总RNA电转染树突细胞(Dendritic Cell,DC)体外激发抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)的能力。方法自6例胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养DC。使用电穿孔法将Mia Pa Ca-2细胞总RNA体外转录和PCR扩增的MUC1m RNA转染DC,以未负载抗原的DC为对照。采用实时定量PCR技术检测各组DC中MUC1表达。四甲基偶氮唑盐(MTT)检测转染各组DC存活率变化;混合细胞培养法评价各组DC体外刺激自体T淋巴细胞增殖能力;ELISA法检测各组DC体外激发抗原特异性CTL细胞因子释放量。结果 Mia Pa Ca-2总RNA与MUC1 m RNA分别转染后48 h DC中目标抗原的相对表达量分别为37.24±3.17和34.53±2.02,两者比较无显著差异(P0.05)。电转染后96 h Mia Pa Ca-2总RNA转染组DC存活率降至60.81%,低于MUC1 m RNA单转染时DC的存活率(80%左右)(P0.05)。转染Mia Pa Ca-2总RNA DC刺激自体T细胞增殖指数为8 432±611.25,显著高于MUC1单独转染组3 664±305.17(P0.05);且转染Mia Pa Ca-2总RNA DC激发特异性CTL分泌IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-γ水平亦显著高于MUC1 m RNA单独转染组(P0.05)。结论胰腺癌肿瘤细胞总RNA转染的DC较单一胰腺癌相关抗原负载DC有更强的体外抗原特异性CTL激发能力。     

重型肝炎患者乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞应答功能研究

目的 用主要组织相容性复合物（MHC）抗原肽四聚体（Tetramer）流式细胞技术，分析乙型重型肝炎患者外周血中特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答状况，并探讨其临床意义。方法 采用Tetramer流式细胞技术检测乙型重型肝炎患者外周血中受人类白细胞抗原Ⅰ类分子限制的三类特异性CD8^＋CTL细胞数量；采用酶联免疫吸附斑点试验技术，测定经特异性乙型肝炎病毒（HBV）肽段诱导培养的特异性CTL表达膜内细胞因子IFNγ、TNFα、IL-4和IL—10等的水平；采用Promega CytoTox96非放射性细胞毒试验技术，测定经特异性HBV肽段诱导培养的特异性CTL杀伤靶细胞能力。结果 急性乙型重型肝炎组外周血中针对HBVcore18-27表位的特异性CTL数量高于慢性乙型重型肝炎组（P〈0．05），而低于急性乙型肝炎组（P〈0．05）；急性乙型重型肝炎组表达干扰素γ和肿瘤坏死因子α较慢性乙型重型肝炎组高（P值均〈0．05）；急性乙型重型肝炎组HBVcore18—27特异性CTL裂解靶细胞能力高于慢性乙型重型肝炎组（P〈0．05）。结论 急性乙型重型肝炎患者特异性CTL应答作用增强，而慢性乙型重型肝炎患者特异性CTI。应答缺乏。急性乙型重型肝炎患者外周血特异性CTL持续存在，可能与促进病毒清除等相关。     

乙型肝炎病毒核心区基因变异与细胞免疫

目的 探讨慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)核心区Leu60Val变异与机体细胞免疫水平的关系。方法 通过流式细胞分析技术(FCM)检测外周血T淋巴细胞亚群,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清细胞因子[干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素2(IL-2)]水平,采用聚合酶链反应(PCR)扩增HBV DNA C基因区片段,并对PCR产物直接测序。结果 91例慢性乙型肝炎患者发生Leu60Val变异者19例,变异率为20.9％,随病情加重变异率逐渐增加,以重型肝炎组最高;Val60变异株组IFN-γ、TNF-α水平明显增高(t值分别为2.584、4.766,P<0.01),CD_4~1/CD_8~1比值逐渐升高(t=2.275,P<0.05)。结论 Val60变异株可能通过增加与Ⅰ类人白细胞抗原(HLA-Ⅰ)的亲和力,或上调HLA-Ⅰ类分子的表达,从而激活大量的细胞毒性T淋巴细胞释放细胞因子,并同时在肝脏局部发挥免疫效应,提高对宿主的杀伤力。     

胰腺癌Capan-2细胞总RNA转染树突细胞诱导特异性抗肿瘤免疫反应的体外研究

目的 观察人胰腺癌Capan-2细胞总RNA转染的树突细胞（DCs）所诱导的抗肿瘤免疫反应.方法 从6例胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养DCs.使用电穿孔法将Capan-2细胞总RNA及MUC4 mRNA分别转染DCs.应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测转染后DCs的存活率.采用蛋白质印迹法检测DCs中MUC4 mRNA的表达.使用IFN-γ酶联免疫法检测DCs诱导的细胞毒T淋巴细胞（CTLs）的活化反应.采用51Cr标准细胞毒实验检测DCs诱导的抗原特异性CTLs对体外胰腺癌细胞的杀伤效应.结果 Capan-2细胞总RNA转染的DCs（DC-Capan-2-total RNA）的存活率呈时间依赖性下降,转染后96 h的存活率降低至60.8％,而转染MUC4 mRNA的DCs（DC-MUC4 mRNA）的存活率稳定在80.0％左右,两转染组DCs的差异具有统计学意义（P＜0.05）.DC-Capan-2-total RNA的MUC4蛋白表达量亦显著低于DC-MUC4 mRNA（P＜0.05）.DC-Capan-2-total RNA诱导的CTLs 24 h IFN-γ释放量为（89.34±3.85） U/ml,DC-MUC4 mRNA为（21.77±2.14） U/ml,两转染组的差异有统计学意义（P＜0.05）.DC-Capan-2-total RNA诱导的特异性CTLs能够有效识别和杀伤HLA-A2 ＋/MUC4＋的Capan-2细胞及HLA-A2 ＋/MUC4-的PANC1细胞,而不能有效识别和杀伤HLA-A2-/MUC4-的MiaPaCa-2细胞和HLA-A2-/MUC4＋的AsPC-1细胞.结论 胰腺癌细胞总RNA转染的DCs较单个胰腺癌相关抗原转染的DCs能诱导出更加显著的CTLs抗肿瘤免疫反应,但受到MHC Ⅰ类抗原递呈的限制.     

乙型和丙型肝炎病毒对主要组织相容性复合体基因的调节

众所周知，免疫学上把能引起强而迅速排斥反应者称为主要组织相容性抗原，其编码基因是一组紧密连锁的基因群，称之为主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)。MHC在不同的哺乳动物中有不同的命名，但是其组成、结构以及编码产物的功能等却很相似。人主要组织相容性抗原称为人白细胞抗原系统(human leucocyte antigen，HLA)。     

双胰腺癌相关抗原RNA转染树突细胞诱导特异性抗癌免疫反应的实验研究

目的研究人胰腺癌MUC4与Survivin mRNA联合转染树突细胞(DC)诱导的特异性抗肿瘤免疫反应,为构建负载多抗原表位DC疫苗治疗胰腺癌提供实验依据。方法自胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养DCs。使用体外转录和胰腺癌PCR技术扩增MUC4和Survivin mRNA后用电穿孔法将其联合转染DC。采用Western blot技术检测DCs中MUC4和Survivin的表达。用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测转染前后DCs存活率变化;使用IFN-γ酶联免疫法检测MUC4 mRNA与Survivin mRNA联合转染后DC诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活化反应。采用51Cr标准细胞毒实验检测转染MUC4和Survivin mRNA后DCs诱导的特异性CTL对体外胰腺癌细胞的杀伤作用。结果 MUC4与Survivin mRNA联合转染后72 h DCs中两者的相对表达量低于其分别转染。顺序转染后96 h DCs存活率降至50.2%,低于MUC4 mRNA与Survivin mRNA分别转染时DC 80%的存活率(P0.05)。MUC4和Survivin mRNA联合转染DC诱导的特异性CTL 24 h IFN-γ释放量达(33.84±3.51)U/mL,高于MUC4与Survivin mRNA分别转染DC诱导的CTL IFN-γ释放水平[(21.87±4.12)U/mL和(16.61±2.09)U/mL,P0.05]。DCs经MUC4 mRNA与Survivin mRNA联合转染后,可有效诱导HLA-A2+/MUC4+/Survivin+特异性CTL免疫反应,对体外培养的胰腺癌细胞具有显著的杀伤作用。结论 MUC4与Survivin mRNA联合转染的DCs可较单胰腺癌相关抗原负载DCs诱导出更加显著的特异性CTL抗肿瘤免疫。     

自体树突状细胞疫苗治疗慢性乙型肝炎的临床研究

目的观察乙型肝炎表面抗原(HBsAg)疫苗负载的自体树突状细胞(DC)治疗慢性乙型肝炎(CHB)的临床效果。 方法 试验19例CHB患者,取静脉外周血,用密度梯度离心及贴壁法获得单核细胞;用粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)细胞因子诱导扩增出DC;于第7天用HBsAg致敏后经皮下回输入患者体内,共回输两次(间隔两周)。治疗后,每隔两个月检测受试者的肝功能、HBV DNA定量及血清乙型肝炎标志物。 结果 截止2002年11月的随访结果,57.9％(11/19)的患者发生了不同程度的应答反应,HBeAg的阴转率为52.6％(10/19),HBeAg/抗-HBe血清转换率为26.3％(5/19),HBV DNA定量的拷贝数下降101.77±2.39(t=3.13,P<0.01),两例联合拉米夫定治疗的患者出现较完全的应答,DC疗法与另两种抗病毒方法效果间差异无显著性;试验前患者肝功能的高低与试验有效率间并无显著相关性。 结论 在体外诱导扩增的自身DC细胞,经HBsAg致敏后皮下回输,可有效抑制HBV的复制,减少血内病毒载量,清除HBeAg和促进HBeAg/抗-HBe的血清转换。在试验前丙氨酸氨基转移酶(ALT)高或正常的患者均可对DC治疗发生应答。DC联合拉米夫定治疗可达快速清除病毒的效果。     

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞功能的研究

目的研究慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞(DC)的免疫功能.方法从慢性乙型肝炎患者外周血中分离单个核细胞,用无血清培养法分离培养DC,用流式细胞仪检测DC表型,用液闪计数仪观察DC对T细胞的增殖作用,用ELISA法检测混合淋巴细胞反应(MLR)中细胞因子的分泌水平.结果患者组DC的CD86的表达率为(70.2±5.2)%,明显低于正常人组(95.3±3.8)%,P＜0.01;其诱导T细胞增殖能力每分钟液闪计数cpm为10000±2000,明显低于正常人组(cpm为30000±3000),P＜0.01患者MLR中IL-12为(120.0±19.7)pg/ml,γ-干扰素为(799.0±161.3)pg/m1,明显低于正常人组的(280.0±41.1)pg/ml和(3359.0±635.4)pg/ml,P＜0.01.结论慢性乙型肝炎患者外周血DC免疫功能低下,并与DC表面CD86的表达率下降及DC分泌IL-12减少密切相关.     

慢性乙型肝炎病人外周血树突状细胞对 HBsAg的提呈作用

目的 研究慢性乙型肝炎（乙肝）病人外周血培养的树突状细胞（dendritic cell,DC)对HBsAg的提呈作用。方法 从乙肝病人外周血中培养扩增DC,以不同浓度的HBsAg与DC共同孵育1.5h,然后再与10倍的自体T细胞混合培养5d,结束培养前13h加入37kBq/孔（1uCi=37kBq)^3H胸腺嘧啶。收获细胞,用γ液体闪烁计数仪测定cpm。结果 抗原处理的DC刺激T细胞增殖效应（cpm）明显高于未经抗原处理的DC。结论 从慢性乙肝病人外周血培养的DC对HBsAg有较强的提呈作用。     

慢性乙型肝炎病毒感染产妇的胎儿脐带血树突状细胞的表型及功能

目的探讨孕妇慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染对其胎儿脐血的树突状细胞(DC)的表型和功能的影响,并与健康胎儿、健康成人及成人慢性HBV感染者进行对比研究。方法体外分离慢性HBV 感染产妇及健康产妇胎儿脐带血、健康成人及慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞进行树突状细胞转化,行流式细胞术对其表型进行分析,通过交叉混合淋巴细胞培养和DC培养上清液白细胞介素(IL)-12检测来分析DC的功能。结果慢性HBV感染产妇脐血来源DC的CD 80、CD 83的表达显著低于健康胎儿组、健康成人组、成人慢性HBV感染组,CD14的表达则显著高于此三组,P值均<0.0 5;慢性HBV感染产妇脐带血DC分泌的IL-12水平也明显低于健康产妇、健康成人组及慢性乙型肝炎患者(P<0.05);促异体T淋巴细胞增殖能力的强弱依次为健康成人DC-健康脐血T淋巴细胞>健康成人DC-健康成人异体T淋巴细胞>健康脐血DC-异体健康脐血T淋巴细胞>健康脐血DC-健康成人T淋巴细胞>孕母HBV感染脐血DC-健康脐血T淋巴细胞>孕母HBV感染脐血DC-健康异体成人T淋巴细胞。结论慢性HBV感染产妇胎儿脐血DC的成熟和功能显著低于健康胎儿脐血DC、健康成人甚至慢性乙型肝炎患者外周血DC。     

乙型肝炎病毒在造血干细胞内复制及对其免疫活性的影响

目的 研究不同载量HBV感染脐血来源的CD34~+造血干细胞(HSC)的一般规律,以及探讨HBV感染HSC后诱生的树突状细胞(DC)的功能状态.方法 无菌条件下采集脐血,磁珠分离仪分离纯化CD34~+ HSC.把CD34~+ HSC分为HBV感染组及对照组,用免疫组织化学及原位杂交方法检测HSC内病毒感染情况.分3组将HSC接种于24孔板连续培养12 d,各组分别加入细胞因子组合及不同病毒载量HBV(A组1×10~7拷贝/mL,,B组1×10~5拷贝/mL,C组1×10~3拷贝/mL)的血清,于培养的0、1、6、12 d检测各组细胞数,上清液及细胞中HBV DNA拷贝数.用两步法诱生的DC作为刺激细胞,以异基因健康者外周血T淋巴细胞作为反应细胞,噻唑蓝比色法检测DC对同种异体T淋巴细胞的刺激增殖作用.组间比较采用t检验.结果 免疫组织化学检测结果显示,HBV感染12 d的HSC中可检测到HBsAg的表达,而未感染的HSC中无HBsAg阳性细胞.原位杂交检测结果显示,HBV感染12 d的HSC中可检测到HBV DNA,未感染的HSC中无阳性细胞.C组第1天的细胞增殖与A、B组比较无明显差异,第6、12天细胞增殖高于A、B组,且第6天的细胞计数差异有统计学意义(t=5.125,t=6.327;均P<0.05).在第12天A组细胞内可检出1×10~6拷贝/mL HBV DNA,B组可检出1×10~3拷贝/mL,C组则12 d内均不能检出.上清液检出情况与细胞内相符.混合淋巴细胞反应显示HBV感染组诱生的DC对同种异体T淋巴细胞刺激增殖作用明显低于对照组,且差异有统计学意义(在DC与T淋巴细胞的比例达到0.05时,t=3.156,P<0.05;在比例达到0.1、0.5时,t=4.873,t=5.103,均P<0.01).结论 HBV可以在CD34~+ HSC内复制并随HSC扩增而同步增加.HBV感染的HSC诱生的DC对同种异体T淋巴细胞刺激增殖能力减低,即HBV感染HSC后其分化的免疫细胞的生物活性降低.     

树突状细胞治疗HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者的临床观察

目的:观察树突状细胞疫苗对HBeAg(-)慢性乙型肝炎的治疗效果.方法:HBV抗原肽致敏的树突状细胞.1次/mo sc于17例HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者,6次后改为HBV抗原肽和乙肝免疫球蛋白各注射1次/mo,连用6 mo.每6月复查肝功能,乙肝标志,HBV DNA定量及B超.结果:HBV DNA转阴5例(29.4%),HBV DNA下降2例(11.8%),肝功能复常4例(23.5%).结论:HBV抗原肽冲击的树突状细胞疫苗可应用于HBeAg阴性慢性乙型肝炎的治疗.     

整体重组酵母抗乙型肝炎病毒的初步研究

目的 借助酵母的免疫特性，设计一种新型抗乙型肝炎病毒(HBV)治疗性疫苗，探索一种全新的可有效活化机体抗病毒免疫应答方式。方法 以基因工程技术构建内含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和热休克蛋白(HSP)70(1～370)—HBsAg的重组毕赤酵母，皮下免疫BALB／C小鼠，检测小鼠对HBsAg的体液及细胞免疫反应。结果 重组酵母成功诱导了小鼠体内表面抗体的产生，显示其抗原性并未受到影响。细胞免疫检测未能获得预期的结果。结论 整体重组酵母活菌具有疫苗特性，整体重组酵母用于抗HBV治疗是一个新的思路，未能检测到细胞免疫反应可能与重组酵母的用量，注射方式等有关。     

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞表型及抗原提呈能力与HBV载量的关系

目的探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血树突状细胞(DCs)表型及抗原提呈能力与HBV载量的关系.方法采集23例CHB患者和8例健康人的抗凝外周静脉血,分离外周血单个核细胞(PBMCs),在重组人白细胞介素4和重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的作用下培养使DCs增殖、成熟,以间接免疫荧光流式细胞技术分别检测DCs表面CD80、CD86、HLA-DR及ICAM-1的表达;将培养成熟的DCs与HBsAg共同孵育,用丝裂霉素C处理后再与自体PBMCs共同培养,在培养结束前12 h加入^3H-TDR,收集细胞,以β液闪计数仪测定cpm值;同期用定量聚合酶链反应技术测定CHB患者外周血HBV载量.结果患者DCs表面CD86、HLA-DR和ICAM-1的表达水平及DCs的抗原提呈能力均显著低于健康对照组;CD80、CD86、HLA-DR及ICAM-1的表达与HBV载量呈显著负相关(分别为P＜0.01,P＜0.01,P＜0.001和P＜0.001);DCs的抗原提呈能力也与HBV载量呈显著负相关(为P＜0.001).结论CHB患者外周血DCs的成熟和功能存在障碍,DCs的抗原提呈能力与血液中HBV的载量密切相关,并可能对HBV的清除产生重要的影响.     

e抗原阳性慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞干扰素β的表达

目的探讨慢性乙型肝炎患者树突状细胞干扰素β（IFN—β）表达与乙型肝炎病毒（HBV）感染后宿主免疫清除障碍的关系。方法选择e抗原阳性慢性乙型肝炎患者52例,健康对照48例,用免疫磁珠细胞分选乙型肝炎e抗原（HBeAg）法从外周血获得纯化的CD14^＋单核细胞,并用hOMCSF、hIL-4诱导单核细胞成为未成熟的髓样树突状细胞（mDC）,加入polyI：C（25ug／ml）刺激后获得成熟的mDC,在刺激后0h、12h、24h、48h用流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD86、HLA-DR、CD1a,real—time PCR检测IFN8的表达变化。用ELISA方法检测mDC细胞上清液中IFN-β、IL-12、IL-10的浓度变化。结果两组mDC上0h IFN-β mRNA表达水平及细胞上清液中IFN—β浓度差异无统计学意义（P〉0．05）。健康对照组mDC在12hIFN—β mRNA表达水平及IFN-β浓度与0h相比显著升高（P〈0．05）,较患者组0h、12h、24h、48h IFN—β表达显著升高（P〈0．05）。而患者组mDC刺激后12h、24h和48hIFN—β mRNA及IFN-β表达水平与0h相比无显著变化。与0h比较,健康对照组12h、24h、48hCD86表达水平较患者组显著上升（P〈0．05）。两组之间CD1a、HLA—DR表达差异无统计学意义。二组IL-10及IL-120h表达水平差异无统计学意义（P〉0．（15）,患者组IL-10表达24h及48h与0h相比明显上升（P〈0．05）。而对照组12h、24h、48hIL-10表达水平没有明显上升。与之相反,患者组12h、24h、48hIL-12表达与0h相比表达水平没有明显上升,对照组在12hIL-12表达水平与0h相比差异有统计学意义（P〈0．05）,24h、48hIL-12表达水平继续升高（P〈0．05）。结论慢性HBV感染者mDC受polyI：C刺激后IFN-β表达异常,协同刺激因子CD86表达低下,可能造成宿主对HBV感染的免疫清除障碍,导致疾病慢性化。