缺氧诱导因子1α在非离子造影剂诱导的肾小管上皮细胞凋亡中的作用及其机制

目的：应用缺氧诱导因子1α（hypoxia—induciblefactor-1α，HIF-1d）诱导剂氯化钴上调HIF-1α水平，观察其对非离子造影剂碘必乐诱导的HK-2细胞凋亡的作用和机制。方法：体外培养的HK-2细胞，分为阴性对照组、碘必乐阳性对照组（296mgl／ml，12h）、不同剂量及作用时间的氯化钴预处理与碘必乐共同作用组（氯化钻浓度为5、25、50、100μmol／L，分别预处理0h、1h、2h、4h、6h、12h）。通过流式细胞仪测定细胞凋亡率，Hoechst33258染色观察细胞捌1’：的形态学变化，WesternBlot方法榆测HIF-1α、Caspase-3和凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平。结果：（1）流式细胞仪检测结果表明，50μmol／L氯化钴预处理4h、6h和12h点与阳性对照组相比细胞凋亡率明显降低（10．95％，8．65％，8．61％vs22．06％，P〈0．05），其中6h、12h点较4h点对细胞凋亡的抑制作用更强（P〈0．05），而6h和12h点之间差异无统计学意义（P〉0．05）。100μmol／L与50μmol／L氯化钴预处理相同时间（6h、12h）细胞凋亡率差异无统计学意义（P〉0．05）；（2）Hoechst33258染色结果发现，与阳性对照组相比，50μmol／L氯化钴预处理6h和12h凋亡细胞明显减少，其它时间点与阳性对照组差异无统计学意义。（3）WesternBlot检测方法表明，50μmol／L氯化钻预处理1h以上即可引起HIF-1α表达增高，6h点表达最高（0．373±0．032），12h点较前下降（0．285±0．048）。与阳性对照组相比，50μmol／L氯化钴预处理4h、6h、12h，细胞内Caspase-3水平明显降低（P〈0．05，0．346±0．037，0．294±0．062，0．179±0．051vs0．501±0．039）。Bel-2表达水平明显增加（P〈0．05，0．275±0.052，0．324±0．046，0．337±0．039vs0．099±0．025）。结论：HIF-1α对非离子造影剂碘必乐诱导的人近端肾小管卜皮细胞凋亡有明显的抑制作用，其作用机制可能与下调Caspase-3和上调抗凋亡蛋白Bcl-2有关。     

丙型肝炎病毒NS4B对p53表达及细胞凋亡的影响

目的研究丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白4B（NS4B）对肝细胞内抑癌基因野生型p53表达及细胞凋亡的影响。方法通过脂质体介导法,将空白载体PCXN2、HCVNS4B重组质粒PCXN2-NS4B、野生型p53表达质粒分别或共引入Chang肝细胞内,并以C418筛选作稳定传代,lit—PCR法鉴定质粒成功转染入肝细胞内,原位杂交法分别检测载体组、NS4B组、p53组、NS4B—p53组的p53mRNA表达情况;TUNEL法流式细胞术观察四组的肝细胞凋亡率。结果与载体组比较,NS4B组未促进或抑制p53mRNA表达（P〉0．05）;与p53组比较,NS4B—p53组的正常肝细胞p53mRNA降低（P〈0．01）;载体组、NS4B组、p53组、NS4B—053组的细胞凋亡率分别为（17．02±1．24）％、（11．94±2．24）％、（25．84±3．49）％、（18．34±1．55）％。结论NS4B可抑制p53基因表达及肝细胞凋亡,可能通过抑制p53表达抑制细胞凋亡。     

大鼠肝细胞与睾丸支持细胞混合共微囊化的体外功能研究

目的 观察大鼠肝细胞与睾丸支持细胞混合共微囊化对肝细胞生物学活性的支持作用。方法利用微囊发生器制备含肝细胞、睾丸支持细胞及两者混合细胞的微囊，根据微囊内包裹细胞种类的不同，分为微囊化肝细胞组，微囊化睾丸支持细胞组，肝细胞、睾丸支持细胞分别微囊后共同培养组和肝细胞、睾丸支持细胞混合共微囊组。观察囊内细胞形态，体外培养测定培养液中Alb与尿素分泌，判断各组囊内肝细胞活性和功能。样本比较采用重复测量数据的多元方差分析。结果体外培养96h时，光学显微镜下见微囊呈球形，表面光滑，细胞均匀、散在分布于微囊内，囊内肝细胞、睾丸支持细胞呈圆形，未贴壁。微囊化睾丸支持细胞组培养上清液中无法测及Alb与尿素。与微囊化肝细胞组相比，肝细胞、睾丸支持细胞分别微囊后共同培养组与肝细胞、睾丸支持细胞混合共微囊组肝细胞的存活时间延长，培养上清液中Alb（F=217．56，P〈0．01）和尿素（F=232．72，P〈0．01）明显增加。混合细胞共微囊组于培养第7天Alb与尿素含量最高，分别为（2．80±0．11）g／L、（1．92±0．10）μmol／L，而其他两组均于培养第3天Alb与尿素含量达到最高，分别为（2．48±0．08）g／L、（1．47±0．08）μmol／L和（2．27±0．10）g／L、（1．37±0．05）μmol／L。相对于混合细胞共微囊组，肝细胞、睾丸支持细胞分别微囊后共同培养组在培养中后期Alb、尿素含量下降趋势明显。结论肝细胞与睾丸支持细胞混合共微囊化能明显延长囊内肝细胞的寿命，维持肝细胞形态和功能。     

非小细胞肺癌组织中核因子κB的活性及其与肿瘤细胞增殖的关系

目的研究非小细胞肺癌组织中核因子κB（nuclear Factor-κB，NF—κB）的活性及其与细胞增殖、自发性细胞凋亡的关系。方法2006年5至10月收集30例非小细胞肺癌组织标本及15例肺癌患者癌旁5cm肺组织标本。NF—κB活性通过凝胶电泳迁移率改变试验（EMSA）检测，用RT—PCR和Western blot方法检测CyclinD1含量，免疫组织化学染色法检测增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白含量，TUNEL法检测细胞凋亡。结果癌旁肺组织、鳞癌组织、腺癌组织中NF—κB活性（吸光度，A值）分别为24826±3724、28028±4204、35425±5317，三组比较差异有统计学意义（F=78．96，P〈0．01）。鳞癌组织、腺癌组织中NF—κB活性高于癌旁肺组织中NF—κB活性，腺癌组织中NF—κB活性高于鳞癌组织中NF—κB活性。健康肺组织、鳞癌组织、腺癌组织中CyclinD1 mRNA表达量分别为2．04±0．24、2．91±0．37、4．13±0．36，三组比较差异有统计学意义（F=62．43，P〈0．01）。癌旁肺组织、鳞癌组织、腺癌组织中Cyclin D1蛋白表达量分别为0．31±0．06、0．43±0．07、0．58±0．08，三组比较差异有统计学意义（F=89．24，P〈0．01）。癌旁肺组织、鳞癌组织、腺癌组织中PCNA蛋白表达量分别为0．32±0．09、0．42±0．10、0．54±0．16，三组比较差异明显。癌旁肺组织、鳞癌组织、腺癌组织中凋亡指数分别为（2．58±0．39）％、（2．27±0．34）％、（2．92±0．59）％，三组比较无明显差异。鳞癌组织中NF—κB活性与CyclinD1 mRNA、CyclinD1蛋白、PCNA蛋白均呈正相关（r值分别为0．51、0．54和0．60，P均〈0．05）；腺癌组织中NF—κB活性与CyclinD1mRNA、CyclinD1蛋白、PCNA蛋白均呈正相关（r值分别为0．60、0．64和0．68，P均〈0．05）；鳞癌、腺癌组织中NF—κB活性与细胞凋亡指数无相关关系。结论在非小细胞肺癌组织中NF—κB活性增高。非小细胞肺癌组织中NF—κB的异常活化可能与细胞增殖有关，但不影响自发性细胞凋亡。     

骨髓间充质干细胞对持续缺氧心肌保护作用的研究

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）保护持续缺氧心肌的作用及可能机制。方法体外培养成年大鼠MSCs和乳鼠心肌细胞,在培养的乳鼠心肌细胞加入MSCs或其条件培养液,在无氧（95%N2＋5%CO2）条件下共培养24、48和72h,采用Hoechst33258染色细胞核,计算凋亡细胞百分率;采用蛋白质免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的变化。结果缺氧可以诱导心肌细胞凋亡,培养24、48和72h凋亡率分别为（26.5±6.1）%,（20.2±6.4）%和（51.6±2.4）%,与MSCs共培养,心肌细胞凋亡率显著减低,分别为（7.3±4.7）%,（4.3±2.4）%和（15.1±5.4）%（P〈0.05）;与其条件培养液共培养24和48h,心肌细胞凋亡率与对照组比较无明显降低,分别为（23.9±4.1）%和（20.7±2.5）%（P〉0.05）,共培养72h,心肌细胞凋亡率为（24.2±4.2）%（P〈0.05）,显著低于对照组。蛋白质免疫印迹显示凋亡时心肌表达Bax水平较高,与MSCs或其条件培养液共培养72h后,Bax表达水平呈不同程度降低,与心肌细胞凋亡发生率减低一致,Bcl-2无明显变化。结论MSCs在体外对持续缺氧心肌细胞具有一定程度的抗凋亡作用,其机制可能通过细胞间直接接触和旁分泌细胞因子,影响Bcl-2家族部分蛋白在心肌细胞的表达。     

黄连素对大鼠结肠上皮隐窝细胞基底膜钾通道的影响

目的研究黄连素对结肠上皮隐窝细胞基底膜钙依赖钾通道[IK（Ca）]和环磷酸腺苷（cAMP）依赖钾通道[IK（cAMP）]的影响，探讨其治疗分泌性腹泻的机制。方法用乙二胺四乙酸（EDTA）溶液分离结肠上皮隐窝细胞，运用EPC10膜片钳放大器测量全细胞模式下50、100、500μmol／L黄连素对结肠上皮细胞基底膜IK（Ca）和IK（cAMP）的影响，并设PSS对照组。结果50、100、500μmol／L黄连素可抑制大鼠结肠上皮隐窝细胞基底膜IK（Ca）和IK（cAMP）（P值均〈0．05），当阶跃刺激为＋80mV时，其IK（Ca）分别为对照组的（71．43±3．61）％、（54．56±5．13）％、（38．66±3．85）％（P〈0．05）；其IK（cAMP）分别为对照组的（78．55±5．72）％、（60．42±6．33）％、（43．78±6．47）％（P〈0．05）。结论黄连素能抑制大鼠结肠上皮细胞基底膜IK（Ca）和IK（cAMP）的开放，这可能是其治疗分泌性腹泻的机制之一。     

肺癌抑癌基因1对HepG2细胞生长的抑制效应

目的探讨肺癌抑癌基因1（TSLC1）对人肝癌细胞株HepG2生长的影响。方法RT-PCR法制备TSLC1全长cDNA并克隆至真核表达载体pCI-neo，稳定转染至肝癌细胞系HepG2中。以转染空质粒pCI-neo的HepG2细胞为对照组，野生型HepG2细胞为空白组，显微镜下观察细胞形态，MTT法检测细胞增殖，FACSort流式细胞仪检测细胞周期，AnnexinV／PI双染法检测细胞凋亡情况。结果实验建立了高表达TSLCI蛋白的稳定细胞株。实验组细胞呈多角形，聚集成团，细胞之间的黏附非常紧密，对照组和空白组细胞呈梭形，细胞与细胞之间较疏散。与对照组和空白组相比，实验组细胞株细胞生长速度减慢，增殖受到明显抑制，G0／G1期细胞为63．66%±3．83％，高于对照组（47．45％±0．91％）和空白组（54．47％±0．96％）；S期细胞数为22．90％±6．04％，低于对照组（36．58％±0．61％）和空白组（33．61％±2．99％），P〈0．01，实验组细胞周期发生了G0/G1期阻滞。实验组细胞早期凋亡率和晚期凋亡率分别为17．09%±0．20％和16．11％±0．40％，与对照组和空白组细胞相比均明显升高（P〈0．01）。结论TSLC1基因明显抑制HepG2细胞生长，并诱导细胞发生凋亡。     

骨形成蛋白在低氧性肺动脉高压发病中的作用

目的观察低氧性肺动脉高压大鼠肺组织中骨形成蛋白2（BMP-2）的变化及BMP在低氧诱导内皮细胞凋亡中的作用，探讨BMP在低氧性肺动脉高压发病中的作用。方法将20只雄性Wistar大鼠随机分为2组，低氧组经常压低氧处理3周，建立大鼠低氧性肺动脉高压模型，采用免疫组织化学染色法观察大鼠肺组织中BMP-2的表达。用图像分析技术检测大鼠肺小动脉形态改变及BMP-2表达强度的变化。建立人脐静脉内皮细胞（HUVEC）低氧培养模型，加入BMP阻断剂Noggin，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果低氧3周后，大鼠平均肺动脉压（mPAP）为（29．5±0．9）mmHg（1mmHg=0．133kPa），与对照组的（16．3±0．5）mmHg比较明显增加；低氧大鼠肺小动脉管壁增厚、管腔狭窄，表现为管壁厚度占外径的百分比（WT％）和管壁面积占血管总面积的百分比（WA％）明显升高，分别为（27±7）％和（80±8）％，对照组分别为（16±5）％和（54±11）％，两组相比差异有统计学意义（P〈0．01）；低氧组肺小动脉壁BMP-2积分吸光度值（M）为13463±5755，对照组为6124±1199，两组相比差异有统计学意义（P〈0．01），且与WT％和WA％呈明显正相关（r值分别为0．744和0．693，P〈0．01）。低氧诱导内皮细胞凋亡增加，低氧24h时的细胞凋亡率为（14．23±1．01）％，48h时为（25．21±8．58）％；低氧前预先加入Noggin，低氧24h时细胞凋亡率为（11．91±0．57）％，48h时为（15．01±0．15）％，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论慢性低氧时BMP-2表达增多；低氧诱导内皮细胞凋亡，BMP阻断剂可抑制低氧诱导的内皮细胞凋亡；BMP在低氧性肺动脉高压发病过程中起一定的作用。     

虫草菌丝对非酒精性脂肪肝病大鼠肝细胞凋亡的作用及其相关机制

目的（1）证实肝细胞凋亡的异常增多存在于非酒精性脂肪性肝病中。（2）观察虫草菌丝对肝细胞凋亡异常增多的影响，并探讨可能的分子机制。方法通过高脂饮食建立大鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的模型，同时设立正常饮食对照组，病理对照组（NASH组），虫草菌丝干预组（CS组）。肝组织切片HE染色观察肝脏病理改变；检测肝组织超氧化物歧化酶（SOD）活性；TUNEL检测肝组织肝细胞凋亡情况；免疫组织化学染色观察肝组织Bax、Bcl-2、Caspase-3、NF-κB P65蛋白表达情况。结果（1）与正常对照组相比，病理对照组大鼠肝组织广泛弥漫肝细胞脂肪变性，炎性细胞浸润、坏死、局部有纤维组织增生；肝脏SOD活性显著降低（P〈0．01）；TUNEL法检测肝细胞凋亡显著增多（P〈0．01）；免疫组化染色显示Bax、Caspase-3蛋白表达增加（P〈0．01），而Bcl-2无显著变化（P〉0．05）；（2）与病理对照组相比，虫草菌丝组大鼠肝组织有广泛肝细胞脂肪变性，炎性细胞浸润，可见灶性及点状坏死，未见纤维组织增生；肝组织SOD活性高于病理对照组（P〈0．05）；TUNEL法检测凋亡的肝细胞显著减少（P〈0．01）；免疫组化染色显示Bax、Caspase-3蛋白表达也明显降低（分别为P〈0．05、P〈0．01），而Bcl-2、NF-κB P65蛋白表达增加（P〈0．01）。结论（1）NASH时肝细胞凋亡异常增多。（2）虫草菌丝可以通过增加超氧化物歧化酶（SOD）活性来减少活性氧含量，降低Bax表达，增加Bcl-2表达和活化NF-κB P65减轻NAFLD中肝细胞凋亡从而在一定程度上具有保护肝脏功能的作用，对延缓或阻止脂肪肝病变的进展起到一定的作用。     

丙戊酸钠对多发性骨髓瘤细胞株KM3细胞增殖及其VEGF受体表达的影响

目的：研究丙戊酸钠（VPA）对多发性骨髓瘤细胞株KM3细胞增殖和凋亡的影响,探讨其抗多发性骨髓瘤细胞的分子生物学机制。方法：采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测凋亡率,RT—PCR检测KM3细胞VEGFRmRNA的表达;采用免疫细胞化学法观察KM3细胞VEGFR、ac—H4蛋白的表达。结果：VPA可明显抑制KM3细胞增殖,且具有时间剂量依赖性（P〈0．05）;不同浓度VPA处理48h可以明显诱导细胞凋亡,具有剂量依赖性（P〈0．05）,VPA（0．5、1．0、2．0、4．0mmol／L）诱导总凋亡率分别为（11．77±4．64）％、（22．13±1．20）％、（23．95±2．57）％和（42．72±4．61）％;RT—PCR结果显示,KM3细胞仅表达VEGFR-1（flt—1）,且VPA能在mRNA水平抑制VEGFR-1的表达;免疫细胞化学结果显示,VPA（4mmol／L）作用48h后,KM3细胞中acH4吸光度值明显增加而VEGFR-1的吸光度明显降低（P〈0．05）。结论：VPA通过增加组蛋白乙酰化程度,下调骨髓瘤细胞表面VEGFR的表达,对KM3细胞的增殖起抑制作用。     

肿瘤坏死因子α对肝细胞脂肪变性模型裂解激活蛋白表达的影响

目的探讨TNFα对油酸诱导的脂肪变性肝细胞模型固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白（SCAP）的表达及TG含量的影响。方法以正常肝细胞株L02进行细胞培养,用油酸诱导建立肝细胞脂肪变性模型,在对照组（C组）及模型组（F组）中加入TNFα（C1组和F1组）与抗TNFα抗体（C2组和F2组）分组进行培养,采用RT PCR法检测SCAP mRNA的表达,Western blot检测SCAP蛋白的表达,采用油红O染色观察细胞内脂滴的变化,并检测细胞内甘油三酯含量。结果TNFα作用组SCAP mRNA的表达上调,C1组比C组上调67%,F1组比F组上调55%,F-212.98,P〈0.01,差异有统计学意义。TNFα作用组SCAP蛋白的表达也上调,C1组比C组上调45%,F1组比F组上调95%,F-104.3,P〈0.01,差异有统计学意义。而使用抗TNFα抗体作用后表达显著下调,细胞内TG含量,对照组为（2.02±0.67）mg/10^7细胞,模型组为（7.79±1.35）mg/10^7细胞,模型组TNFα组为（13.36±1.99）mg/10^7细胞,F-82.94,P〈0.01,TNFα作用组较对照组脂变细胞数量增多,差异有统计学意义,而使用抗TNFα抗体作用后脂变细胞数量减少,细胞内TG含量显著下降。结论TNFα上调L02肝细胞SCAP的表达,促进细胞内TG的合成,可能参与了肝细胞脂肪变性的形成。     

Free fatty acids sensitise hepatocytes to TRAIL mediated cytotoxicity

BACKGROUND: Elevated circulating free fatty acids (FFA) contribute to the development of hepatic steatosis and promote hepatocyte apoptosis by incompletely defined mechanisms. Although the death ligand TRAIL has been implicated in a variety of pathological liver diseases, the role of TRAIL in mediating apoptosis of FFA induced steatotic hepatocytes is unknown. AIM: We examined TRAIL cytotoxicity in an in vitro model of hepatocyte steatosis induced by FFA. METHODS: Hepatocytes (Huh 7 cells, HepG2 cells, and primary rat hepatocytes) were rendered steatotic by incubation with oleic acid. Apoptosis was assessed morphologically and biochemically by caspase activity. TRAIL receptor regulation was examined using immunoblot analysis and siRNA for targeted knockdown. c-jun N-terminal kinase (JNK) inhibition was attained with SP600125. RESULTS: Oleic acid sensitised the cells to TRAIL but not TNF-alpha cytotoxicity. FFA sensitisation to TRAIL occurred at much lower concentrations than required for FFA mediated sensitisation to Fas, or FFA induced lipoapoptosis. Oleic acid treatment led to upregulation of the cognate TRAIL receptor death receptor 5 (DR5) but not death receptor 4 (DR4). The upregulation of DR5 was JNK dependent. siRNA targeted knockdown of either DR5 or DR4 demonstrated that DR5 was responsible for FFA sensitisation to TRAIL killing. DR5 expression was enhanced in steatotic human liver samples. CONCLUSION: Our results suggest that FFA induced hepatocyte steatosis sensitises to TRAIL by a DR5 mediated JNK dependent mechanism.     

三七总皂甙对脂肪变性L02肝细胞甘油三酯含量及解耦联蛋白2mRNA表达的影响

目的 观察三七总皂甙(PNS)对脂肪变性L02肝细胞内甘油三酯(TG)含量及解耦联蛋白2(UCP2)mRNA表达的影响及机制.方法 采用50%小牛血清诱导L02肝细胞48 h建立肝细胞脂肪变性模型,采用MTT法测定PNS作用于脂肪变性肝细胞的适宜浓度,随后将其分为5组,模型组、自然恢复组、PNS低剂量组(10 μg/ml)、PNS高剂量组(50 μg/ml),并设正常组.药物作用24 h后,油红O染色观察肝细胞内脂滴变化,全自动生化仪检测肝细胞内TG含量,运用RT-PCR法检测肝细胞内UCP2 mRNA的表达.结果 与正常组比较,油红O染色示模型组肝细胞内橘红色脂滴明显增加,并出现脂滴融合现象,模型组TG含量明显升高(P＜0.01).PNS治疗24 h后,PNS各治疗组与自然恢复组比较,肝细胞内TG含量均明显减少(P＜0.05),以低剂量组下降更为显著(P＜0.01);油红O染色显示,PNS低剂量组肝细胞内脂滴数减少最为明显.与正常组比较,模型组肝细胞UCP2 mRNA的表达明显上调(P＜0.01);与自然恢复组比较,PNS各治疗组肝细胞UCP2 mRNA的表达量均有下降,以高剂量组下降具有显著性差异(P＜0.05).结论 PNS能显著降低脂肪变性肝细胞内TG含量,减轻肝细胞脂肪变性.UCP2 mRNA的高表达与肝细胞脂肪蓄积密切相关,PNS可能是通过下调UCP2 mRNA的表达来改善肝细胞的脂肪变性.     

phosphatase and tensin homolog is a differential diagnostic marker between nonalcoholic and alcoholic fatty liver disease

AIM: To investigate the protein expression of phosphatase and tensin homolog(PTEN) in human liver biopsies of patients with alcoholic and non-alcoholic liver disease.METHODS: PTEN protein expression was assessed by immunohistochemistry in formalin-fixed, paraffinembedded liver sections of patients with non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)(n = 44) or alcoholic liver disease(ALD)(n = 25). Liver resections obtained from 3 healthy subjects candidate for partial liver donation served as controls. Histological evaluations were performed by two experienced pathologists, and diagnoses established based on international criteria. The intensity of the PTEN staining in nuclei was compared between steatotic and non-steatotic areas of each liver fragment analyzed. For each liver specimen, the antibody-stained sections were examined and scored blindly by three independent observers, who were unaware of the patients' clinical history.RESULTS: In healthy individuals, PTEN immunostaining was intense in both the cytoplasm and nuclei of all hepatocytes. However, PTEN was strongly downregulated in both the nucleus and the cytoplasm of hepatocytes from steatotic areas in patients with NAFLD, independently of the disease stage. In contrast, no changes in PTEN protein expression were observed in patients with ALD, regardless of the presence of steatosis or the stage of the disease. The degree of PTEN downregulation in hepatocytes of patients with NAFLD correlated with the percentage of steatosis(r = 0.3061, P = 0.0459) and the BMI(r = 0.4268, P = 0.0043). Hovewer, in patients with ALD, PTEN expression was not correlated with the percentage of steatosis with or without obesity as a confounding factor(P = 0.5574). Finally, PTEN expression level in steatotic areas of ALD patients was significantly different from that seen in steatotic areas of NAFLD patients(P 0.0001).CONCLUSION: PTEN protein expression is downregulated early in NAFLD, but not in ALD. PTEN immunohistochemical detection could help in the differential diagnosis of NAFLD and ALD.     

抵抗素对脂肪变性肝细胞核因子κ B和肿瘤坏死因子α表达的影响

目的 探讨抵抗素(resistin)对脂肪变性肝细胞脂质代谢及核因子κB (NF-κ B)、肿瘤坏死因子(TNF)α表达的影响. 方法 选用软脂酸诱导L02细胞脂肪变性模拟非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)体外模型.分C组(正常对照组),P组(模型组:软脂酸20μg/ml)及分别加入重组人抵抗素50μg/L的CR组和PR组.各组给予相应处理72 h后,观察细胞的脂肪变并测定细胞培养上清液中甘油三酯(TG)、ALT、AST及γ谷氨酰转移酶(GGT)的浓度;采用半定量RT-PCR及Western blot法检测细胞胰岛素受体底物2(IRS-2)、NF-κB、TNFα的基因及蛋白表达水平.根据资料不同应用方差分析或t检验进行统计学分析,P＜ 0.05为差异具有统计学意义. 结果 P组、CR组及PR组细胞培养上清液中TG、ALT、AST、GGT的浓度明显高于C组.分别与C组比较,P组、CR组及PR组NF-κ B mRNA相对表达量0.54±0.04、0.60±0.04及1.00±0.06,与C组的0.10±0.01比较,t值分别为17.64,22.03,26.06;TNFαmRNA相对表达量0.58±0.04、0.61±0.06及1.05±0.09,与C组的0.33±0.06比较,t值分别为5.67,5.38,11.64,相对表达量明显升高,而IRS-2 mRNA (t值分别为8.19,9.23,20.93)明显降低,且P值均＜0.05,差异有统计学意义.P组与CR组间比较,t值分别为1.75,0.58,2.14,P值均＞0.05,差异无统计学意义.蛋白质表达变化趋势与mRNA变化趋势相一致.结论 抵抗素可能通过NF-κ B依赖途径对肝细胞脂肪变性胰岛素抵抗发挥促炎作用,从而促进NAFLD的发生与发展.     

Trimetazidine inhibits mitochondrial permeability transition pore opening and prevents lethal ischemia-reperfusion injury

Trimetazidine (TMZ) affects mitochondrial function during ischemia. Mitochondrial permeability transition is a pivotal event in cardiomyocyte death following acute ischemia. The aim of the present study was to determine whether the anti-ischemic agent TMZ might modulate mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening and limit lethal ischemia-reperfusion injury. Anesthetized NZW rabbits underwent 30 min of coronary artery occlusion followed by 4 hours of reperfusion. Prior to this, they underwent either no intervention (control, C), ischemic preconditioning (PC), or an IV injection of 5 mg kg(-1) TMZ 10 min before ischemia (TMZ). Additional rabbits (Sham group) underwent no ischemia/reperfusion throughout the experiment. Infarct size was assessed by triphenyltetrazolium staining, and apoptosis via measurement of caspase 3 activity. Ca(2+)-induced mPTP opening was assessed in mitochondria isolated from ischemic myocardium. TMZ and PC significantly reduced infarct size that averaged 34 +/- 4% and 21 +/- 4% of the risk region respectively, versus 63 +/- 6% in controls (P<0.005). Caspase 3 activity was reduced in both TMZ and PC groups: 37 +/- 11 and 29 +/- 7 respectively, versus 68 +/- 9 nmol min(-1) mg(-1) mitochondrial protein in controls (P=0.01 versus TMZ and PC). In controls, Ca(2+) load required for mPTP opening averaged 11 +/- 4 microM mg(-1) mitochondrial protein versus 116 +/- 6 in shams (P<0.0001). Pre-treatment by TMZ or PC attenuated this, with Ca(2+) loads averaging 45 +/- 4 and 46 +/- 4 microM mg(-1) mitochondrial proteins, respectively (P<0.005 versus C). These data suggest that TMZ inhibits mPTP opening and protects the rabbit heart from prolonged ischemia-reperfusion injury.     

游离脂肪酸诱导肝细胞脂肪变模型中锌指蛋白A20的表达及其作用机制

背景:肝内脂肪酸蓄积是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)发生的基础,炎症是促其发展的关键。锌指蛋白A20可通过抑制NF-κB信号通路而发挥抗炎功能,但其对NAFLD作用的研究未见。姜黄素具有明确的抗炎作用。目的:探讨游离脂肪酸(FFAs)诱导的肝细胞脂肪变模型中A20的表达及其对NAFLD的作用机制。方法:以不同浓度混合FFAs(油酸:软脂酸=2:1)诱导HepG2细胞脂肪变模型,MTS法测定细胞活力,行油红O染色鉴定,筛选出最佳造模浓度。蛋白质印迹法检测A20表达。以不同浓度姜黄素干预肝细胞脂肪变性模型,采用蛋白质印迹法检测A20表达,ELISA法检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β含量。结果:成功建立HepG2肝细胞脂肪变模型,选择0.25 mmol/L FFAs作为最佳造模浓度。随着FFAs浓度增高,A20表达在6 h呈增加趋势,而12 h、24 h时A20表达呈先减少后增加的趋势,0.5 mmol/L是分界点。与0.25 mmol/L FFAs组相比,20μmol/L姜黄素干预可显著抑制A20表达,细胞上清中TNF-α、IL-1β含量显著减少(P<0.05)。结论:锌指蛋白A20可能通过抑制NF-κB信号通路激活来抑制炎症的发生,从而发挥保护肝细胞的作用,为防治NAFLD提供了可能的有效作用靶点。     

脂联素对脂肪变肝细胞内C反应蛋白表达的影响及作用机制

目的：探讨脂联素对肝细胞内C反应蛋白（CRP）的影响及可能的作用机制。方法给予 HL-7702细胞不同浓度和比例的油酸软脂酸混合液干预不同时间后,CCK-8法测定细胞活力,Nile red染色荧光显微镜拍照,测定荧光强度。实时定量 PCR检测细胞内CRP、CREBH、BIP和CHOP mRNA表达水平变化。Western印迹检测细胞核内活化的CREBH蛋白含量。根据是否加入脂联素分组,每组加入不同比例的脂肪酸干预24 h后,实时定量 PCR检测 CRP、CREBH、BIP和CHOP的表达水平变化。结果相比于正常组,混合脂肪酸干预12 h后,仅OP03（1．0 mmol）组CRP表达升高（P＜0．05）,24 h后,OP12（1．0 mmol）、OP03（1．0 mmol）、OP03（0．5 mmol）组CRP表达均升高（P＜0．05）。混合脂肪酸干预24 h后,CREBH、BIP和CHOP mRNA均有不同程度的增高,OP12（1．0 mmol）、OP03（1．0 mmol）组核内活化CREBH蛋白增加。加入脂联素后,各组CRP、CREBH、BIP和CHOP表达水平下降（P＜0．05）。结论软脂酸可上调肝细胞CRP表达水平,其机制可能与活化的CREBH蛋白有关。脂联素可能通过抑制CREBH蛋白相关的炎症通路而下调CRP表达。     

Extent and features of liver steatosis in vitro pave the way to endothelial dysfunction without physical cell-to-cell contact

Background and aimsSeveral chronic multifactorial diseases originate from energy unbalance between food intake and body energy expenditure, including non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), diabetes, and cardiovascular disorders. Vascular endothelium plays a central role in body homeostasis, and NAFLD is often associated with endothelial dysfunction (ED), the first step in atherosclerosis. Both sugars and fatty acids (FAs) are fuel sources for energy production, but their excess leads to liver steatosis which may trigger ED through a network of mechanisms which need to be clarified. Here, we investigated the crosstalk pathways between in vitro cultured steatotic hepatocytes (FaO) and endothelial cells (HECV) being mediated by soluble factors.Methods and resultsWe employed the conditioned medium approach to test how different extent and features of hepatic steatosis distinctively affect endothelium leading to ED. The steatogenic media collected from steatotic hepatocytes were characterized by high triglyceride content and led to lipid accumulation and fat-dependent dysfunction in HECV cells. We found a parallelism between (i) extent of hepatocyte steatosis and level of lipid accumulation in HECV cells; (ii) type of hepatocyte steatosis (with macro- or microvesicular LDs) and extent of oxidative stress, lipid peroxidation, nitric oxide release and expression of ED markers in HECV cells.ConclusionsThe present findings seem to suggest that, in addition to triglycerides, other soluble mediators should be released by steatotic hepatocytes and may influence lipid accumulation and function of HECV cells. Further studies need to depict the exact profile of soluble factors involved in steatotic hepatocyte-endothelium crosstalk.